Name: Geração de um modelo de doença pulmonar obstrutiva crônica em ratos pela exposição repetida de ozônio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda a gerar um modelo de DPOC em camundongos por exposição repetida a ozônio. Este método recapitula processos patológicos humanos e permite triagem de novos fármacos em seis a oito semanas.

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Os autores gostaria de expressar gratidão ao Sr. Boyin Qin (Shanghai clínicos centro de saúde) para a assistência técnica com a avaliação de µCT neste protocolo.

Nota: OE o modelo foi gerado e usado em pesquisa anteriormente relatados 30 , 31 , 32. Todas as experiências com animais foram aprovadas pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Shanghai Jiaotong.
 1. ratos instalação <ol><li>casa isentos de organismos patogénicos, de 7 a 9-semana-idade BALB/c ratos fêmeas em gaiolas individuais ventilados um animal sob controlados temperatura (20 ° C) e humidade (40-60%). Fornece uma luz 12 h e ciclo escuro de 12 h na instalação. Providenciar comida e água ad libitum.</li>
</ol> 2. Ozônio ou exposição de ar <ol><li>gerar ozônio com um gerador elétrico em uma caixa de acrílico (por exemplo, Perspex) a vedação. Sopre o ar fora da caixa usando um soprador de ar pequeno através de uma tubulação do respiradouro de ar que está conectado no lado de dentro e fora da caixa. Controlar a concentração de ozônio na caixa usando uma sonda de ozônio. Espere até que a concentração de ozônio na caixa atinge 2,5 partes por milhão (ppm). 
	Nota: A sonda do ozônio pode alternar automaticamente o gerador de ozônio ou desligar e pode manter o nível de ozônio na caixa a 2,5 ppm.</li>
	<li>Coloque os ratos no caixa quando o nível de ozônio atinge 2,5 ppm. Manter os ratos na caixa para 3h cada vez de expô-las ao ozônio. 
	Nota: A caixa pode manter um nível de ozônio de 2,5 ppm durante a 3h comutando automaticamente o gerador de ozônio, ligado ou desligado e soprar o CO 2 que é produzido pelos ratos fora da caixa.</li>
	<li>Dar duas exposições de ozônio (cada exposição durando 3h) por semana (uma vez a cada 3 dias) por 7 semanas; expor os ratos controle ao ar ao mesmo tempo e no mesmo período.</li>
</ol> 3. Microtomografia computadorizada <ol><li>no fim de semana 7, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) ajustar a dose de acordo com situações individuais para ver que o mouse não responder a uma pitada do dedo do pé. Monitor e mantenha o mouse em uma frequência de respiração firme; e certifique-se sem movimentos voluntários existem durante os procedimentos.</li>
	<li>Coloque os ratos anestesiados na câmara de uma microtomografia computadorizada (µCT).</li>
	<li>Calibrar o µCT usando o protocolo padrão e o fabricante &#39; instruções s. Conjunto do tubo de raio x em 50 kV e a corrente em 450 µA. 
	Nota: Tanto o raio-x e o detector giram em torno do ratos.</li>
	<li>Realizar a análise µCT adquirindo 515 projeções com um tamanho de pixel eficaz de 0,092 mm, tempo de exposição de 300 ms para uma fatia e uma espessura da fatia de 0,093 mm.</li>
	<li>Reconstruir o pulmão com as imagens adquiridas usando um software. Ajustar o brilho da imagem em tons de cinza, definindo o mínimo e máximo, a escala de cinza em unidades de Hounsfield-750 e -550, respectivamente. 
	Nota: O software automaticamente irá calcular os volumes do parênquima pulmonar e a área do baixo-atenuação (LAA) 34 , 35.</li>
	<li>Calcular a porcentagem de LAA (LAA %) dividindo o volume LAA pelo volume total do pulmão.</li></ol>
 4. teste de esteira <ol><li>dão os ratos uma adaptação testar em uma velocidade de 10 m/min por 10 minutos em uma execução esteira máquina. Nota: A eletricidade está sempre desligado quando o processo está sendo conduzido.</li> <li>administrar um teste de fadiga para os ratos.
	<ol><li>Aquecer os ratos a uma velocidade de 10 m/min 5 min.</li>
		<li>Aumentar a velocidade de 15m/min durante 10 min.</li>
		<li>Aumentar a intensidade do exercício: aumentando a velocidade de 5 m/min, começando com 20 m/min, a cada 30 min até ratos não pode continuar a executar 36.</li>
	</ol></li> <li>Gravar o total, correndo a distância e tempo de execução como fadiga de distância e tempo de fadiga, respectivamente.</li></ol>
 5. medidas de função pulmonar <ol><li>anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) ajustar a dose de acordo com situações individuais para ver que o rato faz Não responde a uma pitada de dedo do pé e esperar até que os ratos têm mantido respiração espontânea. Monitor e mantém o mouse em uma frequência de respiração firme; e certifique-se sem movimentos voluntários existem durante os procedimentos.</li>
	<li>Cuidadosamente tracheostomize os ratos e os coloque em um pletismógrafo de corpo que está ligado a um ventilador controlado por computador. 
	Nota: A ventilação é controlada através de uma válvula localizada proximalmente ao tubo endotraqueal. A instalação oferece diferentes manobras semiautomáticas, incluindo a manobra do volume pressão quase estático e a manobra do volume fluxo rápido.</li>
	<li>Impor uma média de frequência de 150 respirações por minuto para o rato anestesiado por meio de ventilação de pressão controlada até um padrão de respiração regular de respiração e expiração completa em cada ciclo de respiração é obtida.</li>
	<li>Executar a manobra de pressão-volume quase estático com o dispositivo usando as pressões negativas geradas na pletismografia.</li>
	<li>Executar a manobra de volume de fluxo rápido dentro dos loops de pressão-volume quase estático para gravar a CVF e o VEF. Inflar o pulmão para + 30 cm H 2 O e imediatamente depois, conecte-o a uma pressão altamente negativa para impor a expiração até o volume residual é a-30 cm H 2 O. Record o VEF nos primeiros 25, 50 e 75 ms de exalação (FEV 25 FEV 50 e FEV 75, respectivamente). Rejeite as manobras de qualidade inferior. Para cada teste com cada único rato, realizar um mínimo de três manobras aceitáveis para obter uma média confiável para todos os parâmetros numéricos.</li>
</ol> 6. BALF coleção <ol><li>após anestesia terminal com pelltobarbitalum natricum ((1%, 1,8 a 2,4 ml/100 g) ajustar a dose de acordo com situações individuais para ver o que o rato não responder a uma pitada de dedo do pé e perder o fôlego), lavagem do ratos com 2 mL de PBS através de um tubo endotraqueal de 1 mm de diâmetro e em seguida, recuperar o LBA 10.</li>
	<li>Reunir as alíquotas de lavagem obtida e centrifugá-los a 4 ° C e 250 x g durante 10 min.</li>
	<li>Recolher o sobrenadante para uso imediato e guarde o restante no-80 ° C ou líquido nitrogênio.</li>
	<li>Conte o número total de células usando um hemocytometer.</li>
	<li>Ressuspender as células em PBS e então girar (1.400 x g, 6 min) 250 µ l de células ressuspensa em slides utilizando uma centrífuga de girador de slide.</li>
	<li>Wright aplicar coloração para células nos slides de acordo com o fabricante &#39; protocolo de s.</li>
	<li>Contar 200 células por rato; identificar as células como macrófagos ou neutrófilos, de acordo com a morfologia padrão, com ampliação de X 400; e contar os números deles.</li>
</ol> 7. Amostragem de sangue cardíaco <ol><li>coletar sangue através de punção cardíaca, carregá-lo para tubos de 1,5 mL e mantê-lo no gelo por 30 min.</li>
	<li>Centrifugar as amostras de sangue por 5 min em 2.000 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante (soro) para um tubo novo e armazená-lo no-80 ° C ou líquido nitrogênio.</li>
	<li>Preparar o soro para IL-1 β, IL-10 e testes de detecção de TNF-α usando os respectivos kits ELISA.</li>
</ol> 8. Análise morfométrica de pulmão <ol><li>dissecar os pulmões e tracheas de ratos.
	<ol><li>Posicionar cada rato euthanized em uma placa cirúrgico imediatamente após o sacrifício.</li>
		<li>Distância dissecar a platisma e músculos traqueais anteriores para visualizar e acessar os anéis traqueais.</li>
		Cavidade <li>aberto até a torácica. Dissecar os pulmões e a traqueia, mas não separe o coração dos pulmões.</li>
	</ol>
	</li> <li>Se conectar o cateter endotraqueal para uma seringa contendo paraformaldeído 4%, através de um tubo de polietileno PE90. 
	Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico. Usar luvas e óculos de segurança e usar a solução dentro de uma coifa.</li>
	<li>Inflar o pulmão completamente usando paraformaldeído 4% (10 gotas, ~ 200 µ l) através do cateter endotraqueal. Remover o coração após a conclusão da inflação.</li>
	<li>Manter o pulmão em um tubo de 15 mL contendo 10 mL de paraformaldeído 4% pelo menos 4 h.</li>
	<li>Incorporar o pulmão em parafina. Obter as seções 5-µm por bloco de parafina com um micrótomo rotativo de corte. Durante o corte, expor a área máxima da superfície do tecido pulmonar dentro da área da árvore brônquica.</li>
	<li>Para Análise morfométrica, executar hematoxilina e eosina (H &#38; E) coloração sobre as seções.</li>
	<li>As seções de imagem com um microscópio de campo claro vertical (lente objetiva, 20 X; tempo de exposição, ms 1,667).</li>
	<li>Tem dois investigadores cegos para o protocolo de tratamento independentemente as secções histológicas. Use a interceptação linear média (L m) como um parâmetro para medir a distância da parede do septo inter alveolar. Determinar a L m usando as seguintes etapas: <ol><li>abrir as imagens das seções no Photoshop e desenhe uma reticule-grade na imagem com longas filas de cinco 550 µm.</li>
		<li>Contar o número de alvéolos através da linha de grade.</li>
		<li>Calcular a L m dividindo o comprimento da linha de grade pelo número de alvéolos. Para quantificação, imagem cinco seções por rato. Adquirir dez imagens de cada seção (uma imagem por campo) e avaliar aleatoriamente. Durante a seleção do campo, evitar áreas de vias aéreas e vasos movendo um campo à frente ou em outra direção. 
		Nota: Os dados são apresentados como a média ± no MEV mostrou Um teste t não-pareado foi realizado para comparação entre ar-expostos ratos e camundongos expostos de ozônio. Três animais de cada grupo foram usados para calcular a diferença significativa. Um p-valor de &#60; 0,05 foi considerado significativo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Z.W.S. e W.W. são empregados atuais e detentores de opção de ações do grupo de Biomedicina celular (NASDAQ: CBMG). Outros autores a declaram que eles têm não tem interesses concorrente.

Neste estudo, apresentamos um método confiável para a geração de um novo modelo de DPOC. Comparado a outros modelos (i.e., LPS ou modelos de EPI), este modelo de OE recapitula o processo patológico de doentes com DPOC. Porque a fumaça do cigarro é o principal material perigoso que causa a DPOC em pacientes humanos40, o modelo CS continua a ser o mais popular DPOC modelo41,42. No entanto, o modelo CS requer um R de 3 a 12 meses &#3...

Estima-se que a DPOC, incluindo enfisema e bronquite crônica, pode ser a terceira principal causa de morte no mundo em 20201,2. A potencial incidência de DPOC em uma população de mais de 40 anos de idade é estimada em 12,7% no sexo masculino e 8,3% nas fêmeas dentro os próximos 40 anos3. Não há medicamentos dispõem reverter a deterioração progressiva em pacientes de DPOC4. Modelos animais confiáveis de DPOC não só exigem a imitação do processo patológico da doença mas também requerem um período curto de geração. Modelos atuais de DPOC, incluindo os LPS ou um modelo de EPI-induzida, podem induzir sintomas de enfisema, como5,6. Uma única administração ou um desafio da semana de LPS ou PPE ratos ou ratos resulta em neutrofilia marcada no líquido de lavagem broncoalveolar (LBA), aumentos de mediadores pró-inflamatórios (por exemplo, TNF-α e IL-1 β) no LBA ou soro, produz o pulmão espaços de ar parenquimatosos destruição-ampliado e limites do fluxo de ar5,6,7,8,9,10. No entanto, LPS ou PPE não são causas de DPOC humana e, portanto, não imitar o processo patológico11. Um modelo CS-induzido produziu uma limitação do fluxo de ar persistente, destruição parenquimatosa pulmonar e reduzida capacidade de exercício funcional. No entanto, um protocolo de CS tradicional requer pelo menos 3 meses para gerar um modelo do DPOC12,13,14,15. Assim, é importante gerar um novo modelo animal mais eficiente que atenda os dois requisitos.
Recentemente, além de fumar de cigarro, poluição do ar e exposição ocupacional tornaram-se as causas mais comuns de DPOC16,17,18. O ozônio, como um dos principais poluentes (embora não é o principal componente da poluição do ar), diretamente pode reagir com o trato respiratório e danificar o tecido pulmonar de crianças e jovens adultos19,20,21 ,22,23,24,25. Ozônio, bem como outros estimuladores incluindo LPS, PPE e CS, estão envolvidos em uma séria de caminhos bioquímicos de estresse oxidativo pulmonar e danos ao DNA e estão ligados ao início e à promoção da DPOC26,27. Outro fator é que os sintomas de alguns doentes com DPOC deteriorar-se após ser exposto ao ozônio, indicando que o ozônio pode interromper pulmão função18,28,29. Portanto, geramos um novo modelo de DPOC, repetidamente, expondo ratos a concentrações elevadas de ozono por 7 semanas; Isto resultou em fluxo de ar defeitos e danos pulmonares parenquimatosas semelhantes de investigações anteriores30,31,32. Nós estendido o protocolo de OE para ratos fêmeas neste estudo e reproduzido com sucesso o enfisema observado em ratos masculinos em nossos anteriores estudos30,31,32. Porque a mortalidade da DPOC diminuiu em homens mas aumentou nas mulheres em muitos países,33, um modelo de DPOC em fêmeas é necessário para estudar os mecanismos e desenvolver métodos terapêuticos para pacientes de DPOC. A aplicabilidade do modelo para todos os gêneros OE presta apoio adicional ao seu uso como um modelo de DPOC.

<table><tbody><tr><td>Camundongos BALB/c</td><td>Slac Laboratory Animal, Shanghai, China</td> N<td>/A</td><td>Camundongos BALB/c fêmeas de 7 a 9 semanas de idade foram usados neste estudo.</td></tr><tr><td>Gaiolas ventiladas individuais</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>Número do modelo: MU64S7</td><td>As gaiolas foram usadas para abrigar ratos nas instalações para animais.</td></tr><tr><td>Vedação de perspex-box</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>A caixa foi usada para conter o gerador de ozônio. Os ratos foram expostos ao ozônio dentro da caixa.</td></tr><tr><td>Gerador elétrico</td><td>Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Alemanha</td><td>Modelo 500&nbsp;</td><td>O dispositivo foi usado para gerar ozônio.</td></tr><tr><td>Sonda de ozônio</td><td>ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Grande Manchester, Reino Unido</td><td>Ozônio 300</td><td>O dispositivo foi usado para monitorar e controlar a geração de ozônio.</td></tr><tr><td>Pelltobarbitalum natricum</td><td>Sigma, St. Louis, MO, EUA</td><td>P3761</td><td>Camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum.</td></tr><tr><td>Microtomografia Computadorizada</td><td>GE Healthcare, Londres, ON, Canadá</td><td>RS0800639-0075</td><td>Este dispositivo foi usado para aquisição de imagens do pulmão.</td></tr><tr><td>Micro-view 2.01 Software ABA</td><td>GE Healthcare, Londres, ON, Canadá</td><td>Micro-view 2.01&nbsp;</td><td>Este dispositivo foi utilizado para reconstruir o pulmão e analisar o volume, AAE do pulmão.</td></tr><tr><td>Máquina de esteira</td><td>Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China</td><td>DSPT-208</td><td>Esta máquina foi usd para teste de fadiga.</td></tr><tr><td>Pletismógrafo corporal</td><td>eSpira&trade; Sistema de Manobras Forçadas, EMMS, Edimburgo, Reino Unido</td><td>Sistema de Manobras Forçadas</td><td>Este dispositivo foi usado para testar a função pulmonar da espirometria.</td></tr><tr><td>Ventilador</td><td>eSpira&trade; Sistema de Manobras Forçadas, EMMS, Edimburgo, Reino Unido</td><td>Sistema de Manobras Forçadas</td><td>Este dispositivo foi usado para testar a função pulmonar da espirometria.</td></tr><tr><td>Centrífuga giratória deslizante</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA, USA</td><td>C1183&nbsp;</td><td>Foi usado para girar células BALF em lâminas.</td></tr><tr><td>Wright Staining</td><td>Hanhong, Xangai, China</td><td>RE04000054</td><td>&nbsp; Foi usado para corar macrófagos, neutrófilos no BALF suspenso.</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA, EUA</td><td>4000</td><td>Foi usado para contar células.</td></tr><tr><td>IL-1&beta;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, EUA</td><td>ab100704</td><td>Eles foram usados para testar os respectivos fatores no soro.</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>Abcam, Cambridge, MA, EUA</td><td>ab46103</td><td>Eles foram usados para testar os respectivos fatores no soro.</td></tr><tr><td>TNF-&alfa;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, EUA</td><td>ab100747</td><td>Eles foram usados para testar os respectivos fatores no soro.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído&nbsp;</td><td>Sigma, St. Louis, MO, EUA</td><td>P6148</td><td>O pulmão foi inflado com paraformaldeído a 4%.</td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Hualing, Xangai, China</td><td>56#</td><td>Foi usado para incorporar o pulmão.</td></tr><tr><td>Micrótomo Rotativo</td><td>Leica, Wetzlar,&nbsp; Hesse, Alemanha</td><td>RM2255</td><td>Foi usado para seccionar o pulmão.</td></tr><tr><td>Hgaematoxilina e Eosina (H& E) solução de coloração</td><td>Solarbio, Pequim, China</td><td>G1120</td><td>H & A coloração E foi feita para análise morfométrica.</td></tr><tr><td>Microscópio vertical de campo brilhante</td><td>Olympus, Center Valley, PA, EUA</td><td>CX41</td><td>Foi usado para obter imagens do H& Lâminas de coloração E.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Adobe, San Jose, CA, EUA</td><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Foi usado para contar o número de alvéolos no H& E imagens manchadas.</td></tr><tr><td>GraphPad prisma 5</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA</td><td>GraphPad prism 5</td><td>Foi usado para análise de dados e produção de figuras.</td></tr></tbody></table>

geração de um modelo de doença pulmonar obstrutiva crônica em ratos pela exposição repetida de ozônio

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é caracterizada pela destruição parenquimatosa pulmonar e limitação de persistente do fluxo de ar. Tem uma incidência muito alta no envelhecimento das populações. As terapias convencionais atuais para DPOC foco principalmente no sintoma-drogas; assim, é urgente o desenvolvimento de novas terapias. Modelos animais qualificados de DPOC poderiam ajudar a caracterizar os mecanismos subjacentes e podem ser usados para o rastreio de drogas novas. Modelos atuais de DPOC, tais como lipopolissacarídeo (LPS) ou a elastase pancreática porcina (PPE)-modelo de enfisema induzido, gerar a DPOC, como lesões nos pulmões e vias aéreas mas não caso contrário se assemelham a patogênese da DPOC humana. Fumo um cigarro (CS)-modelo induzido continua a ser um dos mais populares porque não só simula DPOC-lesões no sistema respiratório, mas também é baseado em um dos principais materiais perigosos que causa a DPOC em seres humanos. No entanto, os aspectos demorados e trabalhosos do modelo CS-induzido limitam drasticamente sua aplicação na despistagem de drogas novas. Neste estudo, geramos com êxito um novo modelo de DPOC, expondo os ratos a altos níveis de ozônio. Este modelo demonstrou o seguinte: 1) diminuiu o volume expiratório forçado 25, 50 e 75/forçado capacidade vital (VEF25observou, VEF50observou e VEF75observou), indicando a deterioração da função pulmonar; 2) alvéolos pulmonares alargada, com destruição parenquimatosa pulmonar; 3) redução do tempo de fadiga e distância; e 4) aumento da inflamação. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que o modelo de exposição (OE) de ozônio é um modelo animal confiável que é semelhante aos seres humanos porque superexposição de ozônio é um dos fatores etiológicos da DPOC. Além disso, só demorou 6-8 semanas, com base no nosso trabalho anterior, para criar um modelo de OE, Considerando que requer 3-12 meses para induzir o modelo de fumaça de cigarro, indicando que o modelo de OE pode ser uma boa escolha para a investigação de DPOC.

Exemplos de imagens 3D µCT de cada grupo são exibidos na Figura 1um. Os ratos expostos de ozônio tinham um volume de pulmão total significativamente maior (Figura 1a e b) e LAA % (Figura 1c) do que os ratos controle expostas ao ar. O volume pulmonar e LAA % manteve-se elevado após seis semanas de ozônio exposição31,...

Este estudo descreve a geração bem sucedida de um novo modelo animal de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), repetidamente expondo ratos a concentrações elevadas de ozono.

Geração de um modelo de doença pulmonar obstrutiva crônica em ratos pela exposição repetida de ozônio

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

O objetivo geral deste experimento é induzir a doença pulmonar obstrutiva crônica ou DPOC por meio da exposição ao ozônio, OE, em camundongos. Este novo modelo de OE pode contribuir para a caracterização do mecanismo subjacente da DPOC e pode ser utilizado para a triagem de novas drogas. As principais vantagens deste modelo de OE são a recapitulação dos processos patológicos observados em pacientes com DPOC.Pode ser gerado em apenas seis a oito semanas. Demonstrará o procedimento junto comigo Weijaian Sang, pesquisador associado do nosso grupo. Para gerar ozônio, utilize um gerador elétrico e um pequeno soprador de ar para soprar o ar para fora de uma caixa de acrílico vedada através de um tubo de ventilação conectado ao interior e ao exterior da caixa, usando uma sonda de ozônio para monitorar a concentração do gás dentro da caixa.Quando a concentração de ozônio atingir 2,5 partes por milhão, coloque os camundongos na caixa por 3 horas. Ao final da semana 7, realize imagens dos animais tratados com ozônio por meio de tomografia computadorizada microscópica de acordo com protocolos padrão. Para testar as alterações induzidas pelo ozônio e as capacidades funcionais, como fadiga pulmonar, aqueça primeiro os camundongos a uma velocidade de 10 metros por minuto em uma esteira rolante.Após 5 minutos, aumente a velocidade para 15 metros por minuto durante um período de 10 minutos. Continue aumentando a velocidade em cinco metros por minuto a cada 30 minutos até que os camundongos não consigam mais correr. Registre a distância total percorrida e o tempo de corrida para cada animal como distância de fadiga e tempo de fadiga, respectivamente.Para medir a função pulmonar dos animais expostos ao ozônio, coloque um camundongo anestesiado em um pletismógrafo corporal conectado a um ventilador controlado por computador. Utilize ventilação controlada por pressão para impor uma frequência respiratória média de 150 respirações por minuto ao animal anestesiado até que seja obtido um padrão respiratório regular e uma expiração completa em cada ciclo respiratório. Em seguida, registre o volume expiratório forçado nos primeiros 25, 50 e 75 milissegundos da expiração, descartando qualquer manobra subótima.Após a anestesia terminal, utilize um tubo endotraqueal de um milímetro de diâmetro para lavar os animais duas vezes com um mililitro de PBS por lavagem. Reúna as alíquotas recuperadas de cada animal para centrifugação e colete os sobrenadantes em nitrogênio líquido. Re-suspenda os pellets em PBS fresco para contagem e prepare dois suportes por camundongo com uma lâmina de microscópio, cartão-filtro e funil.Adicione aproximadamente 100 a 125 microlitros das células re-suspendidas a cada funil. Coloque os porta-objetos no citocentrifugador e centrifugue as células para fixá-las nos lâminas. Em seguida, aplique a solução de coloração adequada às células de acordo com as instruções do fabricante e conte 200 células por camundongo sob ampliação de 400 vezes.Para a coleta de sangue cardíaco, colete aproximadamente 500 microlitros de sangue dos animais expostos ao ozônio por punção cardíaca. E adicione o sangue a tubos de 1,5 mililitro sobre gelo. Após 30 minutos sobre gelo, centrifugue as amostras de sangue e transfira os sobrenadantes séricos para novos tubos para armazenamento em nitrogênio líquido.As amostras podem posteriormente ser descongeladas para a avaliação dos níveis de expressão de citocinas séricas por ELISA, conforme protocolos padrão. Para análise morfométrica pulmonar, posicione o primeiro camundongo em posição supina após a coleta cardíaca. Em seguida, abra a cavidade torácica e dissecione o platisma e os músculos traqueais anteriores para acessar os anéis traqueais.Colete os pulmões e a traqueia sem separar o coração dos pulmões. Em seguida, use um tubo de polietileno PE90 para conectar um cateter endotraqueal a uma seringa contendo formaldeído a 4% e insufle completamente os pulmões com aproximadamente 200 microlitros de paraformaldeído. Em seguida, coloque os pulmões em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de formaldeído a quatro por cento recém-preparado por pelo menos quatro horas.Quando avaliado por microtomografia computadorizada, camundongos expostos ao ozônio exibem um volume pulmonar total significativamente maior e uma porcentagem de área de baixa atenuação maior do que a dos animais controle expostos ao ar ambiente. O fenótipo de enfisema também é evidenciado pelos alvéolos pulmonares aumentados e pelos interceptos lineares médios elevados. A avaliação da função pulmonar por pletismógrafo demonstra que todos os parâmetros que diminuem em camundongos expostos ao ozônio são consistentes com os defeitos funcionais pulmonares típicos observados em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica.Além disso, a exposição ao ozônio diminui significativamente o tempo de fadiga e a distância até a fadiga em testes de tolerância ao exercício. Animais tratados com ozônio também exibem aumento significativo de células inflamatórias, incluindo macrófagos e neutrófilos, bem como diminuição significativa de IL-10 e aumento de IL-1 beta e TNF alfa, demonstrando que o modelo de exposição ao ozônio reproduz sintomas semelhantes aos da doença pulmonar obstrutiva crônica humana. A aplicação deste procedimento em outras linhagens de camundongos, como os camundongos C57 BR6, pode ser utilizada para gerar este modelo OE. Após seu desenvolvimento, esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de doenças pulmonares explorarem os mecanismos subjacentes à DPOC.Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído pode ser perigoso e que precauções, como o uso de luvas, óculos de segurança e a manipulação da solução dentro da capela de exaustão, devem sempre ser tomadas ao lidar com este reagente.

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Medicine

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O presente protocolo fornece uma descrição passo-a-passo detalhado dos procedimentos necessários para a execução de medidas de mecânica do sistema respiratório, bem como a avaliação da capacidade de resposta das vias aéreas à metacolina inalada em ratos utilizando a técnica de oscilações forçadas (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canadá).

Avaliação da mecânica respiratória em ratos usando a técnica de oscilações forçadas

Descreve-se o método de ágar-esferas de estabelecer infecção das vias aéreas persistente a longo prazo crônica Pseudomonas aeruginosa no modelo de mouse.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

O objetivo deste protocolo é fornecer métodos automatizados para quantificar patologias pulmonares crônicas em um modelo murino de DPOC. O protocolo inclui a exposição de camundongos à fumaça de cigarro (CS), medição da função pulmonar, insuflação dos pulmões e uso de métodos de morfometria para medir o enfisema e a remodelação das pequenas vias aéreas em camundongos.

Automáticos de medição de enfisema pulmonar e das vias aéreas pequenas Reformas em cigarro expostas ao fumo Mice

É apresentado aqui um protocolo útil para a fixação do pulmão que cria uma condição estável para a avaliação histológica de espécimes do pulmão de um modelo do rato do enfisema. A vantagem principal deste modelo é que pode fixar muitos pulmões com a mesma pressão constante sem colapso ou deflação do pulmão.

Fixação pulmonar pressão constante para avaliação de enfisema em camundongos

Aqui nós descrevemos um método para avaliar a expressão de pulmão de miRNAs que são previstos para regular os genes inflamatórios usar ratos expostos ao ozônio ou ar filtrado em diferentes fases do ciclo estral.

Pulmão microRNA Profiling através do ciclo estral em camundongos expostos de ozônio

Este manuscrito descreve um protocolo para determinar se a exposição ao ozônio, um critério poluente aéreo, prejudica a efferocitose alveolar do macrófago in vivo. Este protocolo utiliza reagentes e técnicas comumente usados e pode ser adaptado a vários modelos de lesão pulmonar para determinar os efeitos sobre a efferocitose do macrófago alveolar.

In vivo avaliação da Efferocitose de macrófago alveolar após exposição ao ozônio

Ozônio combinado e endotoxina bacteriana exposição de camundongos mostram morte celular generalizada, incluindo a de neutrófilos. Observamos adaptações celulares como interrupção da lamellipodia citoesquelética, aumento da expressão celular da complexa subunidade de synthase V ATP β e angiostatina na lavagem bronco-alveolar, supressão da resposta imune pulmonar e recrutamento retardado de neutrófilos.

Visualizando adaptações celulares pulmonares durante a lesão pulmonar aguda de ozônio e LPS induzidas por LPS

Vários modelos animais de fibrose pulmonar foram estabelecidos usando bleomicina para esclarecer a patogênese da fibrose pulmonar e encontrar novos alvos de drogas. No entanto, a maioria dos modelos de fibrose pulmonar direcionados ao tecido pulmonar tem administração desigual de medicamentos. Aqui, propomos um modelo de fibrose pulmonar uniforme induzida por nebulização de bleomicina nasal.

Um modelo de camundongo de fibrose pulmonar induzida por nebulização de bleomicina nasal

Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo de silicose em camundongos através da exposição repetida a suspensões de sílica via gotejamento nasal. Este modelo pode eficiente, convenientemente e flexivelmente mimetizar o processo patológico da silicose humana com alta repetibilidade e economia.

Modelo de silicose em camundongos estabelecido por inalação repetida de pó de sílica cristalina

Este protocolo delineia um método para induzir fibrose pulmonar em camundongos por meio da administração orofaríngea repetida de bleomicina, produzindo características patológicas muito semelhantes às da fibrose pulmonar idiopática.

Modelo Murino Refinado de Fibrose Pulmonar Idiopática

Aqui, apresentamos um protocolo para modelar a fibrose pulmonar em camundongos usando bleomicina aerossolizada administrada pela traqueia. Esse método otimizado permite uma entrega uniforme, quantitativa e precisa, sem incisão cirúrgica, aumentando a reprodutibilidade e a confiabilidade da fibrose induzida por bleomicina.

Um método refinado de entrega intratraqueal de bleomicina baseado em aerossóis para modelos reprodutíveis e minimamente invasivos de fibrose pulmonar em camundongos

Aprenda a gerar um modelo de DPOC em camundongos por exposição repetida a ozônio. Este método recapitula processos patológicos humanos e permite triagem de novos fármacos em seis a oito semanas.

Geração de um modelo de doença pulmonar obstrutiva crônica em ratos pela exposição repetida de ozônio

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