Le c. elegans intestin comme un modèle intercellulaires Lumen morphogenèse et In Vivo polarisé la biogenèse membranaire au niveau unicellulaire : marquage par des anticorps, RNAi perte de fonction analyse et imagerie

L’objectif global de cette combinaison de méthodes standard est de démontrer comment l’intestin de C. elegans peut être utilisé pour l’analyse in vivo de la biogenèse membranaire polarisée et de la morphogenèse de la lumière aux niveaux unicellulaire et subcellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la polarité et de la biogenèse, telles que la façon dont les domaines membranaires apicaux par rapport aux domaines membranaires basolatéraux et d’autres asymétries subcellulaires sont établis et maintenus pendant et après la morphogenèse. Le principal avantage de ce système modèle est que cette couche unique transparente de seulement 20 cellules peut survivre in vivo à la chambre tissulaire pour disséquer la biogenèse de la membrane polarisée et de la lumière d’une seule cellule.

Les techniques peuvent être étendues à l’analyse d’autres phénotypes de morphogenèse de C. Elegans, l’accent est mis ici sur l’analyse de la biogenèse membranaire, en particulier sur la biogenèse de la membrane apicale et de la lumière. Les procédures comprennent des techniques d’imagerie raffinées chez des animaux fixes et vivants pour distinguer les domaines membranaires et les composants subcellulaires et pour identifier les phénotypes de morphogenèse de la lumière dans un intestin de C. elegans. Cette vidéo sur la tubulogenèse intestinale est accompagnée d’une vidéo sur les modèles mutuellement informatifs de tubulogenèse du canal excréteur où l’analyse in vivo de la biogenèse membranaire polarisée.

En ce qui concerne le marquage, la génération d’animaux transgéniques avec des protéines de fusion marquées par fluorescence pour l’imagerie en direct est décrite dans la vidéo d’accompagnement sur l’analyse de la tubulogenèse du canal excréteur. De tels animaux peuvent être directement utilisés dans des expériences sur l’ARNi. La troisième génération est généralement la première étape de cette combinaison de procédures.

Cette vidéo commence par la méthode d’étiquetage alternative : la coloration des anticorps pour laquelle les animaux doivent être réparés. Les différentes procédures de marquage peuvent être combinées à l’immunohistochimie généralement utilisée pour l’analyse d’imagerie finale. Ce protocole contient également des exemples de marqueurs membranaires spécifiques à l’intestin, de promoteurs et d’autres ressources utiles pour les deux procédures de marquage.

Après avoir démontré l’immunohistochimie, cette vidéo utilise une souche transgénique qui marque la membrane apicale intestinale avec la GFP ERM-1 pour rechercher des phénotypes de polarité et de morphogenèse de la lumière à l’aide de l’ARNi. Préparez d’abord une diapositive pour réparer les vers. Pipetez 30 microlitres de poly-L-lysine sur une lame, puis placez une deuxième lame sur l’autre et déposez-les ensemble pour répartir uniformément la solution sur les deux.

Maintenant, séparez les deux lames et laissez-les sécher à l’air libre pendant 30 minutes. Ensuite, placez un bloc métallique plat dans un récipient rempli d’azote liquide. Lavez les plaques avec la solution M9 et transférez environ 10 microlitres de M9 contenant les vers.

Vous pouvez également choisir les vers et ajouter M9 à la diapositive. Une fois que les vers sont transférés, déposez doucement une lamelle de couverture en travers sur eux de sorte que la lamelle de couverture pend d’un bord. Appuyez ensuite doucement sur la lamelle sans faire de mouvements latéraux.

Maintenant, transférez immédiatement la lame sur le bloc métallique dans de l’azote liquide et laissez-la geler. Après cinq minutes, retirez la lamelle à l’aide du bord en surplomb. Faites-le rapidement pour obtenir la bonne fissure de la cuticule.

Ensuite, plongez la lame dans un bocal en verre Coplin rempli de méthanol à moins 20 degrés Celsius. Après cinq minutes, transférez la lame dans un bocal Coplin en verre rempli d’acétone pendant encore cinq minutes à la même température. Les lames peuvent être teintées directement ou stockées à moins 20 degrés Celsius.

Retirez la lame de l’acétone et laissez-la sécher à l’air libre à température ambiante. Ensuite, marquez l’emplacement d’une paroi circulaire de vaseline sur la face inférieure de la lame, puis construisez la paroi de gelée. Ne frottez pas la gelée pendant cette procédure.

Ensuite, préparez une chambre humide dans un bac avec des serviettes en papier humides et placez la diapositive sur une grille à l’intérieur. Il ne doit y avoir aucun contact entre les serviettes et le toboggan ou entre les toboggans adjacents. Maintenant, pipetez suffisamment de PBS dans le cercle de gelée pour couvrir la zone.

Placez délicatement une pointe de pipette sur le bord du cercle et laissez le liquide se disperser en douceur sur les vers. Fermez ensuite le couvercle et attendez cinq minutes. Après cinq minutes, inclinez la lame et aspirez lentement le PBS en prenant soin de ne pas perdre les vers de la lame.

Ensuite, remplissez soigneusement le cercle de gelée avec une solution de blocage fraîchement préparée. Et laissez la diapositive incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Après 15 minutes, remplacez la solution bloquante par une solution bloquante contenant l’anticorps primaire.

Et incubez la lame à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, retirez l’anticorps primaire et lavez la lame en appliquant et en retirant la solution de blocage trois fois. Laissez chaque application de bloc incuber pendant 10 minutes.

Ajoutez ensuite l’anticorps secondaire dilué dans une solution bloquante et incubez la lame pendant une heure à température ambiante. Ensuite, lavez la lame deux fois avec une solution de blocage, puis une fois avec du PBS. Ensuite, retirez autant de PBS que possible sans laisser l’échantillon sécher et retirez soigneusement la gelée autour de l’échantillon.

Appliquez une goutte de support de montage sur l’échantillon, suivie d’une lamelle et d’un joint de vernis à ongles. Stockez ensuite les diapositives dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Transférez la plaque de la bibliothèque d’ARNi de moins 80 degrés Celsius sur de la glace sèche.

Retirez le ruban d’étanchéité. Et transférez le clone d’intérêt sur une vis sans fin sélective. Ensuite, striez le clone et cultivez les bactéries pendant la nuit.

Avant de remettre la plaque de bibliothèque dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius, appliquez un nouveau ruban d’étanchéité. Le lendemain, inoculez les colonies de la plaque dans des aliquotes d’un millilitre de milieu liquide contenant de l’ampicilline. Ensuite, secouez-les pendant environ 14 heures à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, semez 200 microlitres par clone sur des plaques d’ARNi séparées. Laissez sécher les plaques et induisez la production d’ARNi avec une incubation d’une nuit à température ambiante. Un jour plus tard, transférez cinq vers de stade L4 à chaque plaque d’ARNi marquée avec le gène spécifique ciblé.

Transférez ensuite les plaques dans un incubateur, généralement à 20 degrés Celsius. Examinez d’abord le contrôle par rapport aux animaux ARNi sous une lumière vive à faible et fort grossissement. Ensuite, examinez les animaux témoins par rapport aux animaux ARNi sous une lumière fluorescente sous les filtres appropriés.

Scannez systématiquement une plaque contenant des animaux ARNi du coin supérieur gauche au coin inférieur droit de l’ensemble de la plaque à la recherche de phénotypes. Recherchez les animaux qui vous intéressent. Pour un examen plus approfondi des phénotypes ARNi sélectionnés, concentrez-vous sur l’intestin et utilisez le zoom pour évaluer les phénotypes de tubulogenèse et de morphogenèse de la lumière.

Pour examiner les vers d’intérêt en microscopie confocale, montez d’abord et immobilisez-les à la main, faites un mince cercle de graisse sous vide ou de vaseline sur une lame de verre. La couche de graisse ne doit pas dépasser 0,1 millimètre d’épaisseur. Ensuite, ajoutez environ 3,5 microlitres d’azoture de sodium de 10 millimolaires au milieu du cercle.

Ensuite, choisissez rapidement les vers d’intérêt dans la solution sous un microscope à dissection avant que la solution ne sèche. Ensuite, appliquez doucement une lamelle et imagez les animaux dans les 30 minutes. Utilisez une légère pression et vérifiez au microscope que les vers ne flottent pas dans la solution.

Sous le microscope confocal, trouvez les vers sous une faible puissance et une mise au point. Ensuite, utilisez un objectif d’immersion dans l’huile 60 ou 100X pour voir et imager l’intestin. Ensuite, examinez l’animal sous une lumière fluorescente avec le canal approprié pour sélectionner les zones qui présentent le défaut cellulaire d’intérêt.

Déplacez-vous rapidement pour éviter le blanchiment des photos. Passez ensuite au balayage laser et limitez l’image à l’intestin en fixant des limites de balayage sur ses faces dorsale et ventrale. Capturez une série d’images et fusionnez ensuite les images en une seule image de projection.

Ce protocole décrit comment analyser moléculairement et disséquer visuellement la biogenèse membranaire polarisée dans l’intestin en développement de C. elegans où la morphogenèse de la membrane apicale et de la lumière coïncident. Les domaines membranaires apical et basolatéral, les jonctions associées à la membrane et la lumière intestinale ont pu être résolus et leur relation les uns avec les autres a pu être examinée tout au long du développement. Ces composants subcellulaires pourraient être marqués par des anticorps marqués par fluorescence ou des protéines de fusion fluorescentes pour un double ou un triple marquage, comme décrit dans l’article ci-joint.

Les défauts de lumière macroscopique pouvaient être rapidement balayés à l’aide d’un microscope à fluorescence dissectionnante. Le linker du cytosquelette des membranes apicales ERM-1 couplé à la GFP est un marqueur fortement exprimé utile pour un criblage d’ARNi. Une série de nouveaux phénotypes de morphogenèse et de polarité de la lumière intestinale, ainsi que leurs défauts génétiques sous-jacents, ont été découverts lors de l’utilisation de ce marqueur.

Ensuite, des images à plus fort grossissement acquises par un balayage laser confocal ont été utilisées pour examiner plus attentivement les phénotypes afin de mieux comprendre les défauts sous-jacents. Certains phénotypes ont pu être quantifiés. La quantification a été utilisée pour comparer ces défauts et suivre leur progression au cours du développement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer les compartiments de la membrane intestinale et de l’endomembrane par immunocoloration et comment analyser les phénotypes de fonction ARNi de la biogenèse de la membrane polarisée et de la lumière.