Stéréotaxique Atlas guidée Laser Microdissection de saisie des régions cérébrales touchées par lésion traumatique

L’objectif global de ce protocole de microdissection par capture laser est de collecter des cellules de régions cérébrales spécifiques affectées par une lésion cérébrale traumatique pour une analyse moléculaire. Je suis le docteur Helen Hellmich. Mon assistant diplômé, Harris Weisz, qui est étudiant dans le programme de physiopathologie humaine et de médecine translationnelle ici à la branche médicale de l’Université du Texas, va démontrer comment nous utilisons des méthodes de microdissection par capture laser dans nos études sur les lésions cérébrales.

Cette méthode pourrait aider à élucider les mécanismes et les conséquences des changements induits par les TCC dans des régions cérébrales discrètes, telles que le cortex frontal, qui contrôle les fonctions exécutives. Et l’hippocampe qui est important pour les processus dépendants de la mémoire. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons étudier l’effet d’un processus pathologique sur plusieurs régions cérébrales discrètes ou des types de cellules individuelles du même cerveau.

Avant toute procédure de PPL qui comprend une analyse transcriptionnelle, nettoyez toutes les surfaces avec un détergent éliminant le RNace pour atténuer le risque de contamination et de dégradation de l’ARN. Récupérez le tissu cérébral du stockage. Et placez-le dans un cyrostat refroidi à moins 20 degrés Celsius.

Laissez le cerveau s’équilibrer à la température de la chambre du cryostat pendant environ dix minutes. Placez le cerveau, face ventrale vers le haut, sur une feuille de gaze au-dessus de l’étage du cryostat. Avec une lame de rasoir à ARN propre, coupez la partie postérieure juste rostrale au cervelet et la partie juste en avant du chiasma optique.

Placez une petite quantité de milieu de coupe à température de coupe optimale dans deux moules cryogéniques séparés. Placez le cerveau contenant le cortex d’association frontale et le noyau accumbens dans un moule cryogénique à l’intérieur vers le bas. Ajouter suffisamment de milieu OCT pour couvrir le tissu.

Répétez cette étape avec le morceau de tissu cérébral contenant l’hippocampe et le noyau suprachiasmatique. Laissez le milieu OCT geler complètement pendant environ 20 minutes dans le cryostat. Une fois que le tissu et le milieu OCT sont complètement congelés, pressez une petite quantité d’OTC sur une tête de montage.

Appuyez sur un cryomoule congelé sur la tête de montage et laissez l’OCT geler complètement afin que le moule contenant le tissu soit solidement fixé à la tête. Fixez la tête de fixation au support de sectionnement et serrez la vis. Ajustez l’angle de coupe par rapport à la lame du cryostat à l’aide des leviers de réglage pour vous assurer que les sections seront coupées uniformément.

Réglez l’épaisseur de la section sur 30 microns. Lors de la section du bloc tissulaire contenant l’hippocampe et le SEN, sectionnez jusqu’à ce que le chiasma optique soit aplati au bregma 0,48 millimètres Lorsque le troisième ventricule devient apparent. Ensuite, prélevez des sections pour le MEB à partir de ce point en plaçant doucement des lames de membrane de polyéthylène naptalate à température ambiante sur le dessus du tissu sectionné.

Assurez-vous visuellement de l’adhérence à la lame en confirmant que le tissu et l’OTC sont complètement fondus sur la lame. Conservez toutes les lames avec des coupes de tissu dans le cryostat jusqu’à la coloration. Arrêter les sections de collecte à 0,72 millimètre lorsque la décussation supraoptique commence.

Pour la collecte de l’hippocampe, sectionner jusqu’à ce que les cornes de la couche cellulaire granulaire du gyrus denté soient visibles à 3,00 millimètres. Collectez des sections jusqu’à ce que les sous-champs CA de l’hippocampe soient fusionnés dans les sections coronales à 4,78 millimètres. Cela permet une collecte complète de l’hippocampe sous la craniotomie et le site de la blessure.

Avant de tacher, lavez toute la vaisselle et la zone tachée dans une hotte chimique avec un détergent éliminant la RNase. Prenez la grille des côtés du cryostat et placez-la dans la hotte. Laissez les diapositives chauffer pendant 30 secondes.

Teindre les sections avec du violet de crésyle et nettoyer avec du sérum physiologique. Laissez le rack de lames tachées sécher à l’air libre pendant dix minutes maximum à température ambiante dans la hotte. Une fois séché, passez immédiatement au LCM.

Avant de commencer toute procédure LCM pour l’analyse de l’ARN, essuyez la zone de collecte et la zone autour de l’appareil avec un détergent éliminant l’ARNase et de l’éthanol à 100 %. Actionnez l’interrupteur d’alimentation de l’unité de génération de laser infrarouge avant d’allumer la base du microscope et laissez le système s’initialiser avant que le logiciel ne soit démarré à partir du bureau. Une fois que le logiciel est démarré et exécuté, il s’agit des étapes d’initialisation, ouvrez le panneau de configuration du logiciel et appuyez sur le bouton de l’étape actuelle.

La platine modulaire se déplacera jusqu’à la position où les macro-bouchons et les glissières LCM seront chargés et déchargés. Placez jusqu’à trois glissières de membrane de stylet dans les supports avec le bord givré vers la droite. Sélectionnez la zone de manipulation du capuchon et de la lame à côté de la diapositive correspondante et cliquez sur la case à cocher MEM pour indiquer au logiciel que les lames de verre à membrane ont été chargées.

Cliquez ensuite sur la diapositive souhaitée à capturer en premier. Pour capturer une image en mosaïque pour l’emplacement et l’orientation des tissus pour le placement des capuchons, sélectionnez image dans la barre d’outils et sélectionnez Acquérir une vue d’ensemble. Placez le curseur sur la zone de l’image en mosaïque, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Placer le capuchon au centre de la région.

Le logiciel placera automatiquement un capuchon sur la position sélectionnée. Après avoir localisé les lasers infrarouges et UV, choisissez l’option de dessin à main levée dans le volet de sélection des outils. À l’aide du stylet de l’écran tactile, tracez autour du périmètre de la région d’intérêt tout en vous assurant de ne pas perdre le contact entre l’écran tactile et la tête du stylet.

Assurez-vous de relier les points de début et d’arrivée ensemble. Pour la collecte de l’hippocampe, capturez au laser les sous-champs de l’hippocampe CA1, CA2 et CA3 à partir de 3,00 millimètres et en utilisant la couche granulaire complètement formée du gyrus denté comme point de repère physique de l’identification morphologique. Après la collecte, placez les macrocapuchons LCM en position de contrôle qualité et vérifiez l’adhérence complète du tissu en vous assurant visuellement que le tissu coupé par UV est fixé à la membrane.

Il est impératif que le laser UV coupe l’ensemble du tissu. Le non-respect de cette consigne entraînera une adhérence incomplète des tissus à la coiffe LCM. Ensuite, placez rapidement chaque capuchon dans un tube de réaction à paroi mince de 0,5 millilitre sans RNAse contenant 100 microlitres de tampon de lisus cellulaire.

Vortex brièvement les échantillons pour s’assurer qu’ils sont complets et stockez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à effectuer une analyse génomique en aval. Voici des images représentatives de coupes de tissus prélevées du côté épicilatéral du site de la blessure avec des fonctions laser infrarouge et UV sur le système LCM. Il s’agit d’une zone du cortex d’association frontale.

Cette image montre la même région après la collecte. Et c’est le tissu sur le chapeau après le prélèvement. Cette image montre les composants des couches paraméales CA1, CA2 et CA3 de l’hippocampe situées à côté des cornes entièrement formées de la couche granual du gyrus denté.

Les régions CA2 et CA3 ont été collectées et ces populations cellulaires sont visibles sur le chapeau. Ici, une zone du noyau accumbens du noyau proximal adrostral à la commissure antérieure a été ciblée a été fidèlement reproduite sur le chapeau. Enfin, le noyau rostral suprachiasmatique du chiasma supraoptique a été capturé par le LCM après un traumatisme crânien.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour traiter un cerveau en environ huit heures. Cela comprend le traitement des tissus, la coloration et le LCM. Après cette procédure, d’autres méthodes, comme l’analyse épigénétique, peuvent être effectuées pour répondre aux questions concernant les modèles de méthylation ou l’expression micronique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la LCM sur plusieurs régions du cerveau sur le même cerveau.