Protocole de laboratoire pour les Analyses de contenu Gut génétiques de macroinvertébrés aquatiques Using Group-specific ADNr amorces

L’objectif général de ce protocole est d’améliorer les études de l’écologie trophique, en particulier à partir d’échantillons de terrain. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’écologie du réseau trophique, telles que l’impact des espèces envahissantes sur les interactions trophiques. Le principal avantage est l’application supplémentaire à plus de temps en intégrant les analyses trophiques pour exactement les mêmes spécimens et qu’il peut être appliqué par pratiquement tous les écologistes.

Bien que nous ayons établi cette approche pour donner un aperçu de la consommation de proies des consommateurs aquatiques, elle peut également être appliquée à d’autres fins, par exemple pour déterminer la composition des espèces dans les échantillons de macroinvertébrés benthiques. La démonstration de la procédure sera assurée par Christian Sodemann, un technicien de notre laboratoire. Pour commencer cette expérience, transférez le tractus gastro-intestinal du prédateur précédemment disséqué dans un tube de réaction de deux millilitres contenant 440 microlitres de tampon d’extraction de sel.

Congelez immédiatement les échantillons à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’extraction de l’ADN. Après avoir sorti les échantillons du congélateur, commencez l’extraction de l’ADN à l’aide d’une pince pour ajouter une bille d’acier inoxydable de cinq millilitres à chaque tube d’échantillon, puis laissez les échantillons sur la paillasse à température ambiante pour décongeler. À l’aide d’un broyeur à billes, homogénéiser les échantillons pendant une minute à 15 hertz.

Après avoir fait tourner les échantillons brièvement, ajoutez 90 microlitres de 10 % de SDS et cinq microlitres de 10 milligrammes par millilitre de protéinase K aux échantillons. Ensuite, faites tourbillonner soigneusement les échantillons et incubez-les à 60 degrés Celsius en secouant constamment à 400 tr/min sur un ThermoMixer pendant une heure. Pour favoriser davantage la lyse, agitez les échantillons toutes les 10 minutes pendant cette incubation.

Après une courte centrifugation, pipeter 350 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires dans les échantillons. Agitez pendant 30 secondes à une minute pour mélanger complètement les échantillons. Ensuite, centrifugez à 16, 200 fois g à cinq degrés Celsius pendant 40 minutes.

Ainsi, l’une des choses les plus critiques lors du retrait des échantillons de la centrifugeuse est d’éviter que les billes ne bougent et ne perturbent la pastille contenant toutes les particules qui doivent être éliminées par l’étape. Ensuite, transférez soigneusement environ 600 microlitres de surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, en veillant à ne pas déranger la pastille. Ajoutez 600 microlitres d’isopropanol glacé et retournez soigneusement le tube plusieurs fois.

Conserver à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir sorti les échantillons du congélateur, centrifugez-les à 16, 200 fois g à température ambiante pendant 20 minutes. Jetez le surnageant en vous assurant de ne pas perdre la pastille, et utilisez un papier de soie pour sécher soigneusement le tube.

Lavez ces granulés contenant de l’ADN en ajoutant 200 microlitres d’éthanol glacé à 70 %, puis en centrifugeant à 16 200 fois g à température ambiante pendant 10 minutes. Jetez le surnageant avec prudence et utilisez du papier de soie non pelucheux pour sécher soigneusement le tube. Enfin, à l’aide d’une pipette de 10 microlitres réglée à huit microlitres, retirez soigneusement le surnageant restant, en veillant à ne pas déranger la pastille.

Séchez le granulé jusqu’à ce que tout l’éthanol se soit évaporé. Ajoutez ensuite 50 à 100 microlitres d’eau sans nucléases, agitez brièvement et laissez à quatre degrés Celsius toute la nuit pour dissoudre la pastille. Pour vérifier l’efficacité fonctionnelle des échantillons d’ADN extraits ici, testez chacun d’eux par PCR, à l’aide de jeux d’amorces universels adaptés à la source de nourriture respective.

Commencez par ajouter des amorces, un mélange dNTP, un tampon de réaction, de l’ADN polymérase Taq et de l’eau purifiée dans un tube réactionnel de 1,5 ou 2,5 millilitres et en vortex le mélange réactionnel standard. Maintenant, pour chaque échantillon d’ADN, transférez un microlitre d’extrait d’ADN correspondant dans neuf microlitres du mélange réactionnel standard dans une plaque PCR. Fermez la plaque, placez-la dans le thermocycleur et démarrez le programme PCR.

Une fois la réaction PCR terminée, utilisez une option de tirage court d’une mini-centrifugeuse pour faire tourner les produits PCR. Mélangez ensuite trois microlitres de chaque produit PCR avec un microlitre de six fois le colorant de chargement. Chargez ces échantillons dans les fentes d’un gel d’agarose préalablement préparé.

Chargez 1,5 microlitre d’une échelle d’ADN de 100 paires de bases dans une fente du gel comme norme de taille. Fermez le couvercle de l’unité d’électrophorèse, connectez-le à une alimentation électrique et faites fonctionner le gel à 100 volts par centimètre pendant 35 minutes. Après l’électrophorèse, retirez le gel et placez-le dans un bain de coloration préalablement préparé pendant environ 10 minutes.

Enfin, retirez le gel du bain de coloration et placez-le sur un système de documentation du gel, et visualisez-le conformément au manuel. Pour analyser le contenu intestinal des prédateurs, utilisez des solutions de travail d’extrait d’ADN préalablement préparées. Effectuez des réactions PCR distinctes pour chacun des 16 ensembles d’amorces spécifiques au groupe de proies.

Inclure un témoin positif avec l’ADN d’un spécimen appartenant au groupe de proies respectif et un témoin négatif avec l’ADN de l’espèce prédatrice. Il est crucial de documenter exactement l’allocation de l’échantillon dans chaque plaque de PCR pour éviter de regrouper différents échantillons tout en les chargeant sur une plaque de séquençage pour la détection d’un séquenceur de lotissement et en attribuant finalement les mauvais résultats à un consommateur. Ensuite, exécutez les réactions PCR en utilisant le même protocole que celui décrit précédemment, ajusté à la température de recuit spécifique et au numéro de cycle pour chaque jeu d’amorces utilisé.

Pour détecter les fragments amplifiés dans ces réactions PCR, exécutez des analyses de fragments automatisées en deux lots, A et B.Préparez un mélange contenant une solution de chargement d’échantillons, ou SLS, et l’étalon de taille respectif pour chaque lot. Ensuite, décongelez les produits PCR préalablement congelés des huit réactions PCR appartenant au lot respectif, en veillant à ce qu’ils soient conservés dans l’obscurité. Utilisez l’option de tirage court d’une mini-centrifugeuse pour les faire tourner.

Sur une plaque de séquençage, chargez le nombre de puits correspondant au nombre d’échantillons à analyser avec 22 microlitres du mélange standard de taille SLS respectif pour chaque échantillon. Chargez ensuite un microlitre de produit PCR de chacune des huit réactions PCR dans les puits respectifs de la plaque. Ensuite, utilisez une option de tirage court d’une mini centrifugeuse à plaques pour faire tourner soigneusement ce mélange.

Après cela, couvrez chaque puits avec une goutte d’huile minérale. Remplissez ensuite les puits réactionnels d’une plaque tampon avec 250 à 300 microlitres de tampon de séparation de l’ADN. Utilisez le logiciel du séquenceur capillaire pour créer une configuration d’échantillon selon les instructions du fabricant.

Assurez-vous que l’allocation des échantillons dans la configuration d’échantillons correspond à l’allocation d’échantillons dans la plaque de séquençage et que la configuration d’échantillons contient la méthode appropriée pour traiter le lot respectif. Lors de l’analyse des résultats, il est important de revérifier visuellement l’électrophérogramme de chaque échantillon et de confirmer/annuler chaque pic appelé pour chaque ensemble d’amorces de marqueur séparément et d’insérer manuellement les pics non appelés qui correspondent aux critères d’un ensemble d’amorces de marqueur ou de supprimer les mauvais. Après avoir mené des expériences d’alimentation pour déterminer l’efficacité des ensembles d’amorces spécifiques au groupe établis pour les analyses PCR effectuées dans ce protocole, les résultats de la PCR utilisant l’ADN du tractus gastro-intestinal des prédateurs ont été analysés à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose ainsi que du polymorphisme de conformation simple brin, ou SSCP.

L’électrophorèse sur gel d’agarose a révélé des bandes uniques d’ADN double brin, qui n’ont pas pu être distinguées entre les différentes espèces de proies étudiées. En revanche, l’électrophorèse SSCP a réussi à distinguer les différentes espèces de proies en comparant les échantillons de contenu intestinal avec les échantillons de référence. L’ADN extrait de l’intestin de l’acarien après l’expérience d’alimentation a été séquencé à différentes périodes de temps après la consommation de proies.

De une à 50 heures après l’alimentation, les quantités relatives d’ADN de proie détectées ont été considérablement réduites. L’ADN extrait de l’amphipode envahissant, Dikerogammarus villosus gut, a été testé pour l’ADN de proies macroinvertébrées à l’aide de 16 ensembles d’amorces spécifiques au groupe décrits dans ce protocole. Seulement 16 % du contenu intestinal de D. villosus était positif pour l’ADN appartenant à l’un des 16 taxons de proies ciblés.

De plus, l’ADN de 12 taxons de proies testés a été trouvé dans au moins un échantillon, tandis que l’ADN de quatre taxons n’a jamais été détecté. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler que les amorces utilisées sont spécifiques aux taxons de votre système. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étendre vos recherches sur les interactions trophiques en complétant les méthodes couramment utilisées dans votre laboratoire par des analyses génétiques.