Génération d’un modèle de maladie pulmonaire Obstructive chronique chez les souris par exposition à l’Ozone répétées
25 août 2017
Cette étude décrit la génération réussie d’un nouveau modèle animal de maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) par une exposition répétée souris à des concentrations élevées d’ozone.
L’objectif global de cette expérience est d’induire une bronchopneumopathie chronique obstructive ou C-O-P-D via l’exposition à l’ozone, O-E chez la souris. Ce nouveau modèle OE peut se produire dans la caractérisation du mécanisme sous-jacent de la BPCO et il peut être utilisé pour le criblage de nouveaux médicaments. Les principaux avantages de ce modèle OE sont qu’il récapitule les processus pathologiques des patients atteints de BPCO.
Il peut être généré en seulement six à huit semaines. Weijaian Sang, un chercheur de notre groupe, fera une démonstration de la procédure avec moi. Pour générer de l’ozone, utilisez un générateur électrique et un petit souffleur d’air pour souffler l’air en scellant la boîte en plexiglas à travers un tuyau de ventilation connecté à l’intérieur et à l’extérieur de la boîte à l’aide d’une sonde d’ozone pour surveiller la concentration d’ozone dans la boîte.
Lorsque la concentration d’ozone atteint 2,5 parties par million, placez les souris dans la boîte pendant 3 heures. À la fin de la semaine 7, imagez les animaux traités à l’ozone par micro-tomodensitométrie selon les protocoles standards. Pour tester les changements induits par l’ozone et les capacités fonctionnelles telles que la fatigue pulmonaire, réchauffez d’abord les souris à une vitesse de 10 mètres par minute sur un tapis roulant.
Après 5 minutes, augmentez la vitesse à 15 mètres par minute pendant une période de 10 minutes. Continuez à augmenter la vitesse de cinq mètres par minute toutes les 30 minutes jusqu’à ce que les souris ne puissent plus courir. Enregistrement de la distance de course totale et du temps de course de chaque animal sous forme de distance de fatigue et de temps de fatigue, respectivement.
Pour mesurer la fonction pulmonaire des animaux exposés à l’ozone, placez une souris anesthésiée dans un pléthysmographe corporel connecté à un ventilateur contrôlé par ordinateur. Utilisez la ventilation à pression contrôlée pour imposer une fréquence respiratoire moyenne de 150 respirations par minute à l’animal anesthésié jusqu’à ce qu’une respiration régulière et une expiration complète à chaque cycle respiratoire soient obtenues. Enregistrez ensuite le volume expiratoire forcé dans les premières 25, 50 et 75 millisecondes de l’expiration, en rejetant toute manœuvre sous-optimale.
Après une anesthésie terminale, utilisez une sonde endotrachéale d’un millimètre de diamètre pour laver les animaux deux fois avec un millilitre de PBS par lavage. Regrouper les aloquats de lavage récupérés de chaque animal pour la centrifugation et recueillir les surnageants sur de l’azote liquide. Remettez les granulés en suspension dans du PPS frais pour le comptage et équipez deux supports par souris d’une lame de microscope, d’une carte filtrante et d’un entonnoir.
Ajoutez environ 100 à 125 microlitres de cellules remises en suspension dans chaque entonnoir. Chargez les supports sur une centrifugeuse cyto et faites tourner les cellules sur les lames. Appliquez ensuite la solution de coloration appropriée sur les cellules selon les instructions du fabricant et comptez 200 cellules par souris sous un grossissement de 400 fois.
Pour le prélèvement de sang cardiaque, prélever environ 500 microlitres de sang sur les animaux exposés à l’ozone par ponction cardiaque. Et ajoutez le sang dans des tubes de 1,5 millilitre sur de la glace. Après 30 minutes sur la glace, centrifugez les échantillons de sang et transférez les surnageants sériques dans de nouveaux tubes pour les stocker sur de l’azote liquide.
Les échantillons peuvent ensuite être décongelés pour l’évaluation des niveaux d’expression des cytokines sériques par ELISA selon les protocoles standard. Pour l’analyse morphométrique pulmonaire, placez la première souris en position couchée après le prélèvement cardiaque. Ensuite, ouvrez la cavité thoracique et disséquez le platysma et les muscles trachéaux antérieurs pour accéder aux anneaux trachéaux.
Prélever les poumons et la trachée sans séparer le cœur des poumons. Ensuite, utilisez un tube en polyéthylène PE90 pour connecter un cathéter endotrachéal à une seringue contenant 4 % de formaldéhyde de puissance et gonflez complètement les poumons avec environ 200 microlitres de paraformaldéhyde. Ensuite, placez les poumons dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de formaldéhyde frais de quatre pour cent pendant au moins quatre heures.
D’après la tomodensitométrie, les souris exposées à l’ozone présentent un volume pulmonaire total et un pourcentage de zone de faible atténuation significativement plus élevés que les animaux témoins exposés à l’air ambiant. Le phénotype de l’emphysème est également mis en évidence par l’élargissement des alvéoles pulmonaires et l’augmentation des intersections linéaires moyennes. L’évaluation de la fonction pulmonaire par pléthysmographe démontre que tous les paramètres qui diminuent chez les souris exposées à l’ozone sont compatibles avec les défauts fonctionnels pulmonaires typiques observés chez les patients atteints de bronchopneumopathie chronique obstructive.
De plus, l’exposition à l’ozone diminue considérablement le temps de fatigue et la distance de fatigue dans les tests de tolérance à l’effort. Les animaux traités à l’ozone présentent également une augmentation significative des cellules inflammatoires, y compris les macrophages et les neutrophiles, ainsi qu’une diminution significative de l’IL-10 et une augmentation de l’IL-1 bêta et du TNF alpha, démontrant que le modèle d’exposition à l’ozone récapitule les symptômes similaires de la bronchopneumopathie chronique obstructive humaine. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies pulmonaires pour explorer les mécanismes sous-jacents de la BPCO.
N’oubliez pas que travailler avec le paraformaldéhyde peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants, de lunettes de sécurité et l’utilisation de la solution à l’intérieur de la hotte doivent toujours être prises lors de l’utilisation de ce réactif.
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Aperçu
Cette étude décrit la génération réussie d'un nouveau modèle animal de maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) par une exposition répétée de souris à de fortes concentrations d'ozone. Ce modèle peut être utilisé pour caractériser les mécanismes sous-jacents de la MPOC et pour le criblage de nouveaux médicaments.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)
- Modèles animaux
- Exposition à l'ozone
Contexte
- La MPOC est un problème de santé important caractérisé par une limitation du flux d'air.
- Les modèles existants ne reproduisent peut-être pas entièrement la maladie humaine.
- L'exposition à l'ozone constitue une méthode potentielle pour induire la MPOC chez les modèles animaux.
- Cette étude vise à développer un modèle fiable à des fins de recherche.
Objectif de l'étude
- Induire une BPCO chez la souris par exposition à l'ozone.
- Créer un modèle qui imite les processus pathologiques de la BPCO.
- Faciliter le criblage de médicaments et les études mécanistiques.
Méthodes utilisées
- Exposition répétée de souris à de fortes concentrations d'ozone.
- Utilisation d'un générateur électrique et d'un soufflante à air pour produire de l'ozone.
- Surveillance de la concentration d'ozone à l'aide d'une sonde.
- Génération du modèle terminée en six à huit semaines.
Résultats principaux
- Un nouveau modèle animal de la BPCO a été généré avec succès.
- Le modèle reproduit les processus pathologiques observés chez les patients atteints de BPCO.
- Il fournit une plateforme pour des recherches supplémentaires et des tests de médicaments.
- La démonstration de la procédure a été réalisée par un chercheur postdoctoral.
Conclusions
- Le nouveau modèle est un outil précieux pour l'étude de la BPCO.
- Il peut aider à comprendre les mécanismes de la maladie.
- Potentiel pour le criblage de nouveaux agents thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce modèle d'exposition à l'ozone répond à un goulot d'étranglement critique dans la découverte de médicaments contre la BPCO en offrant une alternative rapide et mécaniquement pertinente aux modèles induits par la fumée de cigarette. Sa capacité à reproduire des caractéristiques pathophysiologiques clés — limitation du débit aérien, emphysème, inflammation et diminution de la tolérance à l'exercice — en 6 à 8 semaines renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles et le criblage préclinique. Le modèle permet une évaluation reproductible et quantitative de la fonction pulmonaire et des biomarqueurs inflammatoires, facilitant ainsi l'élimination précoce des hypothèses thérapeutiques à risque, et s'aligne sur les besoins industriels en matière de continuité translationnelle et de tri des portefeuilles.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques liées à la limitation du débit ventilatoire et à la destruction du parenchyme pulmonaire par le biais de la diminution quantifiable du rapport FEV25/50/75/FVC.
- Valeur scientifique : Facilite la validation fonctionnelle de cibles en modélisant l'emphysème et l'inflammation induits par l'ozone, reflétant ainsi l'étiologie humaine de la BPCO.
- Valeur opérationnelle : Réduit le temps de génération du modèle de plusieurs mois à quelques semaines, accélérant ainsi les études sur l'engagement des cibles et la clarification des voies impliquées.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit un système normalisé pour évaluer les effets des composés sur la fatigue pulmonaire, l'afflux de cellules inflammatoires et les modifications des cytokines (par exemple, diminution de l'IL-10, augmentation de l'IL-1β/TNF-α).
- Valeur opérationnelle : Facilite la reproductibilité des tests grâce à des protocoles d'exposition à l'ozone cohérents et à des paramètres fonctionnels tels que l'endurance sur tapis roulant et la pléthysmographie.
- Valeur opérationnelle : Permet des procédures de criblage évolutives en raison d'une période d'induction courte et d'une complexité technique minimale par rapport aux systèmes d'exposition à la fumée.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Démontre la pertinence pathologique grâce à des modifications parallèles de la morphologie pulmonaire (alvéoles agrandis, intercepts linéaires moyens augmentés) et des profils immunitaires observés chez les patients humains atteints de BPCO.
- Valeur scientifique : Permet une détection mécanistique des risques en associant l'exposition à l'ozone à des voies pathogéniques impliquant la neutrophilie, l'accumulation de macrophages et la dysrégulation des cytokines.
- Valeur opérationnelle : Autorise une évaluation longitudinale de l'intervention thérapeutique sur le déclin fonctionnel et les lésions structurelles au cours des étapes allant de la découverte au préclinique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le modèle s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'optimisation du composé principal, offrant une plateforme reproductible pour évaluer l'efficacité de composés sur des critères pertinents pour la BPCO avant tout investissement préclinique.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses grâce à la mesure de la diminution de la fonction pulmonaire et de l'augmentation des médiateurs inflammatoires après une exposition à l'ozone.
- Écrantage : Fournit des résultats quantitatifs et standardisés (rapports de VEMS, temps/distance jusqu'à la fatigue, nombres cellulaires dans le lavage broncho-alvéolaire) pour le passage du « hit » au « lead ».
- Analytique : Génère des ensembles de données multidimensionnels (fonctionnels, morphométriques, immunologiques) permettant des analyses comparatives entre groupes de traitement.
- Recherche translationnelle : Fait le lien entre la phase de découverte et les phases précliniques en modélisant une exposition environnementale étiologiquement pertinente (ozone) associée à la pathogenèse humaine de la BPCO.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place un modèle réutilisable et efficace en termes de temps pour des tests itératifs portant sur plusieurs cibles et modalités dans les programmes de maladies pulmonaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en modélisant un facteur de risque humain connu de la BPCO (l’ozone) avec des résultats pathologiques et fonctionnels mesurables.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et le débit grâce à des protocoles standardisés d’exposition, de tests fonctionnels et de traitement des tissus.
- Valeur stratégique : Optimise l’efficacité du capital en réduisant le temps et les ressources nécessaires à la génération du modèle, permettant des décisions plus rapides d’aller/non-aller.
- Impact sur le portefeuille : Favorise un développement ajusté au risque en fournissant des signaux précoces d’efficacité dans un modèle possédant une validité translationnelle, tant apparente que de construction.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en toxicologie par inhalation, en épreuves de fonction pulmonaire et en techniques de lavage bronchoalvéolaire.
- Dépend d'équipements de génération et de surveillance de l'ozone, d'un pléthysmographe corporel, d'un microtome et d'un ELISA ou d'une cytométrie en flux pour l'analyse des cytokines.
- Exige une standardisation interéquipes de la durée d'exposition, de la concentration (2,5 ppm) et des protocoles de tests fonctionnels afin d'assurer la comparabilité des données.
- Implique des considérations d'adaptation lors de la transposition des résultats entre souches de souris en raison de la variabilité potentielle de la sensibilité à l'ozone.
- Est limité par la nécessité d'une anesthésie terminale pour les évaluations fonctionnelles et histologiques, restreignant ainsi le suivi longitudinal non invasif.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
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Title
0:52
Ozone Air Exposure and Treadmill Test
2:17
Pulmonary Function Measurements
3:05
Broncheoalveolar Lavage Fluid (BALF) Collection
4:25
Cardiac Blood Sampling and Lung Morphometric Analysis
6:06
Results: Representative Chronic Obstructive Pulmonary Disease Mouse Model
7:29
Conclusion
