Utilisation d’un moustique Recombinant Densovirus comme un vecteur de livraison de gène pour l’analyse fonctionnelle des gènes chez les larves de moustiques

L'objectif général de cette procédure est d'analyser la fonction des gènes chez les larves de moustique, en utilisant un dénovirus recombinant du moustique comme vecteur de transfert génique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les systèmes de délivrance virale, telles que la manière de surmonter les barrières extracellulaires et intracellulaires associées. Les principaux avantages de ces techniques sont une manipulation facile, une efficacité élevée de transduction, une expression à long terme et robuste, ainsi que la capacité de produire des effets persistants in vivo.

Ce travail a démontré que des ARN petits spécifiques ou des gènes cibles peuvent être surexprimés ou inhibés chez les larves de moustiques à l’aide du système de délivrance par dénovirus mis au point. Les implications de cette technique élargissent les applications de la stratégie d’expression décrite pour étudier la biologie des moustiques, car cette méthode permet des transductions simples des larves. La procédure sera démontrée par Pei-Wen Liu, candidate au doctorat dans notre laboratoire.

Commencez par commander la synthèse chimique de séquences d'ADN complémentaire (ADNc) complètes pour les précurseurs de miARN, les éponges à miARN et les ARNsh, comme décrit dans le protocole textuel associé. Après réception de l'ADN commandé, centrifugez brièvement les tubes contenant les fragments d'ADN afin de s'assurer que tout l'ADN sec se trouve bien au fond du tube. Resuspendez ensuite l'ADN dans de l'eau exempte de DNase pour obtenir une concentration finale de 10 nanogrammes par microlitre.

Ajoutez six microlitres de XbaI pour digérer le squelette plasmidique et les séquences d'ADN complémentaire, puis incubez la réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, déphosphorylez les extrémités en cinq primes du squelette plasmidique linéarisé à l'aide de la phosphatase alcaline intestinale de veau, conformément aux instructions du fabricant. Pour un empaquetage efficace, la taille du génome ne doit pas dépasser 4 400 nucléotides, soit 110 % de la longueur du génome du densovirus de moustique de type sauvage, ou bien l'expression d'ARNi intronique ne doit pas excéder 400 nucléotides pouvant être introduits dans le génome d'Aedes aegypti.

Ensuite, inactiver la phosphatase alcaline par chauffage à 65 degrés Celsius. Puis, faire migrer l'ADN sur un gel d'agarose à 1 % et couper l'ADN linéarisé. Extraire l'ADN du fragment de gel à l'aide d'un kit d'extraction de gel, en suivant les instructions du fabricant.

Une fois extrait, ligaturez le fragment d'ADN dans l'ADN squelette en utilisant la ligase T4 de l'ADN. Ensuite, utilisez un choc thermique pour transformer les produits de la réaction de ligature dans des cellules compétentes de E. coli DH5-alpha. Étalez les bactéries transformées sur une boîte de gélose LB contenant 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline.

Le lendemain, prélevez une colonie unique à partir de la boîte de Pétri et réalisez une culture préliminaire en utilisant trois millilitres de milieu enrichi contenant 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline. Enfin, extrayez l'ADN plasmidique à partir de la culture bactérienne à l'aide d'un kit de minipréparation, en suivant les instructions du fabricant. Envoyez un échantillon de l'ADN à une société de séquençage d'ADN pour vérification.

Ligaturer l'ARNm précurseur ou l'ARNh dans le site HpaI de la région codant pour NS1 d'AaeDV sur l'ossature plasmidique pUCA, en utilisant les méthodes décrites pour la cassette d'expression intronique artificielle d'ARN petit. À la place des cellules DH5-alpha, transformer l'ADN dans des cellules compétentes Stbl3 d'E.coli. Ensuite, étaler les cellules transformées sur une boîte de gélose LB contenant 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline, et préparer une culture initiale à partir d'un clone positif. Puis, extraire le plasmide rAaeDV à partir des cellules bactériennes à l'aide d'un kit de maxipréparation, conformément aux instructions du fabricant.

Au jour zéro, diviser les flacons de cellules C6/36 en confluence de 90 à 95 % dans un rapport de un à deux en 10 flacons de culture T-25. Incuber les flacons pendant 18 à 20 heures à 28 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils atteignent à nouveau une confluence de 90 à 95 %.

Le premier jour, transfecter les cellules avec les plasmides rAaeDV générés. Pour ce faire, diluer 10 microgrammes d'ADN dans 600 microlitres de milieu RPMI-1640, puis mélanger doucement la solution. Pendant ce temps, préparer 600 microlitres de milieu RPMI-1640 et 25 microlitres de réactif de transfection par transfection.

Incuber les cellules avec l'ADN pendant cinq à dix minutes à température ambiante. Ensuite, ajouter 625 microlitres du mélange de réactif de transfection RPMI-1640 au mélange d'ADN plasmidique et incuber ce mélange pendant 20 à 30 minutes à température ambiante. Après l'incubation, laver les cellules deux fois avec du milieu RPMI-1640, puis ajouter le mélange de transfection à chacun des flacons de culture T-25.

Incuber les cellules dans le mélange de transfection pendant six heures à 28 degrés Celsius. Après six heures, retirer le milieu de transfection, laver les cellules deux fois avec cinq millilitres de milieu RPMI-1640, puis ajouter du milieu RPMI-1640 frais contenant 10 % de FBS. Cinq jours après la transfection, utiliser une pipette en verre de cinq millilitres pour détacher et suspendre les cellules dans les boîtes en pipetant le milieu de culture vers le haut et vers le bas.

Transférez les suspensions cellulaires de chaque flacon dans des tubes stériles de 50 millilitres séparés. Pour récolter un virus à seuil élevé dépendant, il est nécessaire de maintenir les cellules pendant cinq jours après la transfection. Congelez les tubes individuellement à moins 80 degrés Celsius ou dans un bain d'éthanol avec de la glace sèche pendant 30 minutes.

Ensuite, décongelez-les rapidement à 37 degrés Celsius et vortexez la suspension cellulaire pendant une minute. Puis, récupérez le surnageant de l'échantillon centrifugé et jetez le culot. Ensuite, faites passer le surnageant à travers un filtre stérile jetable de 0,22 micromètre monté sur une seringue.

Prélevez des aliquotes et conservez les stocks finaux de virions purifiés à moins 80 degrés Celsius. Lavez trois fois 100 larves de premier stade de A. albopictus avec de l'eau déionisée. Ensuite, transférez les larves dans un bécher contenant 95 millilitres d'eau déionisée.

Ajoutez cinq millilitres des stocks de rAaeDV et incubez les larves pendant 24 heures à 28 degrés Celsius. Pour réussir l'infection des larves, il est essentiel que celles-ci soient exposées aux particules virales pendant 24 à 36 heures afin d'assurer des taux d'infection élevés. Après l'incubation, lavez les larves trois fois à l'eau déionisée, puis transférez-les à nouveau dans les plaques. Alimentez régulièrement les larves. Surveillez le niveau d'expression du gène cible dans les larves, à l'aide de PCR quantitative ou de western blot, en utilisant des techniques standard.

Dans cet exemple, 100 larves de premier stade ont été analysées pour leur expression endogène de miARN après infection avec le virus recombinant contenant le cassette d'expression aal-let-7, montrant une surexpression.

L'efficacité du construct anti-let-7 est indiquée à droite, mettant en évidence ses capacités de silençage. Afin de surveiller l'efficacité du silençage de l'ARNm de la V-ATPase par les vecteurs rAaeDV, un total de 100 larves de premier stade ont été traitées avec des quantités équivalentes de rAaeDV de types variés, en ajoutant le virus dans le milieu aquatique de l'habitat larvaire. Les niveaux d'ARNm de la V-ATPase ont été fortement réduits par un rAaeDV exprimant une miARN ainsi que par un rAaeDV exprimant une shRNA intronique.

Nos résultats valident une stratégie d'expression intronique qui offre un nouveau paradigme, permettant de surmonter les limitations des dénsivirus de moustiques ayant un génome déficient, afin de permettre une livraison efficace de gènes étrangers dans les moustiques. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l'esprit qu'une cassette d'expression de microARN intronique ne dépassant pas 400 nt peut être introduite dans le génome du dénsivirus d’Aedes aegypti. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à la recherche sur la production de dénsivirus recombinants de moustiques non déficients capables de surexprimer ou de réduire l'expression de microARN et de leurs gènes cibles, permettant ainsi l'analyse fonctionnelle des gènes de moustiques.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser le système de livraison de densovirus de moustique développé pour analyser les fonctions des gènes chez les larves de moustique.