In Situ MHC-tétramère de coloration et d’analyse Quantitative pour déterminer l’emplacement, l’abondance et le phénotype des cellules T CD8 spécifiques de l’antigène dans les tissus

L’objectif global de cette procédure est de déterminer l’emplacement, l’abondance et le phénotype des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques de l’antigène dans les tissus d’intérêt. Cette méthode permet de répondre rapidement à des questions sur les lymphocytes T CD8 en fournissant un moyen de localiser, de quantifier et de phénotyper pratiquement n’importe quel lymphocyte T CD8 spécifique de l’antigène et n’importe quel tissu. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de déterminer la distribution spatiale des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques de l’antigène par rapport à d’autres cellules et structures au sein des tissus d’intérêt.

La démonstration de la procédure avec Shengbin Li sera faite par Gwantwa Mwakalundwa. Le premier jour de la procédure, utilisez un scalpel pour couper le tissu frais en morceaux d’environ 0,5 x 0,5 centimètre. Ici, le tissu de la rate du macaque rhésus est montré.

Collez séparément chaque fragment de tissu au milieu du haut d’un piston et intégrez les échantillons dans trois à cinq millilitres d’agarose chaude à 4 % à faible point de fusion dans du PBS. Étiquetez les pistons avec les informations pertinentes sur les tissus. Ensuite, placez les échantillons dans un support réfrigéré dans un seau à glace.

Lorsque la gélose s’est solidifiée, allumez le microtome et réglez le réglage de l’épaisseur sur 200 micromètres. Après avoir installé une nouvelle lame de rasoir, insérez les pistons dans le bain de microtome. Remplissez le bain de microtome avec 100 à 200 millilitres de PBS-H fraîchement préparé et ajoutez des glaçons PBS-H pour maintenir la température entre zéro et deux degrés Celsius.

Après avoir obtenu des sections de 200 micromètres, utilisez un pinceau pour retirer la gélose entourant chaque section et transférez les échantillons dans des chambres de tissus individuelles à l’intérieur de puits individuels d’une plaque de culture de tissus de 24 puits contenant un millilitre de PBS-H réfrigéré. Lorsque tous les échantillons ont été acquis, incuber les sections de tissu pendant la nuit dans un millilitre de tétramères du CMH de classe un chargés de peptides conjugués, dilués dans du PBS-H complété par 2 % de sérum de chèvre normal à quatre degrés Celsius avec balancement. Le lendemain matin, transférez chaque chambre tissulaire dans des puits individuels d’une nouvelle plaque à 24 puits contenant un millilitre de PBS-H frais et réfrigéré pendant 20 minutes.

Après le deuxième lavage, fixez les sections dans un millilitre de paraformaldéhyde frais à 4 % pendant deux heures à température ambiante. Suivi de deux lavages de cinq minutes dans du PBS-H froid. Transférez les sections dans une nouvelle plaque à 24 puits contenant 0,01 molaire d’urée et passez les sections au micro-ondes trois fois pendant environ 10 secondes à chaque fois jusqu’à ce que l’urée bout.

Pour perméabiliser et bloquer les échantillons, incubez les sections dans une solution de blocage contenant du PBS-H complétée par un détergent triton x100 à 0,3 % et un sérum de chèvre normal à 2 % sur un transat pendant une heure, à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, transférez les chambres tissulaires dans les puits individuels d’une nouvelle plaque de 24 puits contenant un millilitre de solution contenant un anticorps anti-fitc de lapin, un anticorps CD antihumain de souris et un anticorps CD3 antihumain de rat. Incuber les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec balancement.

Le troisième jour, laver les sections trois fois dans du PBS-H frais à quatre degrés Celsius pendant au moins 20 minutes par lavage et effectuer une incubation finale avec les anticorps secondaires conjugués à la fluorescence appropriés pendant trois jours maximum, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation tertiaire des anticorps, rincez les échantillons en trois lavages de 20 minutes dans du PBS-H frais et utilisez un pinceau pour transférer les échantillons de chaque chambre tissulaire sur une lame de microscope en verre. Enduire chaque section d’un milieu de montage complété par un conservateur fluorophore et recouvrir les échantillons d’une lamelle.

Ensuite, stockez les lames dans un récipient à lames protégé de la lumière, à 20 degrés Celsius. Le jour de l’imagerie, placez la première lame sur la platine d’un microscope confocal et sélectionnez les lasers et les filtres appropriés pour chaque fluorophore utilisé pour marquer l’échantillon de tissu. À l’aide de l’objectif 20x, obtenez séquentiellement une série z à des intervalles de trois microns dans chacun des canaux de fluorophore, dans plusieurs champs de 800 x 800 pixels.

Ensuite, construisez un montage des champs collectés et enregistrez chaque image de montage avec un nom basé sur l’échantillon de tissu correspondant. Dans ces images représentatives, une section colorée avec des tétramères du CMH de classe un chargés d’un peptide SIV est comparée à une section du même tissu, colorée avec des tétramères de classe 1 du CMH chargés d’un peptide non pertinent, démontrant la spécificité de la coloration des tétramères. Sur ces images, les lymphocytes T spécifiques du virus colorés avec un tétramère de classe un du CMH chargé avec le peptide SIV, co-colorants pour CD8, un marqueur de sous-ensemble de lymphocytes T, mais pas CD20, une protéine de surface cellulaire exprimée sur les lymphocytes B.

Ce montage a été créé pour plusieurs champs confocaux de la série z, qui ont été utilisés pour la quantification de cellules colorées au tétramère avec des phénotypes spécifiques et différents compartiments anatomiques sur le ganglion lymphatique. Cette image agrandie met en évidence une zone du ganglion lymphatique de montage qui contient un follicule de lymphocytes B délimité par une coloration IGM. Les cellules colorées au tétramère de classe 1 du CMH, dont certaines co-expriment le marqueur d’activation et de prolifération des lymphocytes T, KI67, peuvent être détectées à l’intérieur et à l’extérieur du follicule des lymphocytes B.

Cette combinaison de coloration permet de déterminer les statuts d’activation et de prolifération des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques du SIV, ainsi que leur localisation dans les tissus lymphoïdes secondaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en cinq jours environ si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que des tissus frais sont essentiels pour une coloration réussie.

Traitez les échantillons dans les 24 heures ou moins après la récolte, en les gardant au frais jusqu’à la fixation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une coloration au tétramère et une immunohistochimie pour déterminer l’emplacement, l’abondance et le phénotype des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques de l’antigène dans les tissus d’intérêt. N’oubliez pas que travailler avec des agents infectieux peut être extrêmement dangereux et que des précautions pour prévenir l’exposition, telles que le port de l’équipement de protection individuelle approprié et la limitation de l’utilisation d’objets tranchants, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.