Stéréologique Estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra de souris à l’aide de l’optique fractionnateur et l’équipement de microscopie Standard
1 septembre 2017
Cet ouvrage présente un protocole étape par étape pour l’estimation non biaisée stéréologique des numéros des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra de souris à l’aide d’équipement de microscopie standard (c'est-à-dire, un microscope optique, une table objet motorisé (x, y, z avion) et le logiciel du domaine public pour l’analyse d’image numérique.
L’objectif général de ce protocole est de décrire l’estimation stéréologique basée sur la conception du nombre de cellules dopaminergiques dans le SN de souris à l’aide d’un équipement de microscopie standard. Cette méthode est utile pour estimer le nombre de neurones dopaminergiques dans la substance noire de la souris pour la recherche préclinique sur la maladie de Parkinson à l’aide d’une stéréologie non biaisée basée sur le modèle. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée avec un équipement de microscopie standard sans avoir besoin d’une configuration stéréologique complète disponible dans le commerce.
Louisa Friez, une technicienne de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par placer un cerveau de souris fixé au paraformaldéhyde dans une matrice cérébrale et faites une coupe à plus de 0,74 millimètre du bregma. Transférez la partie caudale du cerveau, y compris le SN, dans 4 % de PFA dans 0,1 molaire et fixez-le pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, remplacez le PFA par 30 % de saccharose dans du PBS 0,1 molaire et incubez pendant deux autres jours à quatre degrés Celsius pour cryoprotéger l’échantillon. Après deux jours, lorsque le cerveau a coulé dans le saccharose, placez le tissu dans un cryomoule rempli d’un composé à température de coupe optimale et congelez lentement le tissu dans de l’isopentane refroidi à la glace sèche liquide. Utilisez un cryostat pour couper en série des sections cryogéniques de 30 microns dans le plan coronal.
Marquez l’hémisphère droit en perçant un petit trou dans la région supérieure du tronc cérébral. Collectez quatre séries de sections commençant à moins 2,46 millimètres de bregma et se terminant à 4,04 millimètres de bregma. Transférez chaque série de sections dans un tube rempli de cryoprotecteur et conservez-le à moins 20 degrés Celsius.
Capturez des images numériques de coupes SN colorées par immunohistochimie à l’aide d’un logiciel d’imagerie couplé à un microscope. Commencez par déterminer le montage et l’épaisseur réels des sections sur trois sites de comptage par section choisis au hasard. Cliquez d’abord sur la vue du décalage supérieur pour définir le haut de la section.
Cliquez ensuite sur arrêter la vue en haut. Ensuite, cliquez sur le décalage inférieur de la vue, puis cliquez sur la vue d’arrêt du bas. Notez l’épaisseur de la section.
Calculez la zone de garde en soustrayant trois microns du décalage supérieur et tapez le résultat dans la case Décalage supérieur. Soustrayez ensuite la hauteur de 13 microns du dissecteur optique du nombre de décalage supérieur et tapez le résultat dans la case de décalage inférieur. Sélectionnez les paramètres suivants, étapes 14, taille 1,00.
Sélectionnez le répertoire dans lequel vous souhaitez enregistrer le fichier. Cliquez sur la séquence pour lancer l’acquisition. Une fois les images acquises, cliquez sur traitement et sélectionnez les paramètres suivants, tous les plans de la séquence, du montage et des zones rapides et d’assemblage avec un chevauchement d’images de 10 %Commencez à assembler les images en cliquant sur démarrer.
Cela générera des images de pile pour l’analyse. Pour commencer, ouvrez l’image en cliquant sur fichier et ouvrez. Définissez l’échelle de l’image à l’aide de la commande analyser et définir l’échelle.
À partir de cette étape, modifiez la taille définie de pixels en microns. Sélectionnez la commande plugins puis grille puis lignes de type grille pour insérer une grille au hasard. Cochez la case Décalage aléatoire.
Définissez la taille d’un carré dans la grille comme étant de 130 microns par 130 microns pour être égal à 16 900 microns carrés. Changez le type d’image de 16 bits à la couleur RVB en cliquant sur l’image, puis tapez puis couleur RVB. Localisez la substantia nigra pars compacta.
Encerclez la région avec l’outil pinceau à l’aide d’une largeur de pinceau de 11. Annulez la commande set scale en cliquant sur analyze puis set scale puis cliquez pour supprimer scale pour calculer en pixels plutôt qu’en microns. Faites une capture d’écran, enregistrez le fichier image et ouvrez le nouveau fichier avec ImageJ.
Sélectionnez un pinceau et une largeur de pinceau de 25. Marquez chaque carré de la grille qui entre en contact avec le SN pour l’emplacement d’un dissecteur optique. Sélectionnez un carré de grille qui inclut des parties du SN. Mesurez le coin supérieur gauche du carré avec le curseur dans ImageJ pour définir les coordonnées x et y de départ.
Sélectionnez le modèle de tableur intitulé Position du dissecteur optique et calculez la position du dissecteur optique. Estimez ensuite le nombre de cellules à l’aide de la feuille de calcul du nombre de cellules décrite dans la partie écrite du protocole. Cette image de faible puissance montre une section du cerveau d’une souris après coloration TH pour les neurones dopaminergiques.
Un grossissement plus élevé représente des neurones dopaminergiques TH positifs. L’encart montre la région encadrée à un grossissement accru. Cette image montre une série de sections SN colorées au TH couvrant l’ensemble du SN de la souris, du rostral au caudal.
Chaque section est séparée de la section consécutive par 120 microns. Le nombre de neurones TH positifs chez les souris droite et gauche a été estimé à l’aide de la méthode présentée dans cette vidéo et à l’aide d’un système de stéréologie disponible dans le commerce. Comme on l’a vu ici, les deux méthodes ont donné lieu à des numérations cellulaires comparables et il n’y avait pas de différences significatives entre les ensembles de données.
N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’équipements de protection individuelle comme des gants de protection doivent toujours être prises lors de cette procédure. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une estimation stéréologique impartiale du nombre de neurones dopaminergiques dans la substance noire de la souris à l’aide de la méthode de la fraction optique et d’un équipement de microscopie standard.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article décrit un protocole d'estimation stéréologique impartiale du nombre de cellules neuronales dopaminergiques dans la substance noire de la souris, en utilisant des outils microscopiques standards. La méthode vise à faciliter la recherche préclinique sur la maladie de Parkinson en offrant une approche fiable de quantification cellulaire, sans nécessiter de systèmes stéréologiques spécialisés.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Recherche sur la maladie de Parkinson
Contexte
- Les neurones dopaminergiques sont essentiels pour le contrôle moteur.
- La substance noire est une région clé affectée dans la maladie de Parkinson.
- La stéréologie impartiale fournit une méthode quantitative robuste.
- Un équipement microscopique standard rend la technique accessible.
Objectif de l'étude
- Établir un protocole étape par étape pour la quantification neuronale.
- Utiliser la stéréologie sans biais fondée sur un plan d'expérience chez des modèles murins vivants.
- Permettre des études précliniques examinant la perte de neurones dopaminergiques.
Méthodes utilisées
- Microscopie standard incluant la microscopie optique et un logiciel d'analyse d'images numérique.
- Substance noire de souris comme modèle biologique.
- Fixation, cryoprotection et sectionnement détaillés du tissu cérébral de souris.
- Imagerie numérique et techniques spécifiques d'immunohistochimie.
- Mesures et calculs minutieux pour déterminer le nombre de neurones.
Résultats principaux
- Démonstration d'une estimation précise des neurones dopaminergiques dans la substance noire.
- Les méthodes standard et avancées ont produit des décomptes neuronaux comparables.
- Importance accordée à la fiabilité de la méthode à l'aide d'outils standard.
Conclusions
- La présente étude propose une approche réalisable pour quantifier les populations neuronales en recherche.
- Elle améliore la compréhension de la perte neuronale dans la maladie de Parkinson.
- Elle utilise des outils facilement accessibles, favorisant une application plus large dans les études en neurosciences.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La quantification précise de la perte des neurones dopaminergiques dans la substance noire est un critère d'évaluation essentiel dans la recherche préclinique sur la maladie de Parkinson, fournissant directement des informations pour la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques des stratégies neuroprotectrices. Ce protocole permet une estimation stéréologique fiable et sans biais à l’aide d’un équipement microscopique standard, réduisant ainsi la dépendance vis-à-vis des systèmes spécialisés de stéréologie et améliorant l’accessibilité pour les flux de travail en biologie de la découverte. En fournissant des données quantitatives et reproductibles sur le nombre de cellules, cette méthode renforce la confiance prédictive dans les tests d’hypothèses sur les cibles en phase précoce ainsi que dans les décisions de priorisation des portefeuilles de recherche.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en fournissant une quantification impartiale de la survie des neurones dopaminergiques dans les modèles précliniques de la maladie de Parkinson.
- Valeur opérationnelle : Soutient la détection biologique des risques grâce à une stéréologie fondée sur le plan expérimental, qui minimise les biais de l'observateur et la variabilité technique dans les études d'engagement ciblé.
- Valeur prédictive : Génère des données quantitatives de comptage neuronal qui aident à évaluer l'efficacité de la modulation ciblée et à orienter les décisions d'aller ou de ne pas aller de l'avant en phase de découverte précoce.
Élaboration de tests et criblage
- Prêt-à-l'emploi du test : Produit des résultats histologiques standardisés et quantitatifs, adaptés à la validation de composés actifs visant à préserver l'intégrité des neurones dopaminergiques.
- Reproductibilité : Fournit des mesures de dénombrement cellulaire cohérentes entre les sections et les animaux, facilitant la standardisation du test pour l'évaluation de composés en aval.
- Extensibilité : Compatible avec les microscopes standards et les logiciels d'analyse d'images, permettant une adoption plus large sur diverses plates-formes de découverte sans matériel spécialisé.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise directement la perte de neurones dopaminergiques dans la substance noire, une caractéristique pathologique centrale de la maladie de Parkinson, renforçant ainsi la validité translationnelle.
- Continuité préclinique : Établit un lien quantitatif entre le criblage de découverte et la validation préclinique en fournissant des données comparables à celles des systèmes commerciaux de stéréologie.
- Progression ajustée au risque : Permet de prendre des décisions objectives fondées sur des données concernant la progression des composés, en s'appuyant sur des métriques statistiquement robustes de survie neuronale.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur la cible à l'identification de composés actifs, puis à l'évaluation de l'efficacité préclinique, en fournissant un résultat histologique quantitatif qui éclaire la compréhension mécanistique et renforce la confiance dans la cible.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en quantifiant les populations de neurones dopaminergiques comme indicateur fonctionnel de la modulation des voies dans les modèles précliniques.
- Tri : Génère des résultats quantitatifs reproductibles fondés sur l'imagerie, permettant une comparaison fiable des effets des composés sur la survie neuronale.
- Analyse : Fournit des données numériques de dénombrement cellulaire et une comparabilité statistique entre les groupes expérimentaux, facilitant les comparaisons de conditions fondées sur les données.
- Recherche translationnelle : S'aligne sur la pathologie de la maladie de Parkinson en mesurant la perte de neurones dans une région cérébrale pertinente pour la maladie, soutenant ainsi une validation préclinique conforme aux biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Met en place un protocole de stéréologie standardisé et accessible, pouvant être appliqué à plusieurs programmes de découverte en neurosciences sans nécessiter d'équipements coûteux.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à une quantification stéréologique impartiale fondée sur le plan expérimental.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation entre laboratoires en utilisant des outils d'imagerie microscopique et d'analyse d'images largement accessibles.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en éliminant le besoin de systèmes spécialisés de stéréologie, tout en maintenant la comparabilité des données avec les plateformes commerciales.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats précliniques fondée sur des données quantitatives, validées histologiquement, de préservation des neurones dopaminergiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en histologie, en immunohistochimie et en principes stéréologiques pour une préparation adéquate des tissus et une identification précise des régions.
- Repose sur l'utilisation d'un microscope motorisé doté d'un contrôle selon l'axe z et d'un logiciel d'assemblage d'images pour l'analyse systématique des sections.
- Exige une standardisation inter-équipes des protocoles de coloration, de l'épaisseur des sections et des règles de comptage afin d'assurer la reproductibilité entre différents sites.
- L'adaptation à d'autres régions cérébrales ou à d'autres types de neurones peut nécessiter des ajustements des paramètres de coloration, de la taille de la grille et des dimensions du dissector optique.
- Les limites pratiques incluent la dépendance à la qualité des sections et la nécessité d'une formation rigoureuse pour maintenir la précision du comptage et éviter les biais d'échantillonnage.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
- Valeur scientifique : La réplication sur plusieurs sections et animaux tient compte de la variabilité biologique et technique, renforçant la confiance que les décomptes de neurones observés reflètent de véritables effets expérimentaux plutôt que des artefacts d'échantillonnage.
- Valeur opérationnelle : Des protocoles d'échantillonnage cohérents réduisent la variabilité entre opérateurs et favorisent la standardisation entre laboratoires, ce qui est essentiel pour les projets de découverte multicentriques.
