Stéréotaxique Atlas guidée Laser Microdissection de saisie des régions cérébrales touchées par lésion traumatique

L'objectif général de ce protocole de microdissection par capture laser est de recueillir des cellules provenant de régions cérébrales spécifiques affectées par un traumatisme crânien afin d'effectuer une analyse moléculaire. Je suis le docteur Helen Hellmich. Mon assistant diplômant, Harris Weisz, qui est étudiant en programme de physiopathologie humaine et de médecine translationnelle à la branche médicale de l'Université du Texas, va démontrer comment nous utilisons les méthodes de microdissection par capture laser dans nos études sur les lésions cérébrales.

Cette méthode pourrait aider à élucider les mécanismes et les conséquences des modifications induites par un traumatisme crânien dans des régions cérébrales spécifiques, telles que le cortex frontal, qui contrôle les fonctions exécutives, et l'hippocampe, qui est important pour les processus dépendants de la mémoire. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons étudier l'effet d'un processus pathologique sur plusieurs régions cérébrales distinctes ou sur des types cellulaires individuels provenant d'un même cerveau.

Avant toute procédure de microdissection laser impliquant une analyse transcriptionnelle, nettoyez toutes les surfaces avec le détergent RNace pour éliminer tout risque de contamination et de dégradation de l'ARN. Récupérez le tissu cérébral du stockage et placez-le dans un cryostat refroidi à moins 20 degrés Celsius.

Laisser le cerveau s'équilibrer à la température de la chambre du cryostat pendant environ dix minutes. Placer le cerveau, côté ventral vers le haut, sur une feuille de gaze située sur la platine du cryostat. À l'aide d'un rasoir à ARN propre, sectionner la partie postérieure juste au rostral du cervelet et la partie située juste au rostral du chiasma optique.

Déposer une petite quantité de milieu optimal pour la congélation dans deux moules cryogéniques distincts. Placer le cerveau contenant le cortex frontal d'association et le noyau accumbens dans l'un des moules cryogéniques, côté intérieur vers le bas. Ajouter suffisamment de milieu OCT pour recouvrir le tissu.

Répétez cette étape avec le fragment de tissu cérébral contenant l'hippocampe et le noyau suprachiasmatique. Laissez complètement geler le milieu OCT pendant environ 20 minutes dans le cryostat. Une fois que le tissu et le milieu OCT sont complètement gelés, pressez une petite quantité d'OTC sur une tête de montage.

Appuyez un moule cryogénique congelé sur la tête de montage et laissez l’OCT geler complètement afin que le moule contenant le tissu soit solidement fixé à la tête. Fixez l’accessoire de tête sur le support de coupe et serrez la vis. Réglez l’angle de coupe par rapport à la lame du cryostat à l’aide des leviers de réglage pour garantir que les sections soient coupées de manière uniforme.

Régler l'épaisseur des sections à 30 microns. Lors de la coupe du bloc de tissu contenant l'hippocampe et les SEN, continuer la section jusqu'à ce que le chiasma optique soit aplati au niveau du bregma à 0,48 millimètre, lorsque le troisième ventricule devient apparent. Ensuite, récupérer les sections pour le MEB à partir de ce point en plaçant délicatement des lames recouvertes de membrane de naphtalate de polyéthylène à température ambiante sur la surface du tissu sectionné.

Vérifiez visuellement l'adhérence à la lame en vous assurant que le tissu et l'OTC sont complètement fondus sur la lame. Conservez toutes les lames avec les sections de tissu dans le cryostat jusqu'au moment de la coloration. Arrêtez la collecte des sections au niveau du bregma à 0,72 millimètre, lorsque commence la décussation supratoptique.

Pour la collecte de l'hippocampe, sectionner jusqu'à ce que les cornes de la couche granulaire du gyrus denté soient visibles au niveau du bregma à 3,00 millimètres. Prélever les sections jusqu'à ce que les sous-champs CA de l'hippocampe soient fusionnés dans les sections coronales au niveau du bregma à 4,78 millimètres. Cela permet une collecte complète de l'hippocampe sous le site de craniotomie et de lésion.

Avant la coloration, laver tout le matériel et la zone de coloration dans une hotte chimique avec un détergent éliminant les RNases. Prendre le porte-lames du cryostat et le placer dans la hotte. Laisser les lames se réchauffer pendant 30 secondes.

Colorer les sections avec du violet de crésyle et les dégorger avec du sérum physiologique. Laisser sécher à l'air la boîte de lames colorées pendant pas plus de dix minutes à température ambiante dans la hotte. Une fois sèches, passer immédiatement à la microdissection laser (LCM).

Avant de commencer toute procédure de microdissection laser destinée à l'analyse d'ARN, nettoyez soigneusement la zone de collecte et l'espace autour de l'appareil à l'aide d'un détergent éliminant les ARNases et d'éthanol à 100 %. Activez l'interrupteur d'alimentation de l'unité générant le laser infrarouge avant d'allumer la base du microscope, puis laissez le système s'initialiser avant de démarrer le logiciel depuis le bureau. Une fois le logiciel chargé et ses étapes d'initialisation terminées, ouvrez le panneau de configuration du logiciel et appuyez sur le bouton de positionnement de la platine.

La platine modulaire va se déplacer à la position permettant le chargement et le déchargement des capsules macro LCM et des lames. Placez jusqu'à trois lames à membrane en stylo dans les supports, le bord mat orienté vers la droite. Sélectionnez la zone de manipulation des capsules et des lames adjacente à la lame respective, puis cliquez sur la case à cocher MEM pour indiquer au logiciel que des lames en verre à membrane ont été chargées.

Cliquez ensuite sur la diapositive souhaitée à capturer en premier. Pour capturer une image en mosaïque afin de localiser et d'orienter le tissu pour le positionnement des capuchons, sélectionnez l'option image dans la barre d'outils et choisissez acquérir un aperçu. Placez le curseur sur la zone de l'image en mosaïque, cliquez avec le bouton droit et sélectionnez placer le capuchon au centre de la région.

Le logiciel placera automatiquement un bouchon sur la position sélectionnée. Après avoir localisé les lasers infrarouge et ultraviolet, choisissez l'option de dessin à main levée dans le panneau des outils de sélection. À l'aide d'un stylet tactile, dessinez autour du périmètre de la région d'intérêt en veillant à ne pas perdre le contact entre l'écran tactile et la pointe du stylet.

Veillez à relier les points de départ et d'arrivée. Pour la collecte de l'hippocampe, utilisez la capture laser pour isoler les sous-régions hippocampiques CA1, CA2 et CA3 en partant de la bregma à 3,00 millimètres, en utilisant la couche granulaire complètement formée du gyrus dentelé comme repère physique pour l'identification morphologique. Après la collecte, déplacez les capsules macro LCM vers la position de contrôle qualité (QC) et vérifiez l'adhérence complète du tissu en vous assurant visuellement que le tissu découpé par ultraviolets est bien fixé à la membrane.

Il est impératif que le laser UV découpe entièrement tout autour du tissu. En cas d'omission, l'adhérence du tissu sur le capot de MAC sera incomplète. Ensuite, placez rapidement chaque capot dans un tube à réaction de 0,5 millilitre sans RNase et à paroi mince contenant 100 microlitres de tampon de lyse cellulaire.

Vortexez brièvement les échantillons pour assurer une lyse complète et stockez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu'au moment de réaliser l'analyse génomique en aval. Voici des images représentatives de coupes tissulaires prélevées du côté épilésional du site de lésion, à l'aide des fonctions laser infrarouge et ultraviolette du système de microdissection par capture laser (LCM). Il s'agit d'une région du cortex frontal associatif.

Cette image montre la même région après la collecte. Et voici le tissu sur le capuchon après la collecte. Cette image montre les composants des couches parameatales CA1, CA2 et CA3 de l'hippocampe situées à côté des cornes complètement formées de la couche granulaire du gyrus dentelé.

Les régions CA2 et CA3 ont été collectées et ces populations cellulaires sont visibles sur le capuchon. Ici, une zone du noyau accumbens, située en position proximale et rostrale par rapport à la commissure antérieure, a été ciblée et fidèlement reproduite sur le capuchon. Enfin, le noyau suprachiasmatique, situé en position rostrale par rapport au chiasma supraoptique, a été capturé par microdissection laser après un traumatisme crânien.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour traiter un cerveau en environ huit heures. Cela inclut le traitement des tissus, la coloration et la microdissection laser. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme l'analyse épigénétique, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions concernant les profils de méthylation ou l'expression des microARN.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment effectuer la microdissection laser sur plusieurs régions cérébrales d'un même cerveau.