Une méthodologie de lésions mécaniques neuronales simples à étudier Drosophila Dégénérescence du neuron moteur

L’objectif global de cette procédure est d’induire des lésions mécaniques des motoneurones chez les larves de drosophile. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche neurodégénérative, telles que la séquence temporelle des événements cellulaires menant à la neurodégénérescence. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est peu coûteuse et qu’elle utilise des équipements que la plupart des laboratoires de drosophile possèdent déjà.

Les implications de cette technique s’étendent à la compréhension des mécanismes moléculaires qui régissent la neurodégénérescence. Pour commencer le protocole, sélectionnez 10 larves du deuxième ou du troisième stade dans une fiole ou une bouteille de drosophile contenant des larves errantes du troisième stade qui ont été cultivées à 25 degrés Celsius. À l’aide d’une pince, on peut prélever soigneusement les larves à l’aide d’une pince ou d’un pinceau sans les comprimer.

Placez directement les 10 larves dans un plat en verre contenant du 1x PBS froid pour éliminer tous les débris alimentaires et ralentir la motilité larvaire. Identifiez les larves du troisième stade par leurs spiracles de la branche antérieure et les larves du deuxième stade par leur petite taille et leurs spiracles antérieurs en forme de massue. Placez chaque larve sur un appareil anesthésiant au CO2.

À l’aide d’un microscope à dissection, roulez soigneusement chaque larve sur sa face dorsale pour visualiser les nerfs segmentaires dans toute la cuticule. Il est essentiel de rouler soigneusement chaque larve sur sa face dorsale afin de visualiser les nerfs segmentaires à travers la cuticule avant la blessure. En commençant par les crochets buccaux, placez les pinces de taille 5 à environ la moitié aux deux tiers de la longueur de la larve.

Une fois positionné, pincez environ un tiers de la cuticule ventrale contenant les nerfs segmentaires avec des préceps de taille 5. Pour vous assurer que les nerfs segmentaires larvaires sont blessés, appliquez une force suffisante pour écraser les nerfs segmentaires, mais laissez la cuticule intacte. Pour déterminer la bonne quantité de force, écrasez 10 larves et assurez-vous que le taux de mortalité après cinq heures est inférieur à 50 %Après la blessure, transférez soigneusement les larves dans une plaque de gélose au jus de fruits contenant environ 0,5 gramme de pâte de levure.

Placez chaque larve de manière à ce que son extrémité antérieure soit sur la pâte de levure pour une alimentation continue. Placez des plaques de gélose contenant de la pâte de levure et 10 larves blessées au fond d’une boîte de Pétri vide de 100 x 15 millimètres. Couvrez la boîte de Pétri avec une serviette en papier humide, en veillant à ce que la serviette en papier ne touche pas les larves ou les plaques de gélose.

Placez ensuite la boîte de Pétri dans un récipient hermétique à température ambiante. Enfin, récupérer les larves pour les disséquer après des périodes précises après la blessure. Avant la blessure, les jonctions neuromusculaires de type sauvage, ou JNM, montrent le marqueur de la zone active présynaptique Brp en apposition au marqueur postsynaptique Dlg dans toute la JNM.

Les lésions mécaniques des nerfs segmentaires peuvent induire une neurodégénérescence modérée à sévère dans laquelle les butons colorés avec Dlg sont maintenant dépourvus de la protéine de la zone active présynaptique Brp. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs qui étudient les lésions neuronales pour explorer la séquence temporelle des événements cellulaires conduisant à la neurodégénérescence à la jonction neuromusculaire chez la drosophile.