Name: Une méthodologie de lésions mécaniques neuronales simples à étudier Drosophila Dégénérescence du neuron moteur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Apprenez une méthode simple pour induire des lésions mécaniques des nerfs segmentaires chez les larves de Drosophila. Cette technique permet de visualiser et quantifier la neurodégénérescence des neurones moteurs à la jonction neuromusculaire.

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Nous tenons à remercier tous les membres des Keller et Magie Labs de l&#39;Université Quinnipiac pour des suggestions utiles. En particulier, nous aimerions remercier Barron L. Lincoln II pour le développement de ce test de blessure au Keller Lab. Nous aimerions également remercier le baccalauréat des arts et de la science Quinnipiac Grant-In-Aid décerné à LC Keller.

1. Préparation des réactifs et de l&#39;équipement <ol><li> Préparer 1x Dissection tampon (70 mM NaCl, 5 mM de KCl, 0,02 mM de CaCl2, 20 mM de MgCl2, 10 mM de NaHCO 3, 115 mM de saccharose, 5 mM de trehalose, 5 mM de HEPES, pH 7,2). </li><li> Préparez 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS). </li><li> Préparez 1x PBT en utilisant 1x PBS avec 0,01% de Triton X-100. </li><li> Préparer des plaques d&#39;agar de jus de fruits. 14 En bref, mélanger 30 g d&#39;agar dans 700 ml de H 2 O et un autoclave. Dissoudre 0,5 g de méthyl paraben dans 10 ml d&#39;éthanol et ajouter une solution à 300 ml de concentré de jus de fruits (raisins ou pommes). Mélanger concentré dans une solution de gélose autoclavée et verser dans les couvercles de boîtes de Petri de 10 mm x 35 mm. REMARQUE: le prémélange de grappe de pâte à raisin peut également être acheté auprès de diverses entreprises (voir Tables de matériaux ). </li><li> Obtenez des pinces de taille 5 qui permettent de blesser mécaniquement les larves. </li><li> Utilisez Drosophila CO 2 standard </sUb&gt; appareil d&#39;anesthésie à base de base. </li></ol> 2. Sélection de Larves de Drosophila <ol><li> Prenez un flacon ou une bouteille de larves errantes de troisième stade contenant de la Drosophila qui a été cultivée à 25 ° C. </li><li> Sélectionnez dix 2 individuelles e ou 3 e stade larvaire basé sur l&#39; apparence. Les larves du troisième stade peuvent être identifiées par l&#39;apparition de spiracles branchés antérieurs, tandis que les larves du deuxième stade sont plus petites et ont plus de spiracles antérieurs en forme de club. REMARQUE: Les étapes de larves peuvent également être identifiées par chronométrage. À 25 ° C, les larves du deuxième stade apparaissent environ 48 h après l&#39;éclosion et les larves du troisième stade se déplacent environ 24 heures plus tard. Si vous êtes intéressé par l&#39;examen de la neurodégénérescence au NMJ, les larves du deuxième stade doivent être blessées. </li></ol> 3. Préparation des larves de Drosophila pour blessures mécaniques <ol><li> Choisissez soigneusement des larves individuelles par une pince ou un pinceau, soit prudenteDe ne pas le compresser de toute façon. </li><li> Placez directement dix larves dans un plat en verre contenant du PBS 1X Froid ou un tampon de dissection pour éliminer tout débris alimentaire et ralentir la motilité larvaire. </li></ol> 4. Lésions mécaniques et traitement des larves de la drosophile <ol><li> Placez chaque larve individuelle sur un appareil d&#39;anesthésiant au CO 2 . </li><li> Sous un microscope à dissection, faites rouler soigneusement chaque larve sur leur côté dorsal afin de visualiser les nerfs segmentaires à travers la cuticule. </li><li> La taille de la position 5 pince environ 1/2 à 2/3 de la longueur de la larve à partir des crochets de la bouche. Une fois positionné, pincer environ 1/3 de la cuticule ventrale contenant les nerfs segmentaires avec des pinces de taille 5. <ol><li> Pour s&#39;assurer que les nerfs segmentaires larvaires sont blessés, appliquer une force suffisante pour écraser les nerfs segmentaires, mais laisser la cuticule intacte. Pour déterminer la quantité de force correcte, écraser 10 larves et assurerLe taux de mortalité après 5 h est inférieur à 50%. </li></ol></li><li> Après une blessure, transférer soigneusement les larves vers une plaque d&#39;agar de jus de fruits contenant environ 0,5 g de pâte de levure. Placez chaque larve de sorte que son extrémité antérieure est sur la pâte de levure, pour une alimentation continue malgré une motilité perturbée. REMARQUE: Pour s&#39;assurer que les nerfs segmentaires larvaires ont été blessés, une motilité larvaire perturbée peut être observée après transfert à la plaque d&#39;agar. Les larves blessées sont effectivement paralysées postérieurement au site de blessure, mais peuvent encore bouger les crochets de la bouche et se nourrir. Un taux de mortalité élevé chez les animaux après une blessure est fréquent, donc il est préférable de blesser 20 à 50% de plus d&#39;animaux que nécessaire pour une expérience. </li><li> Placez des plaques de gélose contenant de la levure et 10 larves blessées dans le fond d&#39;une boîte de Petri vide 100 x 15 mm. Couvrez cette assiette de Petri, contenant maintenant les larves blessées sur une plaque d&#39;agar avec une serviette en papier humide, en veillant à ce que la serviette en papier ne touche pas les larves ou les plaques d&#39;agar. Placez ceciBoîte de Petri dans un récipient plus grand étanche à l&#39;air, à la RT. </li><li> Récupérer les larves pour la dissection après des périodes spécifiées (6, 12 ou 24 h) après une blessure. REMARQUE: Pour examiner les effets immédiats de la blessure sur le cytosquelette axonal, les larves peuvent être disséquées directement après une blessure. Pour examiner les défauts de transport axonal, les larves peuvent être disséquées environ 6 h après une blessure. Environ 12 h après la blessure, une accumulation de protéines ubiquitinées peut être observée et 24 h après une blessure, une dégénérescence des neurones moteurs au NMJ peut être observée. </li></ol> 5. Analyse de la neurodégénérescence au NMJ <ol><li> Dissection Drosophila larvaire NMJ comme décrit précédemment. 15 , 16 En bref, les larves d&#39;épingles sur une assiette de Sylgard, coupent la surface dorsale et filent avec des goupilles dans une goutte de tampon de dissection pour exposer la musculature de la paroi du corps. Réparer les larves dans soit 4% de paraformaldéhyde (PFA), soit la solution de Bouin en fonction de l&#39;antiCorps utilisés pour visualiser les neurones et les muscles. REMARQUE: la fixation de PFA doit être utilisée si des étiquettes de protéines fluorescentes, telles que Green Fluorescent Protein (GFP), doivent être visualisées car le fixateur de Bouin peut être trop sévère. </li><li> Effectuer une immunofluorescence, qui a été décrite précédemment 11 , 13 , 16 , pour marquer simultanément les neurones moteurs pré-synaptiques et les plis musculaires post-synaptiques (SSR) adjacents. Visualiser les membranes présynaptiques et les axones avec de la peroxydase de raifort conjuguée à la fluorescence (1: 300) 17 et les zones actives peuvent être colorées en utilisant un anticorps anti-Bruchpilot (Brp) (nc82; 1: 100; Development-Studies Hybridoma Bank). Diffusez simultanément les muscles post-synaptiques avec un anticorps anti-Dics Large (Dlg) (1: 10 000). 18 </li><li> Effectuer un dosage établi pour quantifier la neurodégénérescence au NMJ comme décrit précédemment. 8 </suP&gt; , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 En bref, visualiser simultanément des NMJ individuels pour les compartiments avant et après la synaptique. Tous les boutons étiquetés avec des marqueurs postsynaptiques mais pas des marqueurs présynaptiques indiquent des sites de neurodégénérescence ( figure 1 ). Le nombre moyen de boutons par NMJ ainsi que le nombre moyen de NMJ par animal peuvent être quantifiés. </li></ol>

<ol><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophilia%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li>
<li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li>
<li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+of+the+Wallenda%2FDLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li>
<li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda%2FDLK+MAP+kinase+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li>
<li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998(2014).</li>
<li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li>
<li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li>
<li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li>
<li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li>
<li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin%2Fankryin%2Fmicrotubule+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li>
<li>Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/9/pdb.rec065672.short">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19329927">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li>
<li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

La blessure mécanique neuronale décrite précédemment et démontrée ici peut être utilisée pour induire une blessure / stress dans les nerfs segmentaires des larves de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Cette technique expérimentale a été utilisée précédemment pour disséquer la séquence temporelle des événements conduisant à une neurodégénérescence, ainsi que pour examiner les changements de t...

La dégénérescence neuronale se produit pendant le développement normal et peut être causée par le processus de vieillissement naturel, les blessures, le stress ou les états pathologiques. Drosophila melanogaster , la mouche commune des fruits, fournit un organisme modèle simple et puissant pour étudier la neurodégénérolat en raison des similitudes remarquables dans les mécanismes moléculaires qui entraînent la dégénérescence des neurones. Ces similitudes sont soulignées par le fait qu&#39;environ 70% des gènes humains associés à la maladie ont un homologue de Drosophila . 1 De plus, de nombreux tests et outils technologiques pour étudier les maladies neurodégénératives humaines ont été développés et utilisés dans la Drosophila . 2 , 3 Dans Drosophila , la jonction neuromusculaire (NMJ) permet d&#39;analyser les propriétés cellulaires et électrophysiologiques et s&#39;est avérée être un système important d&#39;étude de la maladie neuromusculaire due à la N visibleConnexions euron-muscle. 2 Dans cette étude, nous décrivons un test de blessure des neurones in vivo dans les larves de Drosophila qui permet une lésion reproductible des nerfs segmentaires. Cette blessure par motoneurone entraîne une séquence temporelle d&#39;événements cellulaires entraînant une neurodégénérescence à la blessure après 24 h de NMJ. La capacité de reproduire les motoneurons causés par les lésions neurodégénératives a diverses applications telles que l&#39;identification des gènes spécifiques requis pour le processus dégénératif, la dissection des réponses transcriptionnelles aux lésions neuronales et l&#39;analyse des cascades de signalisation de protection. 4 , 5 , 6 Cette méthode a également été utilisée en association avec une microfluidique pour étudier la dégénérescence neuronale et la régénération chez les animaux vivants. 7 Nous utilisons un dosage quantitatif établi pour examiner le dégénérescence des neurones moteursÀ la Drosophila NMJ après une blessure mécanique. Ce dosage est basé sur le fait que la perte de membrane présynaptique et les protéines précèdent le désassemblage du réticulum subsynaptique (SSR) caractérisé par les plis de membrane du muscle postsynaptique. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Ce dosage permet de quantifier les &quot;empreintes synaptiques&quot; où le neurone pré-synaptique a perdu la connexion avec le muscle postsynaptique adjacent. Le processus dégénératif s&#39;est avéré être progressif dans tout le développement larvaire 12 et ne peut être pris en compte par une modification du développement synapse ou de la germination. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 L&#39;annonceLe recours à une lésion mécanique par rapport à des mutations préexistantes est qu&#39;il permet la dissection de la séquence temporelle d&#39;événements cellulaires conduisant à une neurodégénérescence au NMJ. 13

<table><tbody><tr><td>Ciseaux de micro-dissection</td><td>Outils de science fine</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Forceps</td><td>Outils de science fine</td><td>11231-30</td><td>Certaines personnes préfèrent la taille 3, tandis que d’autres préfèrent la taille 5</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Certaines personnes préfèrent la taille 3, tandis que d’autres préfèrent la taille 5</td></tr><tr><td>CO2 Air Tank</td><td>Tech Air</td><td>UN 1013</td><td>Différentes tailles de réservoir peuvent être achetées</td></tr><tr><td>CO2 Appareil d’anesthésie</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Broches en acier inoxydable, taille 0.1</td><td>Outils de science fine</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SylGard 184 Élastomère, base et agent de durcissement de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Pour couler des plaques de dissection</td></tr><tr><td>Bouin’s Solution</td><td>Sigma</td><td>HT 10132-1L</td><td>L’efficacité des anticorps doit être testée dans le</td></tr><tr><td>paraformaldéhyde de Bouin et le PFA 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>FLY-8030-20</td><td>L’efficacité des anticorps doit être testée dans le</td></tr><tr><td>microscope stéréo de dissection de</td> Bouin et PFA <td>AmScope</td><td>SM-1BZ</td><td></td></tr><tr><td>Source lumineuse</td><td>AmScope</td><td>HL150-AY-220V</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-nc82</td><td>Etudes développementales Hybridoma Bank</td><td>nc82-s</td><td></td></tr><tr><td>anti-disques gros anticorps</td><td>Etudes développementales Hybridoma Bank</td><td>AF3</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor anti-raifort peroxydase</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>123-545-021 ; 123-585-021 ; 123-605-021</td><td>On peut vous Alexa Fluor&reg ; 488, 594 ou 647</td></tr><tr><td>Flystuff Jus de raisin Agar Premix</td><td>Genesee Scientific</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-87</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-484C</td><td>Utilisé pour créer une chambre humide pour la récupération des larves</td></tr></tbody></table>

une méthodologie de lésions mécaniques neuronales simples à étudier<em&gt; drosophila</em&gt; dégénérescence du neuron moteur

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

La dégénérescence des neurones se produit pendant le développement normal et en réponse aux blessures, au stress et à la maladie. Les caractéristiques cellulaires de la dégénérescence neuronale sont remarquablement similaires chez les humains et les invertébrés, de même que les mécanismes moléculaires qui conduisent ces processus. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster , fournit un organisme modèle génétique puissant mais simple pour étudier la complexité cellulaire des maladies neurodégénératives. En fait, environ 70% des gènes humains associés à la maladie ont un homologue de Drosophila et une multitude d&#39;outils et de dosages ont été décrits en utilisant des mouches pour étudier des maladies neurodégénératives chez l&#39;homme. Plus précisément, la jonction neuromusculaire (NMJ) dans Drosophila s&#39;est révélée être un système efficace pour étudier les maladies neuromusculaires en raison de la capacité d&#39;analyser les liaisons structurelles entre le neurone et le muscle. Ici, nous rapportons un test de blessure des neurones moteurs in vivo dans Drosophila , quiProvoque de manière reproductible la neurodégénérescence au NMJ de 24 h. En utilisant cette méthodologie, nous avons décrit une séquence temporelle d&#39;événements cellulaires entraînant une dégénérescence des neurones moteurs. La méthode de la blessure a des applications diverses et a également été utilisée pour identifier les gènes spécifiques requis pour la neurodégénérescence et pour disséquer les réponses transcriptionnelles aux lésions neuronales.

En utilisant la procédure présentée ici, nous avons démontré que la lésion neuronale mécanique permet une dissection temporelle des événements neurodégénératifs. 14 , 18 La séquence des événements a été précédemment caractérisée et commence par une perturbation immédiate du cytosquelette, suivie de défauts de traite axonale, d&#39;une accumulation de protéines ubiquitinées et d&#39;une neuro-dégénérescence subséquente après 24 jo...

Nous décrivons ici une méthode simple et largement accessible pour nuire aux nerfs segmentaires dans les larves de Drosophila pour visualiser et quantifier la neurodégénérescence des neurones moteurs à la jonction neuromusculaire (NMJ) des larves du troisième stade.

Une méthodologie de lésions mécaniques neuronales simples à étudier<em&gt; Drosophila</em&gt; Dégénérescence du neuron moteur

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

L'objectif général de cette procédure est d'induire une lésion mécanique des neurones moteurs chez des larves de Drosophila. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les maladies neurodégénératives, comme la séquence temporelle des événements cellulaires menant à la neurodégénérescence. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle est peu coûteuse et qu'elle utilise du matériel que la plupart des laboratoires travaillant sur Drosophila possèdent déjà.Les implications de cette technique s'étendent à la compréhension des mécanismes moléculaires responsables de la neurodégénérescence. Pour commencer le protocole, sélectionnez 10 larves de troisième stade ou de deuxième stade à partir d'un flacon ou d'une bouteille de Drosophila contenant des larves de troisième stade errantes qui ont été cultivées à 25 degrés Celsius. Utilisez une pince pour prélever délicatement chaque larve individuellement à l'aide d'une pince ou d'un pinceau, sans les comprimer.Placer directement les 10 larves dans une boîte en verre contenant du PBS froid 1x pour éliminer tout résidu alimentaire et ralentir la motilité larvaire. Identifier les larves de troisième stade par leurs spiracles antérieurs ramifiés et les larves de deuxième stade par leur taille plus petite et leurs spiracles antérieurs en forme de massue. Placer chaque larve sur un appareil d'anesthésie au CO2.Sous un microscope stéréo, roulez soigneusement chaque larve sur son côté dorsal afin de visualiser les nerfs segmentaires à travers la cuticule. Il est essentiel de rouler soigneusement chaque larve sur son côté dorsal afin de visualiser les nerfs segmentaires à travers la cuticule avant la lésion. En partant des crochets buccaux, placez une pince de taille 5 à environ la moitié jusqu'aux deux tiers de la longueur de la larve.Une fois en position, pincer environ un tiers de la cuticule ventrale contenant les nerfs segmentaires à l’aide de pinces de taille 5. Pour s’assurer que les nerfs segmentaires des larves sont endommagés, appliquer une force suffisante pour broyer les nerfs segmentaires tout en laissant la cuticule intacte. Pour déterminer la force appropriée, broyer 10 larves et s’assurer que le taux de mortalité après cinq heures est inférieur à 50 %. Après la lésion, transférer soigneusement les larves sur une plaque d’agar à jus de fruit contenant environ 0,5 gramme de pâte de levure.Placer chaque larve de manière à ce que son extrémité antérieure soit en contact avec la pâte de levure pour permettre l'alimentation continue. Placer les boîtes de gélose contenant la pâte de levure et 10 larves blessées au fond d'une boîte de Pétri vide de 100 par 15 millimètres. Recouvrir la boîte de Pétri avec une serviette en papier humide, en veillant à ce que la serviette n'entre pas en contact avec les larves ou les boîtes de gélose.Ensuite, placer la boîte de Pétri dans un récipient hermétique à température ambiante. Enfin, récupérer les larves pour la dissection après des périodes spécifiées suivant la lésion. Avant la lésion, les jonctions neuromusculaires de type sauvage, ou JNM, présentent le marqueur de zone active présynaptique Brp en opposition au marqueur postsynaptique Dlg sur l'ensemble de la JNM.Une lésion mécanique des nerfs segmentaires peut induire une neurodégénérescence modérée à sévère, dans laquelle les boutons marqués avec Dlg ne possèdent désormais plus la protéine de la zone active présynaptique Brp. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs étudiant les lésions neuronales d'explorer la séquence temporelle des événements cellulaires menant à la neurodégénérescence au niveau de la jonction neuromusculaire chez Drosophila.

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La jonction neuromusculaire de la drosophile (JNM) est utilisée comme modèle pour étudier la morphologie et la fonction des synapses. Cette vidéo décrit les caractéristiques importantes que les chercheurs quantifient pour caractériser la JNM. L’exemple de protocole fait la démonstration d’un logiciel capable d’effectuer la quantification automatiquement.

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Lésion neuronale induite par un laser à deux photons : une méthode pour observer la dégénérescence et la régénération des axones chez les larves de drosophile

La vidéo démontre l’induction de la neurodégénérescence chez les nerfs segmentaires des larves de drosophile via une lésion mécanique. La cuticule ventrale des larves anesthésiées est pincée à l’aide d’une pince pour causer des lésions aux nerfs segmentaires. Les larves blessées sont maintenues avec de la nourriture, ce qui permet à la blessure de provoquer une dégénérescence des motoneurones dans les nerfs, provoquant une perturbation de leurs jonctions neuromusculaires (NMJ).

Lésion mécanique des nerfs segmentaires des larves de drosophile pour induire une neurodégénérescence

Cette vidéo présente un protocole d’évaluation de l’intégrité structurelle des jonctions neuromusculaires dans les muscles longitudinaux dorsaux de la drosophile. La procédure consiste à colorer les neurones et les muscles avec deux anticorps distincts et à comparer les modèles de fluorescence entre les mouches mutantes et les mouches de type sauvage. Une réduction de la coloration neuronale chez les mouches mutantes indique une neurodégénérescence, tandis que la structure musculaire reste...

Évaluation de l’intégrité structurelle des jonctions neuromusculaires longitudinales dorsales chez la drosophile

Un paradigme blessures en utilisant le cordon Drosophile larvaire nerveuse ventrale pour enquêter régénération du système nerveux central et de la réparation est décrite. Stabbing suivi par microscopie confocale à balayage laser dans des échantillons de time-lapse et fixe, combinée à une analyse quantitative d'un logiciel développé à dessein et de la génétique, sont utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du SNC et de réparation.

Un paradigme d&#39;enquêter sur les blessures du système nerveux central de réparation de<em&gt; Drosophila</em

Larves de drosophile sont un système de modèle intéressant pour l'imagerie en direct en raison de leur cuticule translucide et la génétique puissants. Ce protocole décrit la façon d'utiliser un dispositif de PDMS à une seule couche, appelée la «puce de larve» pour l'imagerie en temps réel de processus cellulaires dans les neurones du 3ème stade larvaire chez la drosophile.

L&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves

Nous présentons ici un protocole utilisant la drosophile neurone sensitif - modèle de blessure de neurone arborisation dendritique (da), qui combine en vivo live imaging, deux photons laser axotomie/dendriotomy et la puissante mouche génétique boîte à outils, comme une plateforme de criblage éventuels promoteurs et inhibiteurs de la neurogenèse.

Un modèle de blessure de Drosophila In Vivo pour étudier la neurogenèse dans le périphérique et le système nerveux Central

Nous décrivons une méthode pour le traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires de Drosophila utilisant des colorants fluorescents lipophiles.

Traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires drosophila à l'aide de colorants fluorescents lipophiles

Ici, nous fournissons des protocoles pour effectuer trois simples essais de dégénérescence d’axone induits par les blessures (mort d’axone) dans Drosophila melanogaster pour évaluer la préservation morphologique et fonctionnelle des axones coupés et de leurs synapses.

Évaluation morphologique et fonctionnelle des axones et de leurs Synapses pendant la mort d’Axon dans Drosophila melanogaster

Le but de cette procédure est de disséquer le tissu longitudinal dorsal (DLM) pour évaluer l’intégrité structurelle des jonctions neuromusculaires DLM (NMJs) dans les modèles de maladies neurodégénératives utilisant Drosophila melanogaster.

Visualisation de la dégénérescence synaptique chez les adultes Drosophila en association avec la neurodégénérescence

Nous décrivons une technique de dissection qui préserve l’architecture de la jonction neuromusculaire et permet une étude immunocytochimique détaillée des motoneurones dans la jambe de la drosophile adulte.

Dissection et immunohistochimie de la jambe adulte de la drosophile pour détecter les changements à la jonction neuromusculaire d’un motoneurone identifié

Apprenez une méthode simple pour induire des lésions mécaniques des nerfs segmentaires chez les larves de Drosophila. Cette technique permet de visualiser et quantifier la neurodégénérescence des neurones moteurs à la jonction neuromusculaire.

Une méthodologie de lésions mécaniques neuronales simples à étudier

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