Une méthode standardisée pour mesurer la surface interne du poumon par la pneumonie et la prothèse

L’objectif global de cette procédure est de mesurer avec précision la surface interne d’un poumon de souris après une pneumonectomie et l’implantation d’une prothèse. Cette méthode permet d’analyser les fonctions morphologiques et physiologiques du poumon dans la régénération pulmonaire adulte induite par la force mécanique. Le principal avantage de cette technique est de quantifier avec précision la surface interne des poumons, ce qui promet d’augmenter la fiabilité et la reproductibilité de l’état de la fonction pulmonaire.

Préparez la souris pour la chirurgie sur une plate-forme d’intubation avec sa face ventrale accessible. Ensuite, tirez la langue et inspectez les cordes vocales avec un laryngoscope pour petit animal compatible avec les cathéters de guidage. Ensuite, insérez doucement une canule d’intubation intraveineuse de calibre 20 dans la trachée à un angle intérieur.

Ensuite, placez la souris en position couchée latérale droite et connectez la canule à un ventilateur mécanique. Observez le thorax pour juger de l’insertion de la canule dans la trachée. Réglez la pression inspiratoire à 12 centimètres d’eau et réglez la fréquence respiratoire à 120 respirations par minute.

Maintenant, nettoyez la peau exposée avec au moins trois gommages alternés de bétadine et d’éthanol à 70 %. Ensuite, commencez la chirurgie par une incision thoracotomique postérolatérale de deux à trois centimètres dans le cinquième espace intercostal. Pénètre la musculature à l’aide de ciseaux à ressort Noyes.

Ensuite, faites une incision de 1,5 centimètre pour exposer le poumon gauche. Au besoin tout au long de la chirurgie, utilisez un cautériseur à haute température pour arrêter le saignement. Ensuite, soulevez 1/3 du lobe pulmonaire gauche de la poitrine avec une pince à pointe émoussée et utilisez un coton-tige pour retirer tout le poumon gauche.

Maintenant, identifiez l’artère pulmonaire et les bronches du lobe pulmonaire gauche, et ligaturez étroitement les bronches et les vaisseaux du hile avec une suture chirurgicale trempée. Ensuite, coupez le lobe pulmonaire gauche à trois ou quatre millimètres de la ligature, en faisant attention de ne pas couper la suture, ce qui pourrait entraîner un pneumothorax. Ensuite, fermez la paroi thoracique avec une suture.

Ensuite, cousez la couche musculaire et la couche cutanée séquentiellement, en utilisant cinq à six sutures interrompues avec des espaces de trois à quatre millimètres. Assurez-vous de garder l’aiguille de suture chirurgicale loin du cœur. La ponction cardiaque est mortelle.

Enfin, désinfectez la zone chirurgicale avec de la povidone iodée. Ensuite, placez la souris sur un pad thermique à 38 degrés Celsius. Continuez à utiliser le ventilateur jusqu’à ce que la respiration spontanée reprenne.

Effectuez l’opération décrite précédemment, mais juste après avoir retiré le poumon, préparez-vous à insérer la prothèse. À l’aide d’une pince émoussée, saisissez le centre de la prothèse en silicone ellipsoïde. Ensuite, tout en tenant la côte avec une pince pour exposer la cavité thoracique, insérez très doucement la prothèse.

Entrez à un angle de 45 degrés entre le plan frontal de la prothèse et la surface thoracique. À l’aide d’une pince émoussée, assurez-vous que la prothèse est complètement à l’intérieur de la cavité thoracique gauche vide. Maintenant, fermez le coffre et surveillez la souris comme décrit précédemment.

Pour cette procédure, assemblez un tube de gonflage personnalisé composé d’un piston retiré d’une pipette sérologique de 10 millilitres, d’un tube flexible de 40 centimètres de long avec un adaptateur d’aiguille, d’une soupape de régulation de débit et d’une aiguille de calibre 18. Une fois assemblée, fixez la pipette à un buffet avec du ruban adhésif. La distance entre le haut de la pipette et le banc doit être d’au moins 30 centimètres.

Après avoir euthanasié la souris par injection anesthésique, fixez-la à une planche stérilisée et ouvrez soigneusement la poitrine pour découper le sternum et exposer les lobes pulmonaires. Ensuite, exposez la trachée. Ensuite, remplissez le tube de gonflage avec du PFA fraîchement préparé à 4 % et retirez toutes les bulles du tube.

Ensuite, insérez l’aiguille dans la trachée. Pour éviter les fuites, clipsez la trachée avec des clips vasculaires. Maintenant, gonflez le poumon avec un fixateur à une pression transpulmonaire constante de 25 centimètres d’eau.

Incuber les poumons à température ambiante pendant deux heures pour une expansion complète. Après le gonflage, notez le déplacement volumique du fixateur. Maintenant, ligaturez la trachée et disséquez doucement les poumons intacts des tissus conjonctifs environnants.

Utilisez des ciseaux et soyez très doux. Ensuite, incubez les poumons dans un tube conique de 50 millilitres rempli de 4 % de PFA pendant 12 heures à quatre degrés Celsius en secouant doucement sur un agitateur. Procédez ensuite au traitement et à la coloration comme décrit dans le protocole texte.

Pour quantifier l’IML, utilisez des images de l’agent utilisé dans des sections collectées en fond clair à un grossissement de 20x. À partir de trois sections pulmonaires différentes, sélectionnez au hasard un total de 15 vues non superposées, chacune d’environ un millimètre carré, puis ventilez-les. N’utilisez que des zones sans artères et veines, voies respiratoires principales ou canaux alvéolaires.

Pour l’analyse, tracez une grille de 10 par 10 sur chaque zone sélectionnée à l’aide d’un outil règle. Les lignes de la grille sont donc espacées d’environ 100 microns. Ensuite, pour trouver une intersection le long de la droite comme la longueur entre deux épithéliums alvéolaires adjacents.

Par exemple, les flèches à deux pointes illustrent les longueurs. Comptez toutes ces longueurs le long de chaque ligne de la grille, et l’IM est la valeur moyenne des longueurs d’interception. À l’aide des protocoles décrits, des souris traitées par PNX ont été comparées à des souris implantées avec des prothèses.

Les souris utilisées étaient des mâles CD-1 âgés de huit semaines, et leurs lobes pulmonaires gauches ont été réséqués. La prothèse imite la taille et la forme du lobe pulmonaire gauche et a été insérée dans la poitrine après l’ablation du lobe pulmonaire gauche. 14 jours après l’opération, un tube de gonflage sur mesure a été utilisé pour déterminer le volume interne du poumon droit restant.

Le volume moyen du poumon droit chez les cinq souris traitées par PNX était d’environ 1,4 millilitre, ce qui était significativement plus élevé, 1,05 millilitre pour les cinq souris implantées d’une prothèse. Les valeurs de l’IML dans les poumons droits restants étaient également significativement plus élevées. À l’aide de ces paramètres, la surface interne des poumons a été calculée et s’est avérée significativement plus petite chez les souris implantées avec une prothèse.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de calculer la surface interne des poumons pour le modèle murin de régénération alvéolaire induite par la force mécanique.