In Situ MHC-tétramère de coloration et d’analyse Quantitative pour déterminer l’emplacement, l’abondance et le phénotype des cellules T CD8 spécifiques de l’antigène dans les tissus

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la localisation, l'abondance et le phénotype des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques d'un antigène au sein de tissus d'intérêt. Cette méthode permet de répondre rapidement à des questions concernant les lymphocytes T CD8 en offrant un moyen de localiser, quantifier et caractériser phénotypiquement pratiquement n'importe quel lymphocyte T CD8 spécifique d'un antigène, dans n'importe quel tissu. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à déterminer la distribution spatiale des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques d'un antigène par rapport aux autres cellules et structures présentes dans les tissus d'intérêt.

La procédure sera démontrée par Gwantwa Mwakalundwa avec Shengbin Li. Le premier jour de la procédure, utilisez un scalpel pour découper le tissu frais en morceaux d'environ 0,5 x 0,5 centimètre. Ici, un tissu splénique de macaque rhésus est illustré.

Collez séparément chaque fragment de tissu au milieu de la partie supérieure d'un piston et incluez les échantillons dans trois à cinq millilitres d'agarose à faible point de fusion à 4 % tiède dans du PBS. Étiquetez les pistons avec les informations pertinentes relatives au tissu. Ensuite, placez les échantillons dans un support refroidi placé dans un seau à glace.

Lorsque l'agar a solidifié, allumez le microtome et réglez l'épaisseur sur 200 micromètres. Après avoir installé une lame neuve, insérez les plongeurs dans le bain du microtome. Remplissez le bain du microtome avec 100 à 200 millilitres de PBS-H fraîchement préparé et ajoutez des glaçons de PBS-H pour maintenir la température entre zéro et deux degrés Celsius.

Après avoir obtenu des sections de 200 micromètres, utilisez un pinceau pour retirer l'agar entourant chaque section et transférez les échantillons dans des chambres tissulaires individuelles placées dans des puits séparés d'une plaque de culture tissulaire 24 puits contenant un millilitre de PBS-H froid. Une fois tous les échantillons collectés, incubez les sections tissulaires toute la nuit dans un millilitre de tétramères de classe I du CMH chargés en peptide conjugué à la fluoresceine, dilués dans du PBS-H supplémenté avec 2 % de sérum de chèvre normal, à quatre degrés Celsius sous agitation. Le lendemain matin, transférez chaque chambre tissulaire dans des puits individuels d'une nouvelle plaque 24 puits contenant un millilitre de PBS-H frais et froid pendant 20 minutes.

Après le deuxième lavage, fixer les sections dans un millilitre de paraformaldéhyde frais à 4 % pendant deux heures à température ambiante. Procéder ensuite à deux lavages de cinq minutes dans du PBS-H froid. Transférer les sections dans une nouvelle plaque de 24 puits contenant de l'urée 0,01 molaire et chauffer les sections au micro-ondes trois fois, environ 10 secondes à chaque fois, jusqu'à ce que l'urée bout.

Pour perméabiliser et bloquer les échantillons, incuber les sections dans une solution de blocage contenant du PBS-H supplémenté avec un détergent Triton X-100 à 0,3 % et 2 % de sérum de chèvre normal, sur un agitateur rotatif pendant une heure à quatre degrés Celsius. À la fin de l'incubation, transférer les chambres tissulaires dans des puits individuels d'une nouvelle plaque de 24 puits contenant un millilitre de solution contenant un anticorps anti-FITC de lapin, un anticorps anti-CD humain de souris et un anticorps anti-CD3 humain de rat. Incuber les échantillons toute la nuit à quatre degrés Celsius sous agitation.

Le troisième jour, laver les sections trois fois dans du PBS-H frais à quatre degrés Celsius pendant au moins 20 minutes par lavage, puis effectuer une incubation finale avec les anticorps secondaires marqués par un fluorophore approprié pendant une durée allant jusqu'à trois jours, à l'abri de la lumière. À la fin de l'incubation avec l'anticorps tertiaire, rincer les échantillons par trois lavages de 20 minutes dans du PBS-H frais, puis utiliser un pinceau pour transférer les échantillons de chaque chambre tissulaire sur une lame de microscope en verre. Recouvrir chaque section d'un milieu de montage enrichi d'un conservateur de fluorophore, puis placer une lamelle par-dessus les échantillons.

Ensuite, conserver les lames dans un contenant pour lames protégé de la lumière, à 20 degrés celsius. Le jour de l'acquisition d'images, placer la première lame sur la platine d'un microscope confocal et sélectionner les lasers et filtres appropriés pour chaque fluorophore utilisé afin de marquer l'échantillon de tissu. À l'aide de l'objectif 20x, acquérir séquentiellement une série en z par intervalles de trois microns dans chacun des canaux de fluorophores, sur plusieurs champs de 800 x 800 pixels.

Ensuite, construire un montage des champs recueillis et enregistrer chaque image de montage sous un nom basé sur l'échantillon de tissu correspondant. Sur ces images représentatives, une section marquée avec des tétramères de la classe I du CMH chargés avec un peptide du VIH est comparée à une section du même tissu marquée avec des tétramères de la classe I du CMH chargés avec un peptide non spécifique, démontrant ainsi la spécificité du marquage par les tétramères. Sur ces images, les lymphocytes T spécifiques du virus marqués avec le tétramère de la classe I du CMH chargé avec le peptide du VIH présentent un double marquage pour CD8, un marqueur de sous-population de lymphocytes T, mais pas pour CD20, une protéine de surface cellulaire exprimée par les lymphocytes B.

Cette mosaïque a été créée à partir de plusieurs champs en série z confocaux, utilisés pour la quantification de cellules marquées par des tétramères présentant des phénotypes spécifiques et situées dans différents compartiments anatomiques du ganglion lymphatique. Cette image agrandie met en évidence une région de la mosaïque du ganglion lymphatique contenant un follicule B délimité par la coloration de l’IgM. Des cellules marquées par des tétramères de classe I du CMH, dont certaines coexpriment le marqueur d’activation et de prolifération des lymphocytes T, KI67, peuvent être détectées à l’intérieur et à l’extérieur du follicule B.

Cette combinaison de coloration permet de déterminer les états d'activation et de prolifération des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques du SIV, ainsi que leur localisation au sein des tissus lymphoïdes secondaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq jours si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que le tissu frais est essentiel pour une coloration réussie.

Traitez les échantillons dans les 24 heures suivant la récolte ou moins, en les maintenant au frais jusqu'à la fixation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une coloration par tétramère et une immunohistochimie afin de déterminer la localisation, l'abondance et le phénotype des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques de l'antigène dans les tissus d'intérêt. N'oubliez pas que le travail avec des agents infectieux peut être extrêmement dangereux et que des précautions destinées à prévenir l'exposition, telles que le port d'équipements de protection individuelle adaptés et la limitation de l'utilisation d'objets tranchants, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.