Name: In Vivo Détection et analyse des Rb SUMOylation de protéines dans les cellules humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Apprenez à détecter la SUMOylation des protéines Rb dans les cellules humaines HEK293. Cette méthode permet d'analyser les modifications protéiques endogènes et exogènes pour comprendre les processus cellulaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette étude a été financée par des subventions de la Science et la technologie Commission de Shanghai (concession no 14411961800) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Grant no 81300805).

1. détection de la SUMOylation Rb endogène au début de la Phase G1 <ol><li>Cell culture et cycle cellulaire synchronisation.
	<ol><li>Cellules HEK293 maintenir en milieu de culture contenant Dulbecco &#39; s Modified Eagle moyenne (DMEM) additionné de 1 % Strep-Pen et 10 % bovin sérum fœtal (SVF) à 37 ° C et 5 % de CO 2 dans un incubateur.</li>
		<li>Synchroniser les cellules HEK293 lors de la phase G0.
		<ol><li>Comte les cellules HEK293 utilisant un hémocytomètre et semences ~1.5 x 10 7 cellules dans un 15 cm plat avec 25 ml de milieu de croissance pendant 24 h avant le traitement. Après avoir atteint une confluence d’aspirat de 70-80 %, le moyen et le lavage des cellules deux fois avec 5 mL préchauffé solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
			<li>Ajouter 25 mL DMEM contenant 1 % pénicilline-streptomycine et incuber les cellules à 37 ° C pendant 72 h. laver les cellules de la plaque à l’aide de 3 mL de PBS glacée. Les cellules de transfert dans un nouveau tube de 5 mL.</li>
			<li>Sous réserve une petite partie des cellules à l’analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux (étape 1.2), recueillant la majorité restante des cellules par centrifugation à 200 x g pendant 5 min à température ambiante et puis les stocker dans un congélateur ultra basse température jusqu'à l’analyse de Rb SUMOylation.</li>
		</ol></li> <li>Pour obtenir la phase G1 cellules, à la fin du processus de synchronisation G0, retirer le DMEM et ajouter milieu dos frais, permettant ainsi les cellules HEK293 à réintégrer le cycle cellulaire. Ensuite, recueillir les cellules à différentes phases G1 (début G1 : 30 min ; G1 : 2 h) pour le cycle cellulaire analyse et autre SUMO dosage.</li>
		<li>Synchroniser les cellules HEK293 lors de la phase de S à l’aide de la méthode de double-thymidine bloc.
		Cellules <ol><li>cellules HEK293 poussent à une confluence de 50 % et de lavage avec du PBS préchauffée. Ajoutez ensuite additionné de croissance avec la thymidine 2,5 mM pour 18 h (premier bloc).</li>
			<li>Enlever le milieu de la thymidine contenant et laver les cellules deux fois avec du PBS préchauffée. Ajouter le milieu de croissance fraîche pendant 14 h libérer les cellules.</li>
			<li>Jeter le milieu avec une pipette et ajouter le milieu additionné de thymidine 2,5 mM pour encore 18 h (second bloc) avant de procéder à une analyse du cycle cellulaire et Rb SUMOylation.</li>
		</ol></li> <li>La synchronisation pour le G2/M, plaque ~1.5 × 10 7 HEK293 cellules à un plat de 15 cm avec 25 mL de milieu de croissance pendant 24 h. Ajoutez ensuite le nocodazole au milieu jusqu'à l’obtention d’une concentration finale de 400 ng/mL. Enfin, incuber les cellules pendant 16 h avant d’effectuer l’analyse du cycle cellulaire et Rb SUMOylation.</li>
	</ol></li> <li>Analyse du cycle cellulaire par cytométrie.
	<ol><li>Remettre en suspension les HEK293 synchronisée dans du PBS et fixer ensuite la suspension de cellules à l’aide de glacee éthanol à 70 % pendant 2 h à 4 ° C. Notez que pour minimiser la cellule mise en cluster, la suspension cellulaire, ajouter quelques gouttes à l’éthanol glacé de 100 % pour obtenir une concentration finale de éthanol à 70 % tout en douceur Vortex.</li>
		<li>Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g, puis soigneusement éliminer le surnageant et laver les cellules deux fois avec du PBS. Répétez l’étape de centrifugation.</li>
		<li>Ajouter 500 µL PBS contenant 50 µg/mL nucleic acid tacher l’iodure de propidium, 0,1 % Triton X-100 et 1 µg/mL RNase A aux cellules et bien mélanger. Incuber les cellules pendant 15 min à 37 ° C.</li>
		<li>Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu'à l’analyse par cytométrie.</li>
	</ol></li> <li>Immunoprécipitation de protéine Rb endogène.
	<ol><li>Prepare la HEK293 lysats de cellules.
		<ol><li>Lyse les cellules HEK293 synchronisées doucement, re-suspension eux dans 1 mL de tampon de lyse dosage (RIPA) glacee radio-immunoprécipitation (tableau 1) fraîchement ajouté 20 mM N-éthylmaléimide, un inhibiteur de l’isopeptidase qui pourrait bloquer les protéases SUMO et stabiliser SUMO conjugués.</li>
			<li>Encore homogénéiser les cellules sur la glace selon Dounce homogénéisation, sonication ou simplement au travers de 10 fois à travers une aiguille 21 G, attachée sur une seringue de 2 mL. Puis, incuber les cellules sur la glace pendant 5 min. 
			Remarque : Le dodécylsulfate de sodium détergent anionique (SDS) dans la mémoire tampon RIPA est crucial pour la détermination ultérieure de la Rb-SUMO, car il pourrait éliminer le signal SUMO imprécis qui est dérivé de l’interaction non covalentes entre la protéine Rb et d’autres non-Rb SUMO-espèce.</li>
		</ol></li> <li>Centrifuger les lysats cellulaires à 18 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. transférer les surnageants dans de nouveaux tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 mL. 
		Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Les protéines peuvent être stockées à-80 ° C pendant au moins 6 mois.</li>
		<li>Pour préparer le contrôle d’entrée de chaque échantillon la tache occidentale plus tard, enregistrer une petite partie du liquide surnageant décrite ci-dessus dans un nouveau tube et les conserver à -80 ° C.</li>
		<li>Pour le cas ci-dessus, ajouter 1 µg d’immunoglobulines non spécifiques souris G (IgG) de la même espèce et isotype comme l’anticorps monoclonal de Rb et 20 µL du lisier de 50 % protéine A/G-Sépharose. Puis, incuber pendant 1 heure à 4 ° C, avec une légère rotation.</li>
		<li>Centrifuger les échantillons à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C. soigneusement recueillir le surnageant sans déranger les perles et de les transférer dans de nouveaux tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 mL. Pour chaque échantillon, ajouter 5 µL Rb l’anticorps primaire et 40 µL de 50 % de protéine A/G-Sépharose lisier. Puis, incuber une nuit à 4 ° C, avec une légère rotation.</li>
		<li>Recueillir les perles par centrifugation à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C et retirer délicatement le surnageant de pipetage. Notez que pour éviter la perte de la perle, ne pas aspirer le perles sec.</li>
		<li>Laver les billes quatre fois avec 1 mL de tampon RIPA. Chaque fois, les tubes bien mélanger en rotation à 4 ° C pendant 15 min. collecter les perles par centrifugation à faible vitesse à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C et le jeter les surnageants.</li>
		<li>Après avoir enlevé les surnageants du lavage final, remettre en suspension les perles dans 30 µL 1 x tampon de chargement électrophorèse (SDS-PAGE) de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel (tableau 1) et bien mélanger.
		<ol><li>Incuber les tubes à 100 ° C, dans une chaleur bloquent pour 10 min. centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 1 min granuler les perles. Soigneusement recueillir le surnageant sans déranger les perles et de les transférer aux tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 mL.</li>
		</ol></li> <li>Analyser les échantillons de 4-20 % dégradé SDS-PAGE de gel et Western blot ou stockez-les à-20 ° C pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol></li></ol> 2. Analyse de 6XHis-tag de SUMOylation de Rb exogène dans les cellules humaines <ol><li>Cell culture et transfection.
	<ol><li>Graines ~ 6 × 10 6 HEK293 cellules dans un 10 cm plat et incuber pendant 24 h dans un milieu de croissance dans des conditions de culture cellulaire normale d’acquérir confluentes à 75-85 %. Avant la transfection, enlevez le milieu de croissance et ajouter 6 mL de sérum réduit préchauffée milieu (voir Table des matières) et puis replacez la vaisselle dans l’incubateur.</li>
		<li>Essai de SUMOylation constitutive pour le Rb, ajouter 15 µg de chacun des émetteurs 6XHis Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT et plasmides Ubc9-C93S dans 500 µL de milieu de sérum réduit en tubes de 1,5 mL de micro-centrifuge, respectivement.
		<ol><li>Pour analyser la conjugaison-SUMO de type sauvage Rb et son mutant de SUMOylation défectueux, mélanger 10 µg de chaque plasmide de Rb-WT ou Rb-K720R 6XHis-tag avec GFP-SUMO1 (10 µg) dans 500 µL réduit moyen de sérum dans 1,5 mL micro-centrifugeuse tubes de 13.</li>
		</ol></li> <li>Pendant ce temps, dans une éprouvette, mélanger 50 µL de réactif de transfection (voir Table des matières) dans 500 µL réduit moyen de sérum et incuber à température ambiante pendant 5 min.</li>
		<li>Entièrement combinent les deux tubes distincts décrits ci-dessus et incuber à température ambiante pendant 15 min. ajouter la transfection des complexes de réactif/plasmide dans les cellules et continuer à la culture pour 8 h-5 % CO 2 et 37 ° C.</li>
		<li>Remplacer le moyen de sérum réduit avec le milieu de croissance et incuber les cellules dans des conditions de culture normale pendant 48 h après la transfection.</li>
	</ol></li> <li>Nickel déroulant affinité de la protéine Rb-le tag 6XHis.
	<ol><li>Lyser les cellules HEK293 transfectées et extraire les protéines totales, comme le décrit la Section 1.3.1.</li>
		<li>Centrifuger les lysats cellulaires à 18 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. soigneusement collecter les surnageants et transférez-la sur tubes propres. 
		Remarque : La protéine peut être figée à ce point pendant plus de 6 mois à -80 ° C.</li>
		<li>Pour préparer le contrôle d’entrée de chaque échantillon la tache occidentale plus tard, sauver une petite partie des surnageants décrites ci-dessus pour un nouveau tube et conserver à -80 ° C.</li>
		<li>Lavage 25 µL de 50 % de nickel nitrilotriacétique acides perles de gel d’agarose (Ni-NTA) avec un tampon RIPA deux fois dans un tube à centrifuger-micro 1,5 mL pour chaque échantillon. Collecter les perles par centrifugation à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C.</li>
		<li>Ajouter 1 M imidazole à chaque échantillon pour obtenir une concentration finale de 10 mM. Puis, ajoutez chaque échantillon dans le tube contenant les billes de gel d’agarose préparés Ni-NTA.</li>
		<li>Incuber les perles et les lysats pendant 2 h à 4 ° C, avec une légère rotation. Tourner les talons à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C et retirer délicatement les surnageants de pipetage. Pour éviter la perte de la perle, ne pas aspirer le perles sec.</li>
		<li>Laver les billes avec 1 mL de tampon de lavage contenant imidazole de 20 mM (tableau 1). Chaque fois, les tubes bien mélanger en rotation à 4 ° C pendant 15 min. collecter les perles de la filature à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C et jeter les surnageants.</li>
		<li>Après le lavage final, ajouter 30 µL d’élution tampon imidazole contenant de 250 mM (tableau 1) pour chaque échantillon et balayer pour mélanger. Puis, incuber pendant 20 min à 4 ° C pour éluer les protéines.</li>
		<li>Mélanger chaque échantillon avec tampon de charge 6 × SDS-PAGE (tableau 1). Puis, incuber les tubes à 100 ° C dans un bloc chauffant pendant 10 min.</li>
		<li>Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 1 min granuler les perles. Soigneusement recueillir le surnageant sans déranger les perles et transférer les échantillons pour tubes de centrifugeuse-micro 1,5 ml. Les échantillons peuvent être analysés par Western blot ou conservés à-20 ° C pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol></li></ol> 3. Western Blot <ol><li>charger l’immunoprécipitation ou tirer vers le bas des échantillons prélevés dans les étapes précédentes sur gel SDS-PAGE dégradé de 4 à 20 %. Procéder à l’électrophorèse à 120 V pendant 90 min séparer les protéines.</li>
	<li>Transfert des protéines du gel sur une membrane de polyvinylidène difluoride (PVDF) en electroblotting à 300 mA pendant 90 min à 4 ° C à l’aide de la méthode de transfert du réservoir. Bloquer la membrane en PVDF dans un tampon de bloc contenant 5 % de lait écrémé (tableau 1) pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Incuber la membrane avec l’anticorps primaire dans un tampon de dilution d’anticorps contenant 3 % d’albumine sérique bovine (BSA) (tableau 1) pour la nuit à 4 ° C. Pour les anticorps primaires, utilisez une travail concentration de 0,5 µg/mL (anticorps anti-SUMO1), ou une dilution de 1 : 2000 (anticorps anti-Rb et anti-tubuline) ou 1:5,000 (anti-GFP et anticorps anti-His).</li>
	<li>Laver la membrane 3 x 10 min chaque fois à l’aide de 1 x tampon tris salin avec tampon de Tween (TBST) (tableau 1). Incuber la membrane avec des espèces spécifiques anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort HRP 1:5,000 dilué dans un tampon de bloc contenant 5 % de lait (tableau 1). Laver la membrane 3 x 10 min chaque fois à l’aide de la mémoire tampon x TBST 1.</li>
	<li>Incuber la membrane avec la chimiluminescence améliorée (ECL), solution de travail. Couvrir la membrane d’une pellicule plastique et l’exposer à la radiographie en fonction sur la force de signal.</li>
</ol>

<ol><li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G1+cell-cycle+control+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">G1 cell-cycle control and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).</li>
<li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+and+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein and cell cycle control.</a> Cell. 81 (3), 323-330 (1995).</li>
<li>Giacinti, C., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RB+and+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RB and cell cycle progression.</a> Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).</li>
<li>Burkhart, D. L., Sage, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+tumour+suppression+by+the+retinoblastoma+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene.</a> Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).</li>
<li>Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rb%2Fchromatin+connection+and+epigenetic+control%3A+opinion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion.</a> Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+induces+apoptosis+directly+at+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria.</a> Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).</li>
<li>Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+within+the+pRb+pathway%3A+is+there+a+code+of+conduct%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct.</a> Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).</li>
<li>Macdonald, J. I., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor+protein+as+determinants+of+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function.</a> Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).</li>
<li>Ezhevsky, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypo-phosphorylation+of+the+retinoblastoma+protein+%28pRb%29+by+cyclin+D%3ACdk4%2F6+complexes+results+in+active+pRb%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).</li>
<li>Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+oncoproteins+E1A+and+E7+and+cellular+LxCxE+proteins+repress+SUMO+modification+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor.</a> Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+SUMO-2%2F3+induced+senescence+through+p53-+and+pRB-mediated+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).</li>
<li>Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+Rb+enhances+its+binding+with+CDK2+and+phosphorylation+at+early+G1+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase.</a> Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).</li>
<li>Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+in+sumoylation%3A+a+decade+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concepts in sumoylation: a decade on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).</li>
<li>Flotho, A., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation%3A+a+regulatory+protein+modification+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease.</a> Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).</li>
<li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li>
<li>Wilkinson, K. A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+regulation+and+consequences+of+protein+SUMOylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation.</a> Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).</li>
<li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus%3A+different+functions%2C+similar+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).</li>
<li>Sharma, P., Kuehn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SENP1-modulated+sumoylation+regulates+retinoblastoma+protein+%28RB%29+and+Lamin+A%2FC+interaction+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization.</a> Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).</li>
<li>Jakobs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubc9+fusion-directed+SUMOylation+%28UFDS%29%3A+a+method+to+analyze+function+of+protein+SUMOylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation.</a> Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).</li>
<li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMO+pathway%3A+emerging+mechanisms+that+shape+specificity%2C+conjugation+and+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li>
<li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li>
<li>Saitoh, H., Hinchey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+small+ubiquitin-related+protein+modifiers+SUMO-1+versus+SUMO-2%2F3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.</a> J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).</li>
<li>Ayaydin, F., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+in+vivo+dynamics+of+vertebrate+SUMO+paralogues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cet article décrit un protocole visant à détecter et analyser la SUMOylation endogène de Rb dans les cellules humaines. Comme cette méthode est spécifiquement axée sur la protéine Rb endogène sans aucune modification du signal global de SUMO, c’est un outil important pour enquêter sur les modification de Rb-SUMO dans des circonstances tout à fait naturelles physiologiques.
Pour atteindre cet objectif, il est important de garder à l’esprit que : 1) bien que SUMO comprend quatre isoformes (SUMO1...

Le contrôle précis de la progression du cycle cellulaire dans les cellules eucaryotes repose sur un réseau serré de réglementation, qui s’assure que des événements particuliers se déroulent dans une manière ordonnée1,2. Un des principaux acteurs de ce réseau est la protéine du rétinoblastome (Rb), la première tumeur clonés suppresseur1,3. La protéine Rb est considérée comme un régulateur négatif de la progression du cycle cellulaire, en particulier pour le G0/G1 à transition de phase S et la croissance de tumeur4,5. Défaillance de la fonction de Rb soit conduit directement à la malignité intraoculaire plus courante chez les enfants, rétinoblastome, ou contribue au développement de nombreux autres types de cancer,5. En outre, Rb est impliqué dans plusieurs voies cellulaires dont la différenciation cellulaire, remodelage de la chromatine et l’apoptose médiée par les mitochondries3,6,7.
Modifications post-traductionnelles jouent un rôle essentiel dans la régulation de RB fonction8,9. La phosphorylation est une telle modification, et il conduit généralement à l’inactivation de Rb. Dans les cellules quiescentes G0, Rb est actif avec un niveau faible de phosphorylation. Comme les cellules franchiront phase G0/G1, Rb est séquentiellement hyper-phosphorylés par une série de kinases cycline-dépendante de protéine (CDKs) et cyclines, tels que de la cycline E/CDK2 et cycline D/CDK4/6, qui inactivent Rb et éliminer sa capacité à réprimer le cycle cellulaire associés de gene expression4,10. RB peut également être modifié par petit axés sur l’ubiquitine modificateur (SUMO)11,12,13.
SUMO est une protéine d’ubiquitin-comme qui est de façon covalente à une variété de protéines cibles. Il est crucial pour divers processus cellulaires, y compris la régulation du cycle cellulaire, la transcription, la localisation cellulaire des protéines et dégradation, transport et ADN réparation14,15,16, 17 , 18. voie de conjugaison le SUMO se compose de l’enzyme activatrice E1 SUMO dimère SAE1/UBA2, la seule enzyme de conjugaison E2 Ubc9, multiples E3 ligases et protéases spécifiques SUMO. En règle générale, les protéines SUMO naissantes doivent être traitées de clivage protéolytique pour générer la forme mature. Le SUMO mature est activé par l’hétérodimère E1 et ensuite transféré à l’enzyme E2 Ubc9. Enfin, la glycine C-terminale du SUMO est par covalence conjugué à la lysine de la cible d’un substrat, et ce processus est généralement facilité par l’E3 ligases. La protéine SUMO peut être supprimée de la mis à jour le substrat par des protéases spécifiques. Une étude antérieure par les auteurs de cette étude a révélé que la SUMOylation de Rb augmente sa liaison à CDK2, conduisant à la phosphorylation hyper à la phase précoce de la G1, un processus qui est nécessaire pour la progression de cycle cellulaire13. Nous avons aussi démontré que la perte de SUMOylation Rb provoque une prolifération cellulaire réduite. En outre, il a été démontré récemment que la SUMOylation de Rb protège la protéine Rb de proteasome chiffre d’affaires, ce qui augmente le taux de protéine Rb en cellules19. Par conséquent, la SUMOylation joue un rôle important en fonction de la Rb dans divers processus cellulaires. Afin d’étudier les conséquences fonctionnelles et pertinence physiologique de SUMOylation Rb, il est important de développer une méthode efficace pour analyser l’État SUMO de Rb dans les cellules humaines ou les tissus du patient.
SUMOylation est un processus réversible, très dynamique. Ainsi, il est généralement difficile de détecter les protéines SUMO-modifiées dans des conditions totalement endogènes. Cet article présente une méthode pour détecter la SUMOylation endogène de Rb. En outre, il montre comment détecter exogène Rb SUMOylation de Rb sauvage et sa mutation de SUMO-deficient11. En particulier, Jacobs et coll. décrit une méthode pour augmenter la modification de SUMO d’un substrat donné spécifiquement par Ubc9 fusion dirigée SUMOylation (UFD)20. Selon cette méthode, ce protocole décrit comment analyser la SUMOylation forcé de Rb et ses conséquences fonctionnelles. Étant donné que des centaines de substrats SUMO ont été décrits précédemment et plusieurs substrats SUMO présumés ont été identifiés de nombreuses analyses protéomiques, ce protocole peut être appliqué pour analyser la SUMO-la modification de ces protéines dans les cellules humaines.

<table><tbody><tr><td>Milieu Eagle modifié (DMEM) de DulbeccoThermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>iodure de propidium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp ;</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>N-éthylmaléimide</td><td>sigma</td><td>E3876&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Substitut AMRESCO</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td>Inhibiteur de protéase <td>AMRESCO</td><td>M158</td><td></td></tr><tr><td>Immunoglobuline G (IgG) de souris</td><td></td> Roche 5892970001 <td></td> Biotechnologie Santa Cruz Biotechnologie sc-2025 <td></td></tr><tr><td>Technologie de signalisation cellulaire de l’anticorps</td> <td>Rb</td><td>#9309</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protéine A/G-Perles de Sepharose</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Nickel Acide nitrilotriacétique (Ni-NTA) Perles d’agarose</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>4 %-20 % Gradient SDS-PAGE Gel</td><td>BIO-RAD</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF)</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>AMRESCO</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps antibuline</td><td>Abmart</td><td>M30109</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps SUMO1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-2044</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps GFP</td><td>Abmart</td><td>M20004</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire de la peroxydase de raifort (HRP)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>Kit de chimiluminescence améliorée (ECL)</td><td>Thermo Fisher Scientifique</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo détection et analyse des rb sumoylation de protéines dans les cellules humaines

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Les modifications post-traductionnelles des protéines sont cruciales pour la règlementation propre de transduction de signaux intracellulaires. Parmi ces modifications, petit axés sur l’ubiquitine modificateur (SUMO) est une protéine d’ubiquitin-comme qui est de façon covalente aux résidus lysine d’une variété de protéines cibles pour réguler les processus cellulaires, tels que la transcription des gènes, la réparation de l’ADN, protéine interaction et la dégradation, transport intracellulaire et transduction du signal. L’approche la plus courante à la détection des protéines SUMOylation est basé sur l’expression et purification de protéines recombinantes marqués chez les bactéries, ce qui permet une réaction in vitro biochimique qui est simple et adapté pour l’adressage mécaniste questions. Toutefois, en raison de la complexité du processus de SUMOylation in vivo, il est plus difficile à détecter et analyser les protéines SUMOylation dans les cellules, surtout lorsque des conditions endogènes. Une étude récente menée par les auteurs de cette étude a révélé que la protéine du rétinoblastome endogène (Rb), un suppresseur de tumeur qui est essentiel à la régulation négative de la progression du cycle cellulaire, est spécifiquement SUMOylated au début de la phase G1. Cet article décrit un protocole pour la détection et l’analyse de SUMOylation Rb conditions endogènes et exogènes dans les cellules humaines. Ce protocole est approprié pour l’étude phénotypique et fonctionnelle du SUMO-modification du Rb, ainsi que plusieurs autres protéines SUMO ciblées, dans les cellules humaines.

Pour détecter endogène Rb SUMOylation au cours de la progression du cycle cellulaire, cette étude a tout d’abord synchronisé cellules HEK293 à cinq stades différents du cycle cellulaire (G0, début G1, G1, S et G2/M) tel que décrit dans la section protocole du présent document. La qualité de synchronisation a été confirmée à l’aide de la tache d’acide nucléique avec l’iodure de propidium suivie d’analyse en cytométrie en flux (Figure 1). Ensuite, les cellules ...

Protéines de la famille petit axés sur l’ubiquitine modificateur (SUMO) sont conjugués aux résidus lysine de protéines cibles pour réglementer divers processus cellulaires. Cet article décrit un protocole pour la détection de la protéine du rétinoblastome (Rb) SUMOylation conditions endogènes et exogènes dans les cellules humaines.

In Vivo Détection et analyse des Rb SUMOylation de protéines dans les cellules humaines

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

L'objectif général de cette expérience est de détecter la SUMOylation des protéines de rétinoblastome dans des conditions endogènes et exogènes dans les cellules humaines. Les protéines de la famille du modificateur ubiquitine-like, ou SUMO, sont conjuguées aux résidus de lysine des protéines cibles afin de réguler divers processus cellulaires. Généralement, il est plus difficile d'initier la SUMOylation d'une protéine dans les cellules en raison de la complexité de la SUMOylation in vivo.Cette expérience permet de détecter la SUMOylation des protéines Rb endogènes et exogènes. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la SUMOylation des protéines Rb, elle convient également à la détection de nombreuses autres protéines cibles de la SUMOylation dans les cellules. Pour commencer, ajoutez 25 millilitres de DMEM contenant un pour cent de pénicilline-streptomycine, puis incubez les cellules HEK293 à 37 degrés Celsius pendant 72 heures.Lavez les cellules depuis la plaque en utilisant trois millilitres de PBS glacé. Ensuite, transférez les cellules dans un nouveau tube de cinq millilitres. Pour obtenir des cellules en phase G1 à la fin du processus de synchronisation en G0, retirez le DMEM et ajoutez du milieu de croissance frais, permettant ainsi aux cellules HEK293 de réintégrer le cycle cellulaire.Ensuite, récolter les cellules à différents stades de la phase G1 pour l'analyse du cycle cellulaire et pour des essais SUMO supplémentaires. Pour synchroniser les cellules HEK293 en phase S, utiliser la méthode de blocage double par la thymidine. Dans un premier temps, cultiver les cellules HEK293 jusqu'à une confluence de 50 %. Puis laver les cellules avec du PBS préchauffé.Ajouter du milieu de croissance supplémenté avec 2,5 millimolaire de thymidine pendant 18 heures comme premier blocage. Retirer le milieu contenant la thymidine et laver les cellules deux fois avec du PBS préchauffé. Ajouter du milieu de croissance frais pendant 14 heures pour relâcher les cellules du blocage.Après avoir relâché les cellules du premier bloc, éliminer le milieu à l’aide d’une pipette. Ensuite, ajouter du milieu de croissance supplémenté avec 2,5 millimolaire de thymidine pendant encore 18 heures, constituant ainsi le deuxième bloc, avant de procéder à l’analyse du cycle cellulaire et de la SUMOylation de Rb. Pour la synchronisation en phase G2 ou M, ensemencer environ 15 millions de cellules HEK293 dans une boîte de 15 centimètres contenant 25 millilitres de milieu de croissance, et les faire croître pendant 24 heures.Ensuite, ajoutez du nicotisol au milieu jusqu'à l'obtention d'une concentration finale de 400 nanogrammes par millilitre. Enfin, incubez les cellules pendant 16 heures avant de réaliser l'analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux, comme décrit dans le protocole écrit. Lysez les cellules HEK293 synchronisées en les resuspendant doucement dans un millilitre de tampon de lyse RIPA (radioimmunoprécipitation assay) glacé contenant un inhibiteur d'isopéptidase ajouté fraîchement pour bloquer les protéases SUMO et stabiliser les conjugués SUMO.Continuer à homogénéiser les cellules sur de la glace en les faisant passer 10 fois à travers une aiguille de 21 gauge fixée à une seringue de deux millilitres. Incuber ensuite les cellules sur de la glace pendant cinq minutes. Puis, centrifuger les lysats cellulaires à 18000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Après la centrifugation, transférez les surnageants dans de nouveaux tubes microcentrifuge de 1,5 millilitre. Aux surnageants, ajoutez un microgramme d'immunoglobuline G de souris non spécifique de la même espèce et du même isotype que l'anticorps monoclonal Rb. Ajoutez également 20 microlitres de suspension à 50 pour cent de protéine AG Sepharose, puis incubez le mélange pendant une heure à quatre degrés Celsius avec une rotation douce.Centrifuger les échantillons à trois mille fois g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Collecter soigneusement les surnageants sans perturber les billes et les transférer dans de nouveaux tubes microcentrifugeurs de 1,5 mL. À chacun des échantillons, ajouter 5 µL d'anticorps primaire rb et 40 µL de suspension en tampon salin de protéine A sépharose à 50 %, puis incuber les échantillons toute la nuit à quatre degrés Celsius avec une rotation douce.Après centrifugation, lavez les billes avec un millilitre de tampon rifa. Mélangez bien les tubes par rotation à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, récupérez les billes par une centrifugation à faible vitesse comme précédemment et jetez les surnageants.Après avoir effectué le lavage quatre fois, resuspendre les billes dans 30 microlitres de tampon de charge pour électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécylsulfate de sodium à 1x et bien mélanger. Incuber les tubes à 100 degrés Celsius dans un bloc chauffant pendant 10 minutes. Centrifuger les échantillons à 12 000 ×g pendant une minute afin de former un culot de billes.Enfin, recueillir soigneusement les surnageants sans perturber les billes et les transférer dans des tubes microcentrifuges de un virgule cinq millilitre. Réaliser la transfection en culture cellulaire et la lyse des cellules HEK293 comme décrit dans le protocole écrit. Puis laver vingt-cinq microlitres de billes d’agarose à cinquante pour cent de nickel nitrilotriacétique avec du tampon RIPA dans un tube microcentrifuge de un virgule cinq millilitre pour chaque échantillon.Récupérez les billes par centrifugation à trois mille fois g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Ajoutez un molaire d'emytozol à chaque échantillon afin d'obtenir une concentration finale de 10 millimolaire. Puis ajoutez chaque échantillon au tube contenant les billes d'agarose préparées.Incuber les billes et les lysats pendant deux heures à quatre degrés Celsius avec une rotation douce. Ensuite, centrifuger les billes à trois mille fois g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, retirer soigneusement les surnageants par pipetage.Pour éviter la perte de billes, ne pas aspirer complètement le liquide. Ensuite, laver les billes avec un millilitre de tampon de lavage contenant 20 millimolaire d'emytozol. Mélanger soigneusement les tubes par rotation à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes avant de récupérer les billes par centrifugation.Après le dernier lavage, ajouter 30 microlitres du tampon Eleusian contenant 250 millimolaire d&#39;emitozol à chaque échantillon et agiter doucement pour mélanger. Incuber ensuite les échantillons pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius afin d&#39;éluer les protéines. Mélanger chaque échantillon avec un tampon de charge SDS-PAGE 6 x.Incubez ensuite les tubes à 100 degrés Celsius dans un bloc chauffant pendant 10 minutes. Après centrifugation, chargez les échantillons d'immunoprécipitation ou de pull-down sur des gels SDS-PAGE en gradient de 4 % à 20 %. Réalisez l'électrophorèse à 120 volts pendant 90 minutes afin de séparer les protéines.Après la synchronisation du cycle cellulaire et l'immunoprécipitation des espèces endogènes de rb, la présence du signal SUMO a été spécifiquement détectée par un anticorps anti-SUMO au début de la phase G1. Les résultats représentatifs montrent la SUMOylation forcée de la protéine rb par fusion directe de l'enzyme SUMO E2, UBC9, à son extrémité C-terminale. Remarquez la protéine rb SUMOylée qui migre le plus lentement.En utilisant le mutant déficient en SUMO de rb, K720R, la présence de la SUMOylation de rb dans les cellules est davantage confirmée. Ainsi, dans cette procédure, de nombreuses autres protéines cibles de la SUMOylation peuvent être analysées dans des cellules en culture. Dans la plupart des cas, seule une très petite fraction d'un substrat est SUMOylée ; il est donc important, lors de la réalisation de cette procédure, d'optimiser l'efficacité de l'immunoprécipitation.

in-vivo-detection-analysis-rb-protein-sumoylation-human

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cette vidéo montre la méthode in vitro de SUMOylation des protéines de substrat à l’aide d’une cascade enzymatique séquentielle. De plus, l’état SUMOylé de la protéine est identifié à l’aide de la technique d’électrophorèse et d’immunobuvardage.

Dosage de SUMOylation : une technique in vitro pour détecter l’état de SUMOylation des protéines de substrat par immunobuvardage

Balises bimoléculaires Ratiométrique (de RBMBs) peuvent être utilisés pour une seule image transcrits d'ARN modifiées dans les cellules vivantes. Ici, nous décrivons la préparation et la purification de RBMBs, livraison de RBMBs dans les cellules par microporation et l'imagerie de fluorescence de transcrits d'ARN simples en temps réel.

Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

Ce manuscrit décrit la détection de la sumoylation de protéines et ubiquitination kinétochoriens, Ndc10 Ndc80 et, dans le bourgeonnement levure Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80

Les interactions protéine-protéine peuvent se produire à la fois dans le noyau et le cytoplasme d’une cellule. Pour étudier ces interactions, la co-immunoprécipitation traditionnelle et le test moderne de ligature de proximité sont appliqués. Dans cette étude, nous comparons ces deux méthodes pour visualiser la distribution des interactions NF90-RBM3 dans le noyau et le cytoplasme.

Visualisation des interaction protéine-protéine en nucléaire et cytoplasmique Fractions par Co-immunoprécipitation et<em&gt; In Situ</em&gt; Proximité Ligation Assay

Les auteurs décrivent un protocole pour identifier des protéines de liaison à l’ARN et de cartographier leurs régions de liaison à l’ARN dans des cellules vivantes psoralen médiée par les UV et spectrométrie de masse.

Préparation de l’échantillon d’Identification basé sur la spectrométrie de masse des régions de liaison à l’ARN

Contrairement à l’ubiquitine ligases, quelques ligase E3 SUMO ont été identifiés. Ce modifié in vitro SUMOylation protocole est capable d’identifier de nouveaux SUMO E3 ligases par un essai de reconstitution in vitro .

In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO

Nous présentons ici un protocole visant à développer un système inductible dominant négatif, dans lequel toute protéine peut être inactivée conditionnellement par réversiblement surexprimant une version mutante dominant négatif de celui-ci.

Inhibition de protéine inductible et réversible Dominant négatif (DN)

Le SUMO est une protéine modificatrice essentielle et très conservée, de petite taille, comme l’ubiquitine. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’une protéine de piégeage de SUMO recombinant tolérante au stress (kmUTAG) pour visualiser les conjugués de SUMO natifs et non marqués et leur localisation dans une variété de types de cellules.

Localisation des protéines modifiées par SUMO à l’aide de protéines de piégeage du sumo fluorescent

Ici, nous présentons un protocole pour enrichir, isoler, identifier, et caractériser des protéines modifiées par SUMO in vivo à la fois à partir de cellules humaines d'hépatome et de tumeurs hépatiques obtenues à partir de modèles murins du carcinome hépatocellulaire en utilisant des entités reliures SUMO (SUBEs).

SumO-Binding Entities (SUBEs) comme outils pour l'enrichissement, l'isolement, l'identification et la caractérisation du protéome SUMO dans le cancer du foie

Ce protocole vise à établir des protéomes spécifiques à l'ubiquitine (Ubquitin) et à l'ubiquitine (Ubls) afin d'identifier les altérations de ce type de modifications post-traductionnelles (PTM), associées à une condition spécifique telle qu'un traitement ou un phénotype.

Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes

Ces protocoles fournissent la méthodologie utilisée pour évaluer l’activité enzymatique de membres individuels de la famille de la méthyltransférase d’arginine de protéine (PRMT) dans les cellules. Des directives détaillées sur l’évaluation de l’activité de PRMT utilisant des biomarkers endogènes et exogènes, la méthyl-arginine reconnaissant des anticorps, et les composés d’outil d’inhibiteur sont décrites.

Méthodes quantitatives pour étudier l’activité de la protéine Arginine méthyltransférase 1-9 dans les cellules

Apprenez à détecter la SUMOylation des protéines Rb dans les cellules humaines HEK293. Cette méthode permet d'analyser les modifications protéiques endogènes et exogènes pour comprendre les processus cellulaires.

In Vivo Détection et analyse des Rb SUMOylation de protéines dans les cellules humaines

Explorer plus de vidéos