Name: Cryoconservation des spermatogonies de poisson-zèbre de toute aiguille testicules immergé refroidissement ultra rapide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Découvrez la vitrification par aiguille immergée pour la cryoconservation des testicules entiers de Danio rerio. Cette méthode élimine les spermatozoïnes après réchauffage et simplifie l'isolation des cellules germinales pour la recherche en biologie de la reproduction.

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Cette étude a été financée par la National de la recherche-développement et Innovation Office de Hongrie (subvention 116912 à ÁH), le Bureau de coût (l’alimentation et l’Agriculture coût Action FA1205 : AQUAGAMETE), le Programme de bourses Hungaricum Stipendium (subvention à ZM) et le nouveau Hungarian National Excellence pré-doctoral Fellowship (subvention EK).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par la loi hongroise du bien-être Animal.
1. préparation du réactif
<ol><li>Solutions courantes<ol>
<li>Préparer 1 M tréhalose en ajoutant 0,378 g de dihydrate de tréhalose dans 1 mL de dH2O. Mix bien jusqu'à ce qu’il se dissout complètement.</li>
		<li>Préparer 1 M saccharose en ajoutant 0,342 g de saccharose dans 1 mL de dH2O. Mix bien jusqu'à ce qu’il se dissout complètement.</li>
		<li>Préparer 1 M HEPES en ajoutant 0,238 g de HEPES à 1 mL de dH2O. Mix bien jusqu'à ce qu’il se dissout complètement.</li>
		<li>Préparer, collagénase de 20 mg/mL (290 U/mg) en ajoutant 100 mg pour 5 mL de PBS. Bien mélanger jusqu'à ce qu’il se dissout. Filtres stériles par 0,2 µm filtres. Aliquote 50 µL dans 0,2 mL PCR tubes et congeler à - 20 ° C.</li>
		<li>Préparer la trypsine 15 mg/mL (~ 10000 U/mg) en ajoutant 75 mg pour 5 mL de PBS. Bien mélanger jusqu'à ce qu’il se dissout. Filtres stériles par 0,2 µm filtres. Aliquote 50 µL dans 0,2 mL PCR tubes et congeler à - 20 ° C.</li>
		<li>Préparation de 1 mg/mL DNase I (~ 3000 U/mg) en ajoutant 5 mg pour 5 mL de PBS. Bien mélanger jusqu'à ce qu’il se dissout. Filtres stériles par 0,2 µm filtres. Aliquote 50 µL dans 0,2 mL PCR tubes et congeler à - 20 ° C.</li>
		<li>Préparer le bleu trypan de 0,4 % en ajoutant 40 mg de bleu trypan à 10 mL de PBS. Filtres stériles par 0,2 µm filtres. Aliquote 1 mL dans des tubes de 1,5 mL.</li>
		<li>Préparer 200 mg/L MS-222 (méthane-sulfonate de tricaïne) en ajoutant 200 mg de MS-222 dans 1 L de dH2O. Mix bien jusqu'à ce qu’il se dissout complètement. En outre, le MS-222 tampon bicarbonate de sodium à un pH neutre de 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solutions pour la vitrification<ol>
<li>Préparer la solution de l’équilibration (ES) : préparer 2 mL de ES en mélangeant 121,5 µL du méthanol (MeOH ; 1,5 M), 220 µL de propylène glycol (PG ; 1,5 M), 200 µL de FBS (10 %), 200 µL de solution-mère tréhalose (0,1 M), 50 µL de solution mère HEPES (25 mM) et 1208.5 µL de L-15 dans un 2 tube de mL.</li>
		<li>Préparer la solution de Vitrification (VS) : préparer 2 mL de VS en mélangeant 439 µL de PG (3 M), 426 µL de diméthylsulfoxyde (moi2SO ; 3M), 200 µL de FBS (10 %), 200 µL de solution mère de tréhalose (0,1 M), 50 µL de HEPES solution mère (25 mM) et 685 µL de L-15 dans un tube de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solutions pour le réchauffement de la planète<ol>
<li>Préparer la solution au réchauffement 1 (WS1) : préparer 1,5 mL de WS1 dans un tube 2 mL de mélange 150 µL de FBS (10 %), 450 µL de la solution mère de saccharose (3M) et 900 µL de L-15.</li>
		<li>Préparer la solution au réchauffement 2 (WS2) : préparer 1,5 mL de WS2 dans un tube 2 mL de mélange 150 µL de FBS (10 %), 150 µL de la solution mère de saccharose (1 M) et 1200 µL de L-15.</li>
		<li>Préparer la solution au réchauffement 3 (WS3) : préparer le 1,5 mL de WS2 dans un tube 2 mL de mélange 150 µL FBS (10 %) et 1350 µL de L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer la solution de digestion : pour chaque échantillon, préparer 500 µL de la solution de digestion en mélangeant 50 µL de la solution mère de collagénase (2 mg/mL), 50 µL de la solution mère de trypsine (1,5 mg/mL), 10 µL de DNase I (20 µg/mL) et 390 µL de L-15 dans un 2 mL de tube.</li>
	<li>Obtenir des outils de dissection : ciseaux, microciseaux, pincettes, pinces courbées et aiguilles d’acupuncture.</li>
</ol>2. testicules Collection
<ol><li>Euthanasier le poisson en le plaçant dans un plat contenant 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Avant de poursuivre la dissection, assurez-vous que les branchies ont cessé de passer et qu’au moins 10 minutes se sont écoulées depuis ce moment pour s’assurer de la mort par hypoxie.</li>
	<li>Sécher le poisson par il tapoter sur une serviette en papier et posez-le sur sa face dorsale sur un tapis de dissection.<ol>
<li>Tout d’abord, couper les nageoires pelviennes et pectorales pour la dissection plus facile.</li>
		<li>Horizontalement, découper la peau sur le ventre du poisson entre les nageoires pectorales et couper la peau et des muscles sous-jacents le long du ventre jusqu'à la nageoire anale.</li>
		<li>Ouvrir la cavité du corps du poisson et la broche de la paroi gauche et droite du corps à la natte de dissection avec des aiguilles. Remarque : Les testicules sont situés au-dessus des organes gastro-intestinaux des deux côtés de la vessie natatoire (Figure 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour prévenir la contamination, ne sortez les organes digestifs, mais doucement les pousser d’un côté et retirer le testicule du côté adverse. Testicules sont connectés à la paroi du corps alors enlevez-les soigneusement et couper le péritoine reliant par microciseaux.</li>
	<li>En outre, afin de prévenir la contamination, d’abord stériliser les testicules en les plaçant dans l’éthanol à 70 % pendant 2 s et puis placer les en L-15 sur une plaque à 96 puits sur la glace. Remarque : S’il le faut, testicules propres de tissu graisseux et grandes les vaisseaux sanguins précisément sous le stéréomicroscope</li>
</ol>3. ultra rapide refroidissement du tissu testiculaire
<ol><li>Aiguilles de marque avec des étiquettes appropriées selon l’échantillon type et préparent l’équilibration (ES) et les solutions de vitrification (VS).</li>
	<li>Transférer les testicules à une plus grande plaque de puits ou plat et pin deux ou trois testicules (ou plus selon la taille de l’aiguille) sur une aiguille d’acupuncture stérile.<ol>
<li>Tout d’abord positionner les testicules sur le dessus de brucelles courbée. Placez la pointe de l’aiguille au milieu du testicule et tirez doucement les testicules vers le haut avec la pince à épiler.</li>
		<li>Après ponction du testicule, doucement tirer vers le haut vers le haut de l’aiguille. Assurez-vous que les testicules sont séparés les uns des autres et qu’ils ne sont pas tomber ou glisser vers le bas.</li>
		<li>Place les aiguilles avec testicules épinglés dans un tube 2 mL remplies avec L-15 jusqu'à la vitrification (à 25 ˚C ; temps de stockage ne doit pas dépasser 1 h). NOTE : Épinglant les testicules sur l’aiguille devrait faire rapidement afin d’éviter les testicules ne se dessèchent pas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer l’aiguille avec testicules dans la solution de l’équilibration et incuber pendant 5 min à 25 ° c.</li>
	<li>Transférer l’aiguille dans la solution de vitrification et incuber pendant 30 s à 25 ° c.</li>
	<li>Retirer l’aiguille de la solution de vitrification, doucement et rapidement absorber le reste de la solution des tissus par une serviette en papier stérile. Soyez prudent afin d’éviter les testicules s’en tenir à la serviette de papier ou de tomber.</li>
	<li>Placer rapidement l’aiguille dans l’azote liquide placé dans une boîte de mousse de polystyrène. Remarque : Exécutez cette étape rapidement pour éviter l’exposition des tissus à la vapeur de l’azote liquide. Faibles volumes d’azote liquide permet de prévenir la contamination croisée des échantillons.</li>
	<li>Maintenir l’aiguille dans l’azote liquide dans une boîte de Styrofoam fermée pendant 5-10 min.</li>
	<li>Refroidir un cryotube ouvert 4,5 mL et son couvercle dans la même boîte.</li>
	<li>Après 5-10 min, transférer chaque aiguille dans un cryotube distincte sous la surface de l’azote liquide et fermer le cryotube. ATTENTION : Toujours utiliser des vêtements de protection (tels que des gants) quelle fonctionne avec de l’azote liquide comme exposition peut causer de graves engelures.</li>
	<li>Placez le cryotube sur une canne de métal et placez-le dans le bac pour cryobank aussi vite que possible. Stocker les échantillons dans un stockage cuve dewar jusqu'à une utilisation ultérieure.</li>
</ol>4. procédure de réchauffement
<ol><li>Réchauffer séparément chaque aiguille. Toutes les solutions au réchauffement devraient être à 25 ° C.</li>
	<li>Détacher le cryotube de la canne métal et plongez-le dans l’azote liquide stocké dans une boîte de mousse de polystyrène.</li>
	<li>Ouvrez le cryotube dans la vapeur de l’azote liquide (à l’aide de la pince) et libérer l’aiguille dans l’azote liquide.</li>
	<li>Transférer l’aiguille très vite dans la première solution de réchauffement de la planète et incuber pendant 1 min (à 25 ° C). Assurez-vous de transférer l’aiguille rapidement afin d’éviter son réchauffement dans l’air pendant le transfert.</li>
	<li>Transférer l’aiguille dans la deuxième solution de réchauffement de la planète et incuber pendant 3 min (à 25 ° C).</li>
	<li>Transférer l’aiguille dans la troisième solution de réchauffement de la planète et incuber pendant 5 min (à 25 ° C).</li>
	<li>Libérer les testicules de l’aiguille en les faisant glisser vers le bas avec des pincettes incurvé. Place chaque testicule chauffé individuellement dans un puits distinct (plaque à 96 puits) rempli de 250 µL de L-15 additionné de 10 % FBS. Assurez-vous que les puits sont étiquetés selon l’échantillon. Maintenir la plaque bien sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons sont réchauffées et jusqu'à ce que la poursuite des travaux.</li>
</ol>5. tissu Digestion
<ol><li>Préparer 500 µL de la solution de dissociation pour chaque échantillon dans des tubes distincts de 2 mL. Les tubes selon le code de l’échantillon de l’étiquette. Incuber la solution préparée dissociation pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter le tissu chauffé dans la solution de digestion et coupez-le en petits morceaux par au moins 30 mouvements de petits ciseaux.</li>
	<li>Incuber le tissu coupé sur une plaque vibrante pendant 90 min à 25 ˚C.</li>
	<li>Arrêter le processus de digestion en ajoutant 400 µL de L-15 et 100 µL de BF (BF 10 % v/v). Brièvement, agiter la solution et incuber pendant 1 min à température ambiante.</li>
	<li>Filtrer la solution obtenue sur 50 µm filtres dans un tube de 1,5 mL. Identifier les tubes en conséquence.</li>
	<li>Centrifuger la solution filtrée à 200 × g pendant 10 min à 25 ˚C.</li>
	<li>Avec précaution, retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 20 µL de L15 additionné de 10 % FBS. Manuellement de secouer le tube jusqu'à dissolution complète de la pastille. Garder la suspension cellulaire sur la glace ou à 4 ° c jusqu'à l’utilisation ultérieure.</li>
</ol>6. viabilité évaluation et cellule de comptage
<ol><li>Mix 5 µL de suspension cellulaire et 5 µL de solution de bleu de trypan 0,4 % dans un tube PCR correctement identifié 0,2 mL. Si des volumes différents sont utilisés, s’assurer que le coefficient de dilution de 1:1 reste.</li>
	<li>Incuber cette suspension pendant 1 à 3 min à température ambiante (25 ° C).</li>
	<li>Vérifier la viabilité de chaque échantillon dans un hémocytomètre sous le microscope.</li>
	<li>Compter le nombre de cellules vivantes (non souillées enregistré par le bleu trypan) dans 15 domaines. Calculer le nombre total de cellules à 20 µm de la suspension cellulaire. La suspension est maintenant prête pour n’importe quelle application en aval. Remarque : Lors de l’optimisation de la procédure pour les autres espèces avec la plus grande taille, utiliser des fragments de testicules de poids égal. Utilisez les testicules d’un individu pour les groupes expérimentaux afin d’éviter une variabilité individuelle dans les résultats. Dans le cas du poisson-zèbre, nous avons profité du fait que gauche et droite testicule doit contenir un nombre égal (ou très similaire) de cellules germinales13 (voir les résultats de représentant). Le testicule gauche a été gardé comme un contrôle alors que le testicule droit était vitrifié/réchauffé. Pourcentage de viabilité a été calculé le nombre de cellules isolées du testicule vitrifié/réchauffé par rapport au nombre de cellules isolées du testicule fraîche.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure refroidissement ultra rapide mis au point pour les espèces aviaires et mammifères10,11,12 pour la cryoconservation des testicules de poisson (poisson zèbre comme un modèle de organisme). La plupart des études antérieures au sujet de la cryoconservation des ressources génétiques zebrafish portaient principalement sur la cryoconservation du sperme de p...

Nouvelles tendances en sciences et en biotechnologie ont conduit à la création de milliers de nouvelles lignées mutantes de souris, drosophile, poisson-zèbre et autres espèces utilisées comme organismes modèles dans la recherche biomédicale et d’autres sciences1. En outre, comme les nouvelles technologies sont développées et deviennent disponibles, le nombre de lignées mutantes augmente régulièrement2. Cela conduit à la nécessité d’un stockage sûr des ressources génétiques au-delà des pratiques courantes de garder les colonies reproductrices. Comme une méthode qui permet le stockage en toute sécurité des ressources génétiques pour une période de temps indéterminée, cryoconservation offre de nombreux avantages tels que l’extension de la saison de reproduction, contourne la nécessité d’entretien continu des géniteurs, et c’est plus coût - et efficace du travail2.
Protocoles pour la cryoconservation de sperme développée au cours du passé plusieurs années2,3,4 offrent l’occasion pour stockage réussie du poisson-zèbre mâle matériel génétique. Cependant, cryoconservation de œufs ou embryons chez les poissons n’est pas encore possible en raison de leur structure complexe et de grandes quantités de matériel de jaune d’oeuf. Récemment, la pratique de la transplantation de cellules germinales primordiales (PGC) ou de cellules souches spermatogoniales (SSC) offre une voie de contournement à cet obstacle en développant dans sperme fonctionnel et les œufs après transplantation5. Cryoconservation de SSC propose donc une nouvelle frontière pour la conservation des ressources génétiques rares et précieux.
Même si la cryoconservation offre de nombreux avantages, le processus de congélation lente-taux génère plusieurs conditions pouvant entraîner de dommages cellulaires2. Il s’agit de la formation de glace intracellulaires et extracellulaires, déshydratation, toxicité cryoprotecteur et d’autres. Intracellulaire glace endommage les cellules, glace extracellulaire peut conduire à un broyage mécanique des cellules, tandis que la diffusion de l’eau des cellules au cours de la congélation lente-taux peut conduire à la déshydratation,6. Récemment, vitrification comme une technique qui empêche les effets négatifs de la formation de glace a été appliquée à la cryoconservation des gamètes de poisson7,8,9. Il présente une technique de refroidissement ultra rapide, grâce auquel les médias internes et externes transformer en un état amorphe/vitreux sans cristalliser en glace7,10. Vitrification réussie du tissu testiculaire et ovarien a été mis en évidence dans les espèces aviaires et mammifères10,11,12, ouvrant ainsi des possibilités de son application chez les poissons, aussi bien.
Dans cette étude, nous présentons la procédure de vitrification (NIV) aiguille immergé pour la cryoconservation des testicules tout poisson-zèbre. Nous démontrons une méthode fiable pour l’isolement du poisson-zèbre précoce des cellules germinales sans contamination et un processus de cryoconservation qui produit des quantités relativement élevées de stade précoce des cellules germinales avec une faible présence d’autres cellules, en particulier les spermatozoïdes. Au meilleur de notre connaissance, c’est la première étude à démontrer un protocole détaillé visualisé pour refroidissement ultra rapide du tissu gonadique poisson et poisson-zèbre des cellules germinales. En outre, la répétabilité de la méthode est montrée dans cinq souches différentes de poisson-zèbre : AB type sauvage, casper (roy- / -; nacre- / -), léopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] et lignée transgénique de Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].

<table><tbody><tr><td>Milieu Leibovitz (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Supplémenté en L-glutamine</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Méthanesulfonate de tricaïne (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Tréhalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Méthanol dihydraté</td></tr><tr><td></td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propylène glycol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Colagénase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Bleu trypan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phospate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Comprimés pour la préparation de 200 ml de solution de PBS</td></tr></tbody></table>

cryoconservation des spermatogonies de poisson-zèbre de toute aiguille testicules immergé refroidissement ultra rapide

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Tendances actuelles de la science et de la biotechnologie menant à la création de milliers de nouvelles lignes dans les organismes modèles, ce qui conduirait à la nécessité de nouvelles méthodes pour le stockage sûr des ressources génétiques au-delà des pratiques courantes de garder les colonies reproductrices. L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure vitrification (NIV) pour cryoconservé testicules tout poisson-zèbre. Cryoconservation des cellules germinales précoce par les testicules tout NIV offre des possibilités pour le stockage du poisson-zèbre des ressources génétiques, autant après la transplantation, ils peuvent mûrir en gamètes mâles et femelles. Testicules ont été excisées, a effectué le tombé sur une aiguille d’acupuncture, équilibrée dans deux milieux cryoprotecteurs (équilibration solution contenant du méthanol de 1,5 M et 1,5 M propylène glycol ; et solution de vitrification contenant 3 M le diméthylsulfoxyde et 3M propylène glycol) et plongés dans l’azote liquide. Des échantillons ont été réchauffés dans une série de trois solutions de réchauffement de la planète qui en découle. Les principaux avantages de cette technique sont : (1) l’absence de spermatozoïdes après digestion des testicules réchauffés, ce qui facilite les manipulations en aval ; (2) ultra rapide refroidissement permettant l’exposition optimale des tissus à l’azote liquide donc maximiser le refroidissement et la réduction de la concentration requise des cryoprotecteurs, réduisant ainsi leur toxicité ; (3) synchrone exposition des testicules plusieurs cryoprotecteurs et azote liquide ; et répétabilité (4) a démontré en obtenant la viabilité de plus de 50 % dans cinq souches différentes de poisson-zèbre.

En moyenne, le nombre de cellules germinales de stade précoce isolé d’un testicule unique de poisson-zèbre fraîche variait entre 40 000 et 200 000 cellules selon la taille du poisson. Lorsque digérer les testicules zebrafish frais dans toutes les 5 souches, les cellules germinales début n’étaient pas les seules cellules présentes dans les suspensions cellulaires (Figure 2). À côté du stade précoce des cellules germinales, nombreux spermatozoïdes ont été trouv...

L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure vitrification (NIV) pour cryoconservé testicules tout poisson-zèbre. En outre, la répétabilité de la méthode dans cinq souches différentes de poisson-zèbre a été testée.

Cryoconservation des spermatogonies de poisson-zèbre de toute aiguille testicules immergé refroidissement ultra rapide

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

La cryoconservation offre la possibilité de maintenir des cellules et tissus vivants à basse température pendant une période infinie, du moins en termes humains. La vitrification est une méthode de cryoconservation qui implique un refroidissement ultrarapide menant à un état vitreux, amorphe, sans formation de glace cristalline ni les dommages qui y sont associés. Dans cette vidéo, nous présentons le protocole de vitrification de testicules entiers de poisson zèbre, permettant leur stockage sécurisé en vue d'une utilisation ultérieure comme source de cellules germinales destinées à la transplantation dans des receveurs appropriés.Le protocole de vitrification actuel présente un avantage majeur par rapport aux protocoles de congélation lente en ce qui concerne les manipulations des cellules souches germinales. Cet avantage est que, après vitrification et réchauffement, les spermatozoïdes meurent et sont éliminés, de sorte qu'ils ne sont pas présents dans la suspension cellulaire. Par conséquent, aucune isolation des cellules germinales n'est nécessaire après le réchauffement.Et cela facilite aisément les manipulations en aval. Euthanasier le poisson en le plaçant dans une boîte contenant 200 milligrammes par litre de MS-222 à un pH de sept. Avant de poursuivre la dissection, s'assurer que les branchies ont cessé de bouger, et attendre au moins 10 minutes à partir de ce moment pour garantir la mort par hypoxie.Séchez le poisson en le tamponnant avec une serviette en papier et placez-le sur son côté dorsal sur un tapis de dissection. Tout d'abord, retirez les nageoires pelviennes et pectorales pour faciliter la dissection. Faites une incision horizontale dans la peau du ventre du poisson entre les nageoires pectorales, puis découpez la peau et le muscle sous-jacent le long du ventre jusqu’à la nageoire anale.Ouvrir la cavité corporelle du poisson et fixer les parois latérales gauche et droite sur le tapis de dissection à l'aide d'aiguilles. Les testicules se situent au-dessus des organes gastro-intestinaux, de chaque côté de la vessie natatoire. Pour éviter toute contamination, ne pas retirer les organes gastro-intestinaux, mais les déplacer doucement sur un côté et prélever les testicules du côté opposé.Les testicules sont reliés à la paroi corporelle ; il faut donc les retirer avec précaution et sectionner le péritoine qui les relie à l’aide de ciseaux microchirurgicaux. De plus, afin d’éviter toute contamination, stérilisez d’abord les testicules en les plongeant dans de l’éthanol à 70 % pendant deux secondes, puis placez-les dans du milieu L-15 sur une plaque de 96 puits placée sur de la glace. Marquez les aiguilles avec des étiquettes appropriées selon le type d’échantillon, et préparez les solutions d’équilibre et de vitrification.Transférez les testicules dans une plaque ou une boîte de plus grande taille et fixez trois testicules ou plus, selon la taille de l'aiguille, sur une aiguille d'acupuncture stérile. Placez d'abord les testicules sur des pinces incurvées. Insérez la pointe de l'aiguille au milieu du testicule, puis remontez délicatement le testicule à l'aide des pinces.Après avoir percé le testicule, tirez doucement vers le haut en direction de l'extrémité de l'aiguille. Veillez à ce que les testicules soient séparés l'un de l'autre et qu'ils ne tombent pas ou ne glissent pas vers le bas. Placez les aiguilles avec les testicules fixés dans un tube Eppendorf Tubulator rempli de milieu L-15 jusqu'à la vitrification à 25 degrés.Le temps de stockage ne doit pas dépasser une heure. Transférez l'aiguille contenant les testicules dans la solution d'équilibre et incubez pendant cinq minutes à 25 degrés. Transférez l'aiguille dans la solution de vitrification et incubez pendant 30 secondes à 25 degrés.Retirez l'aiguille de la solution de vitrification. Absorbez rapidement et délicatement la solution restante du tissu à l’aide d’un papier stérile. Prenez garde d’éviter que les testicules ne collent au papier ou ne tombent.Placer rapidement l'aiguille dans de l'azote liquide contenu dans une boîte en polystyrène. Maintenir l'aiguille dans l'azote liquide à l'intérieur d'une boîte en polystyrène fermée pendant cinq à dix minutes. Prérefroidir un cryotube ouvert de 4,5 millilitres et son bouchon dans la même boîte.Après cinq à dix minutes, transférez chaque aiguille dans un cryotube séparé sous la surface de l'azote liquide et fermez le cryotube. Placez le cryotube sur une canne métallique et insérez-le dans le récipient de la cryobanque le plus rapidement possible. Conservez les échantillons dans un tiroir de stockage du récipient jusqu'à utilisation ultérieure.Réchauffez chaque aiguille séparément. Toutes les solutions de réchauffement doivent être à 25 degrés. Détachez le cryotube de la tige métallique et plongez-le dans l'azote liquide stocké dans une boîte en polystyrène.Ouvrir le cryotube dans la vapeur d'azote liquide à l'aide de pinces, puis libérer l'aiguille dans l'azote liquide. Transférer rapidement l'aiguille dans la première solution de réchauffement et incuber pendant une minute. Veiller à transférer l'aiguille rapidement afin d'éviter qu'elle ne se réchauffe dans l'air pendant le transfert.Transférez l'aiguille dans la deuxième solution de réchauffement et incubez pendant trois minutes. Transférez l'aiguille dans la troisième solution de réchauffement et incubez pendant cinq minutes. Libérez les testicules de l'aiguille en les faisant glisser vers le bas à l'aide de pinces courbes.Placer chaque testicule réchauffé individuellement dans un puits distinct rempli de 250 microlitres de L-15, supplémenté avec 10 % de FPS. S'assurer que les puits sont étiquetés selon l'échantillon. Garder la plaque sur de la glace jusqu'à ce que tous les échantillons soient réchauffés, et jusqu'aux manipulations ultérieures.Préparez 500 microlitres de solution de dissociation pour chaque échantillon dans des tubes séparés de deux millilitres. Étiquetez les tubes selon le code de l'échantillon. Incubez la solution de dissociation préparée pendant cinq minutes à température ambiante.Ajouter le tissu réchauffé dans la solution de digestion et le couper en petits morceaux à l’aide d’au moins 30 mouvements de petites ciseaux. Incuber le tissu sur une plaque agitée pendant 90 minutes à 24 degrés. Arrêter le processus de digestion en ajoutant 400 microlitres de L-15 et 100 microlitres de FPS 10 %.Agiter brièvement la solution et incuber pendant une minute à température ambiante. Filtrer la solution obtenue à l’aide de filtres de 50 microns dans un tube de 1,5 millilitre. Étiqueter les tubes en conséquence.Centrifuger la solution filtrée à 200 G pendant 10 minutes à 25 degrés. Retirer soigneusement le surnageant et reprendre le culot dans 20 microlitres de L-15, supplémenté avec 10 % FPS. Agiter manuellement le tube jusqu'à ce que le culot soit complètement dissous.Gardez la suspension cellulaire sur de la glace ou à quatre degrés jusqu'à une utilisation ultérieure. Mélangez cinq microlitres de suspension cellulaire et cinq microlitres de solution de bleu de trypan à 0,4 % dans un tube PCR de 0,2 millilitre correctement étiqueté. Si des volumes différents sont utilisés, assurez-vous que le rapport de dilution de un à un reste inchangé.Incuber cette suspension pendant une à trois minutes à 25 degrés. Vérifier la viabilité de chaque échantillon à l’aide d’un hémocytomètre au microscope. Compter le nombre de cellules vivantes non colorées par le bleu de trypan dans 15 champs.Calculez le nombre total de cellules dans 20 microlitres de la suspension cellulaire. La suspension est désormais prête à être utilisée dans toute application en aval. En moyenne, le nombre de cellules germinales au stade précoce isolées à partir d'un testicule de poisson-zèbre frais unique varie entre 40 000 et 200 000 cellules, selon la taille du poisson.Dans toutes les lignées de zebrafish utilisées dans cette étude, le protocole de vitrification actuel a permis d'obtenir des taux de viabilité moyens de 50 % et plus. Cela indique une viabilité et une reproductibilité favorables du protocole présenté. Lors de la digestion de testicules frais de zebrafish provenant des cinq souches, outre les cellules germinales précoces, de nombreux spermatozoïdes ont également été observés.Après la digestion de testicules cryopréservés, il y avait beaucoup moins de spermatozoïdes, ce qui indique qu'ils ne survivent pas à ce protocole de vitrification et qu'ils sont très probablement éliminés au cours du processus de digestion. Le protocole de vitrification avec aiguille immergée présenté dans cette étude offre plusieurs avantages pour la cryoconservation de fragments testiculaires. Premièrement, plusieurs fragments peuvent être fixés sur une même aiguille, ce qui permet de les exposer simultanément aux cryoprotecteurs et à l'azote liquide.En outre, cette méthode permet d'attacher aux fragments de tissu des quantités très faibles de cryoprotecteurs. Ainsi, les vitesses de refroidissement et de réchauffement peuvent être plus élevées. Un avantage important est que les spermatozoïdes ne survivent pas à ce protocole, et par conséquent, les suspensions cellulaires obtenues sont enrichies en spermatogonies, ce qui facilitera les applications en aval.Mais un point qui doit être pris en compte est la possibilité d'une contamination croisée par l'azote. Par conséquent, lors de l'utilisation de cette méthode, l'azote liquide ne doit pas être réutilisé.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Ceci est un protocole de haut débit de cryoconservation des spermatozoïdes de poisson zèbre. Le sperme cryoconservés en utilisant ce protocole a une moyenne de fertilité de 25% de fécondation in vitro ultérieure et est stable depuis de nombreuses années.

Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

C'est une méthode pour générer des embryons de poisson zèbre gynogénétiques diploïde (embryons dont la seule contribution génétique vient de la mère) en bloquant la seconde division méiotique immédiatement après la fécondation avec la lumière ultraviolette inactivé sperme. EP embryons ne sont pas entièrement homozygotes due à la recombinaison lors de la première division méiotique, cependant elles sont homozygotes à tous les loci qui n'ont pas été séparés de leur centromère par recombinaison.

Faire Zebrafish diploïdes gynogénétiques par Pression Early

Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure de vitrification des embryons de lapin récoltés au stade de développement souhaité en utilisant de l’éthylène glycol et du diméthylsulfoxyde comme cryoprotecteurs et de la paille cryogénique comme système de transport. Les embryons vitrifiés ont un taux de survie élevé et peuvent être conservés pendant une période prolongée jusqu’à leur utilisation.

Vitrification d’embryons de lapin à l’aide de paille cryogénique : une technique de refroidissement ultra-rapide pour préserver les embryons de lapin en vue d’un stockage à long terme

Le poisson-zèbre est un système modèle puissant pour la biologie du développement et la recherche sur les maladies humaines en raison de sa similitude génétique avec les vertébrés supérieurs. Ce protocole décrit une méthodologie permettant de créer des embryons de poisson-zèbre haploïde qui peuvent être utilisés pour des stratégies de dépistage avancé afin d’identifier les mutations récessives dans les gènes essentiels à l’embryogenèse précoce.

Production de haploïdes embryons de poisson zèbre par<em&gt; In Vitro</em&gt; Engrais

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Recouvrement des adultes coeurs de poisson zèbre à haut débit pour des applications

Des prélèvements sanguins répétés sont nécessaires et importants dans la recherche animale. Nous avons mis au point une méthode nouvelle, non létale et fiable pour le prélèvement répété de sang chez le poisson-zèbre adulte, et nous avons appliqué cette méthode à l’étude de la biochimie du sang, y compris le métabolisme du glucose.

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Les technologies CRISPR-Cas ont révolutionné le domaine de l’édition du génome. Cependant, trouver et isoler la modification souhaitée de la lignée germinale reste un goulot d’étranglement majeur. Par conséquent, ce protocole décrit une méthode robuste pour dépister rapidement les spermatozoïdes de poisson-zèbre injectés par F0 CRISPR pour les modifications de la lignée germinale en utilisant des techniques standard de PCR, de digestion de restriction et d’électrophorèse sur gel.

Dépistage des spermatozoïdes pour l’isolement rapide des modifications de la lignée germinale chez le poisson zèbre

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Cryoconservation des spermatogonies de poisson-zèbre de toute aiguille testicules immergé refroidissement ultra rapide

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