Name: Stéréotaxique Atlas guidée Laser Microdissection de saisie des régions cérébrales touchées par lésion traumatique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Apprenez la microdissection par capture laser pour isoler des cellules cérébrales spécifiques après lésion traumatique chez le rat. Cette méthode permet d'analyser l'expression des gènes et des microARN dans le cortex frontal et l'hippocampe.

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Nous tenons à remercier Elizabeth Sumner pour son aide à l’édition de ce manuscrit. Ce projet a été financé en partie par The Moody Project pour translationnelle Traumatic Brain Injury Research and RO1NS052532 de HLH.

Remarque : toutes les expérimentations animales sont approuvées par le Comité de l’urbanisme de l’Université du Texas Medical Branch, Galveston, Texas et d’institutionnels animalier tel que prescrit par les instituts nationaux de Guide de santé pour le soin et l’utilisation de Animaux de laboratoire (8e édition, National de recherches du Conseil).
 1. prélèvement tissulaire, l’Identification de la région et sectionnement <ol><li>adulte de sujet, masculin, rats Sprague-Dawley, âgé d’environ six semaines et 250-300 g, à l’injure de percussion fluides expérimentale, comme décrit dans la Shimamura et al. 4.</li> <li>vingt-quatre heures après l’expérimentation TBI, humainement euthanasier les animaux en les plaçant dans une chambre avec une concentration d’isoflurane de 4 % jusqu'à ce que profondément anesthésiés. Assurer la mort par décapitation, le cerveau de l’accise et congeler immédiatement en glace sèche en poudre. Conserver congelé cerveaux dans un congélateur à-80 ° C jusqu’au sectionnement.</li>
	<li>Préalable à toute procédure de LCM qui inclut l’analyse transcriptionnelle, nettoyer toutes les surfaces avec de la RNase éliminant détergent pour limiter les risques de contamination et de la dégradation de l’ARN. 
	NOTE : Ce nettoyage comprend la superficie utilisée pour la coloration, le cryostat où le tissu est sectionné, et la zone autour de l’appareil de LCM.</li>
	<li>Récupérer le tissu cérébral de stockage et de la placer dans un cryostat refroidi à -20 ° C. laisser le cerveau est proportionnelle à la température de la chambre de cryostat pour ~ 10 min.</li>
	<li>Placer la face ventrale du cerveau vers le haut sur une feuille de gaze sur le dessus de la scène du cryostat. Avec une lame de rasoir propre et exempte de RNase, couper la portion postérieure juste rostral au cervelet (peuvent être sauvegardés ou mis au rebut) et la partie juste en avant du chiasma (och).</li>
	<li>Placer une petite quantité de moyenne température (OCT) de coupe optimale dans deux cryomolds distincts. Placer le cerveau (contenant le cortex frontal association (FrA) et le noyau accumbens de noyau (AcbC)) dans la partie antérieure de cryomolds vers le bas. Ajouter le support de OCT suffisante pour couvrir le tissu.
	<ol><li>Répétez cette étape avec le tissu de cerveau contenant l’hippocampe (Hp) et le noyau suprachiasmatic (SCN).</li>
		<li>Laisser le milieu OCT à geler complètement pendant environ 20 min dans le cryostat.</li>
	</ol></li> <li>Une fois le tissu et le milieu OCT sont complètement figés, déposez une petite quantité de OCT sur une tête de montage et appuyez sur la cryomolds congelés contenant le tissu sur la tête de montage. Permettre l’OPO à geler complètement afin que le moule contenant le tissu est solidement fixé à la tête.</li>
	<li>Fixer la tête d’attache au Mont du sectionnement et serrer la vis. Ajuster l’angle de coupe par rapport à la lame du cryostat avec les leviers de réglage pour s’assurer que les sections sont coupées uniformément.</li>
	<li>Définir l’épaisseur de coupe à 30 µm. Lorsque le bloc de tissu contenant la FrA et l’AcbC de sectionnement, débuter la découpe jusqu’au cortex cérébral est apparent et la collecte de départ puis.</li>
	<li>Le 12 Atlas de cerveau de Rat, la section et le cerveau frais viré sur la base des sections en plaçant doucement les diapositives de membrane de napthalate (stylo) à température ambiante en polyéthylène sur le dessus du tissu sectionné pour la FrA jusqu’au cortex moteur secondaire (les M2 ) est atteint au Bregma 5.16 mm.
	<ol><li>Assurer visuellement l’adhésion à glisser en examinant si les tissus et les PTOM sont complètement fondu sur la glissière. Conserver toutes les diapositives avec des sections de tissu dans le cryostat, jusqu'à coloration.</li>
	</ol></li> <li>Continuer la découpe jusqu'à la commissure antérieure (aca) devient visible et qui unit dans une commissure complet sous les ventricules latéraux maintenant apparents (LV) au Bregma 1,80 mm.</li>
	<li>Sections recueillir jusqu'à la VL semblent se connecter avec l’aca au Bregma 0,84 mm.</li>
	<li>Une fois les profilés pour la FrA et l’AcbC est terminée, retirer le bloc de tissu monté et remplacez par le bloc contenant le HP et SCN.</li>
	<li>L’article jusqu'à ce que l’och est aplati au Bregma-0,480 mm, quand apparaît le troisième ventricule (3V).</li>
	Sections de <li>à frais virés pour le RCS de ce point jusqu’au Bregma-0,720 mm, quand commence la décussation supra-optique (sox). 
	Remarque : Il peut être nécessaire de recueillir plus de coupes de tissus tout au long de l’och comme le RCS est facilement franchi.</li>
	<li>Pour HP collection, section jusqu'à ce que les cornes de la cellule de granule couche gyrus denté (GrDG) sont visiblement apparente au Bregma mm-3,000.</li>
	<li>Collecte des sections jusqu'à ce que l’hippocampe sous-champs de CA sont fondues dans les sections coronales au Bregma-4,780 mm. Ce détail permet une collection complète de l’hippocampe sous le site craniotomie et blessure. 
	NOTE : Comme l’a démontré dans des publications antérieures de ce laboratoire, plus les cellules endommagées sera évident dans cet intervalle et il est approprié pour l’analyse de l’expression génique ou micro-ARN.</li>
</ol> 2. Protocole de coloration <ol><li>préalable à toute coloration, lavage vaisselle et la zone de coloration sous une hotte chimique avec un détergent RNase-élimination. Cette préparation atténue le risque de dégradation de l’ARN en raison de la contamination.</li>
	<li>Préparer tous les réactifs de coloration et des solutions dans nucléase eau gratuit.</li>
	<li>Prendre un rack de diapositives stockées dans le cryostat et la place dans la hotte de laboratoire. Laisser les lames à chaud pendant 30 s. Place eux en coloration solutions (préparées avec de l’eau libre nucléase) comme suit : 75 % EtOH pendant 1 min, nucléase sans eau pour 1 min, 1 % violet de crésyle pendant 1 min, eau gratuite nucléase pendant 30 s, eau gratuite nucléase pendant 30 s , 95 % EtOH pendant 30 s, 100 % EtOH pour 30 s, xylène pendant 3 min et xylène pendant 3 min.</li>
	<li>Autoriser le rack pour sécher à l’air pendant pas plus de 10 min à température ambiante dans la hotte. Vous pouvez également placer des grilles dans un dessiccateur à vide exempte de Rnase pour un séchage plus rapide. Une fois sec, passer immédiatement à LCM.</li>
</ol> 3. Stéréotaxique Atlas guidés Laser capturer Microdissection avec le système de LCM <ol><li>avant de commencer toute procédure de LCM pour analyse de RNA, essuyer la zone de collecte et de la zone autour de l’appareil avec détergent élimination RNase et 100 % EtOH.</li>
	<li>Appuyer sur l’interrupteur de puissance du laser IR unité de production avant de brancher le microscope de base et permettre au système initialiser avant le logiciel est lancé depuis le bureau. 
	Remarque : Si ne pas terminé dans cet ordre, le logiciel ne reconnaîtra pas le microscope.</li>
	<li>Une fois que le logiciel a démarré et courir à travers ses étapes lors de l’initialisation, appuyez sur la &#34; stade &#34; bouton dans le logiciel &#34; panneau de configuration. &#34; la scène modulaire s’installeront dans la position où LCM Macro casquettes et diapositives peuvent être chargés et déchargés.</li>
	<li>Placez les glissières de membrane de stylo dans les supports (jusqu'à trois à la fois) avec le bord givré face vers la droite. 
	Remarque : S’il est placé dans le support dans le mauvais sens, le logiciel peut-être pas en mesure de reconnaître correctement la zone de coupe désirée UV ou IR.</li>
	<li>Cliquez le &#34; Mem &#34; case à cocher dans le &#34; Cap et zone de manutention du glissement &#34; à côté de la diapositive respective (c'est-à-dire A, B ou C). Cette étape indique si la lame est une lame de verre de membrane. Puis cliquez sur la diapositive désirée à capturer tout d’abord.</li>
	<li>Faire la caméra une image en mosaïque pour localisation tissulaire et l’orientation des stages PAC, sélectionnez &#34; Image &#34; sur la barre d’outils et sélectionnez &#34; acquérir aperçu. &#34; 
	Remarque : Si l’utilisateur est familiarisé avec le tissu sont recueilli, cette étape peut être omise à l’aide de la boule de défilement manuel pour positionner la &#34; région Centre &#34; pour la collection.</li>
	<li>Placer le curseur sur la zone sur l’image en mosaïque (ou emplacement relatif sans image en mosaïque), faites un clic droit et sélectionnez &#34; Place Cap en région Centre. &#34; le logiciel placera automatiquement un cap sur la position sélectionnée.</li>
	<li>Sélectionner un emplacement. 
	Remarque : Pour s’assurer que le laser IR est correctement aligné et reprendra les seules régions où les taches sont pondus par le logiciel il doit être placé avant de continuer.
	<ol>
		<li>Déplacer dans un endroit, dans le cadre de la PAC, où aucun tissu n’est présent. Cliquez sur &#34; j’ai &#34; dans le &#34; Microdissect outils volet &#34; et sélectionnez le &#34; IR Locate &#34; onglet. Dans le volet, tirer un tir afin d’évaluer où le laser IR est mise à feu et la taille de la tache d’essai IR.</li>
		<li>Avec le curseur, faites un clic droit au milieu de l’IR spot et sélectionnez &#34; situé IR Spot. &#34; 
		Remarque : Taille et l’intensité du faisceau IR peuvent être changés en modifiant manuellement le &#34; puissance, diamètre ou la durée &#34; sous chaque indicateur de la taille du spot ou en déplaçant l’échelle mobile au bas de la boîte de dialogue. Plusieurs tirs d’essai doive être déclenchés pour assurer la bonne taille de tache. Le laser IR doit être re-trouve chaque fois que la position des changements de cap ou diapositives sont commutées.</li>
		<li>Pour UV coupe, localiser le laser UV en sélectionnant le &#34; UV Locate &#34; onglet dans la boîte de dialogue. 
		NOTE : Parce que le laser UV et le laser IR se déplacent à l’unisson, il est inutile de continuellement re-localiser le laser UV chaque fois que l'on déplace.</li>
	</ol></li> <li>Choisir la &#34; dessin à main levée &#34; option dans le &#34; sélectionnez Outils volet &#34;. À l’aide d’un stylet tactile, tirer sur le périmètre de la région d’intérêt tout en faisant attention à ne pas perdre le contact entre l’écran tactile et la tête de stylet. Veillez à brancher le début et les extrémités ensemble. 
	NOTE : Taches IR seront établies automatiquement par le logiciel, mais l’utilisateur peut choisir d’établir des taches supplémentaires pour s’assurer que le tissu n’est respecté le bouchon après découpe UV a été effectuée.</li>
	<li>Collection des FrA, effectuer une capture de laser brut du tissu cortical jusqu'à quand le cortex M2 apparait Bregma 5.16 mm. 
	Remarque : Ce détail peut être modifié de sorte qu’uniquement des parties spécifiques de la FrA ou les types spécifiques de cellules sont recueillies.</li>
	Collection <li>pour AcbC, capture de laser une zone étroite à proximité de l’aca. 
	Le noyau et l’enveloppe de l’AcbC effectuent différentes fonctions et sont physiologiquement uniques. Ainsi, il est important de suivre l’atlas du cerveau aussi près que possible. Il est recommandé de recueillir auprès de pas plus loin au-delà de bregma 0,84 mm, comme les deux sous-régions deviennent trop étroitement associées à l’autre.</li>
	<li>Collection pour Hp, laser capturer le CA 1, 2 et 3 des sous-champs hippocampe à partir de Bregma 3,00 mm et à l’aide de la GrDG complètement formé comme un point de repère physique pour identification morphologique. 
	NOTE : Aux fins de la présente étude, ne recueillent pas passé Bregma-4,780 mm, ce qui peut être visuellement délimité comme le point lorsque les sous-champs de Hp sont fondues et point sur le ventre. Ce domaine a été choisi comme plus lésés neurones peuvent être découvert directement sous le site de blessure 6.</li>
	<li>Pour la collecte de la SCN, tout d’abord identifier visuellement les noyaux denses qui s’asseoir dorsal à l’och et collectera.</li>
	<li>Après le prélèvement des régions (voir listés ci-dessus), déplacer le LCM Macro casquettes à la &#34; position QC &#34; et inspecter pour l’adhésion complète de tissus en assurant visuellement UV coupe le tissu est attachée à la membrane. Placer rapidement le cap ontoan tube de réaction de paroi mince exempt de RNase 0,5 mL contenant 100 µL de tampon de lyse cellulaire.</li>
	<li>Échantillons de vortex brièvement afin d’assurer la lyse complète et conserver à-80 ° C. À ce stade, LCM peut être suspendu et les échantillons conservés jusqu'à ce qu’utilisé pour l’analyse génomique en aval 6.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour les études moléculaires du cerveau chez les mammifères, LCM est devenu une technique essentielle. Cet article montre qu’en utilisant la combinaison de l’IR et UV lasers de découpe dans le système de LCM peut capturer des changements génomiques dans toutes les régions du cerveau chez les mammifères. Ces régions comprennent ceux identifiables avec des colorants de LCM-compatible conventionnels, comme le violet de crésyle ou l’hématoxyline et éosine. La vitesse du processus de laser-capture et capacité d’exécuter LCM sur plus épais 30 µm sections sur des lames de membrane PEN permet d’obtenir non seulement des quantités suffisantes d’échantillons cellulaires, mais aussi pour isoler l’ARN des échantillons de LCM d’une qualité convenable pour tous les types d’aval analyse génomique ; Ces analyses comprennent des microarrays16, PCR les tableaux17et quantitative PCR en temps réel18.
Nos résultats plaident en faveur des études qui utilisent des tissus de LCM. Nous trouvons que miR-15 b est augmentée dans l’hippocampe et le cortex (Figure 4) mais réprimés dans le noyau accumbens et peut être biologiquement pertinente à la compréhension des effets différentiels des TBI dans le cerveau. Une étude antérieure a suggéré qu’une vulnérabilité neuronale corticale au préjudice des augmentations résultent de la surexpression de plusieurs miARN qui régulent négativement les gènes apoptotiques, tels que Bcl-2,19. Objectif scan analyse montre Bcl-2 est également réglementé par miR-15 b ; par conséquent, nos résultats suggèrent une explication mécaniste car pourquoi des régions spécifiques du cerveau (c'est-à-dire, FCx) peuvent être sélectivement vulnérables aux TBI. Il est important de se rappeler la plupart des gènes sont régies par plusieurs miARN et corrélation des changements dans n’importe quel un miRNA à un gène cible spécifique est difficile. En outre, ces données indiquent que certains changements dans l’expression de gène et de micro-ARN peuvent servir de biomarqueurs de lésions cérébrales spécifiques à la région. En effet, nous utilisons actuellement ces données dans les études des neuroprotecteurs comment les nouveaux composés de médicaments ayant des propriétés antidépressives peuvent affecter différemment d’expression de gène et de micro-ARN dans les régions du cerveau liées à des troubles neuropsychiatriques. Une des limites de notre étude est que, durant les nombreuses étapes des procédés de préparation de glissière pour LCM, intégrité de RNA peut devenir compromise. Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour atténuer le risque de dégradation de l’ARN. Une autre limite est la taille de l’échantillon relativement peu utilisée pour les calculs statistiques. À l’avenir des études, augmentation de la taille de l’échantillon devraient diminuer les effets des variations d’expression du gène et miRNA parmi des animaux.
Le bénéfice de LCM est réalisé dans des études de génomique translationnelles à l’aide de modèles animaux de maladies humaines et les tissus malades20,21,22,23. Sans la capacité de capturer des populations de cellules spécifiques, les profils transcriptionnelles de différentes régions du cerveau serait un mélange inconnaissable et indéchiffrable de nombreux types cellulaires. À l’aide de méthodes de LCM dans les études de lésions cérébrales a conduit aux efforts actuels pour délimiter des biomarqueurs spécifiques de cerveau région et comprendre comment ils correspondent aux biomarqueurs du TBI en circulation.

Le cerveau des mammifères est extrêmement complexe et hétérogène avec des centaines de milliers de cellules types1. En effet, études humaines ont montré que dans des régions comme le cortex frontal, structurels et des différences fonctionnelles en matière de blanche et de gris sont consignées dans profils transcriptionnelle distinctes et divergents2. Hétérogénéité de cerveau a été un obstacle majeur pour interpréter les données d’expression génique et dans le domaine de la lésion cérébrale. Cette ambiguïté dans les études précliniques a par la suite mené à des centaines d’essais cliniques ayant échouées de traitements pour des blessures de cerveau3.
Nous utilisons des méthodes de microdissection (LCM) capture laser pour étudier traumatisme crânien (TCC)-induite par la dérégulation du gène dans le rat brain4, en se concentrant sur l’hippocampe, une région du cerveau qui est essentielle pour l’apprentissage et la mémoire5. La capacité de capture au laser et d’analyser l’expression des gènes en mourant et survivant des neurones nous donne une meilleure compréhension du rôle de stochasticité dans l’expression des gènes en déterminant les résultats (la survie neuronale) après TBI6. Techniques de LCM ont également prouvé utiles pour explorer les effets du TBI sur les neurones de l’hippocampe, lorsqu’on compare des jeunes et vieillissement souris rats ou7 8.
Dans des études récentes, nous avons examiné d’autres régions du cerveau de rat défavorablement touchés par TBI, en mettant l’accent sur les domaines chez le rat et chez des patients humains TBI qui sont associées à la fonction exécutive (c.-à-d. le cortex frontal9) et comorbidités TBI ; Ces comorbidités comprennent la dépression (c.-à-d. noyau accumbens10) et des troubles du rythme circadien (de noyau suprachiasmatique11). Dans des études antérieures, Huusko et Pitkanen12 et Drexel et al. 13 utilisé LCM pour étudier l’expression des gènes dans le thalamus et l’hypothalamus. Notre étude s’inspire de ces observations préalables et comprend quatre autres régions du cerveau. Afin d’étudier les changements moléculaires spécifiques à une région induites après TBI, il fallait acquérir de l’expertise dans l’identification et l’obtention des types de cellules dans ces régions à l’aide d’un système de LCM. Les lasers de découpe-UV et infrarouges (IR) permettant de microdissection précise des régions du cerveau désirée. Ici, nous décrivons comment nous utilisons ce système de LCM, guidé par des coordonnées stéréotaxiques dans le rat brain atlas14, afin d’identifier et de capture des quatre régions du cerveau rat qui sont affectées différemment par la méthode de blessures expérimentales fluide-percussion cerveau au laser 4.

<table><tbody><tr><td>Système de microdissection par capture laser Arcturus</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur Agilent 2100 Agilent</td><td>Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Lames de verre à membrane&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM caps</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acétate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xylène (grade histologique)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof (grade histologique)</td><td>UTMB Pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro-Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Gene Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 96 System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stéréotaxique atlas guidée laser microdissection de saisie des régions cérébrales touchées par lésion traumatique

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

La capacité d’isoler les régions spécifiques du cerveau d’intérêt peut être entravée dans les techniques de dissociation des tissus qui ne conservent pas leur répartition spatiale. Ces techniques d’inclinaison aussi potentiellement analyse d’expression de gène parce que le processus lui-même peut modifier les profils d’expression dans des cellules individuelles. Nous décrivons ici une méthode de microdissection (LCM) de capture de laser pour collecter sélectivement certaines régions du cerveau touchées par traumatisme crânien (TCC) en utilisant une mis à jour le Nissl (violet de crésyle) souillant le protocole et l’orientation d’un atlas de cerveau de rat. LCM donne accès aux régions du cerveau dans leurs positions natives et la possibilité d’utiliser des repères anatomiques pour l’identification de chaque région particulière. À cette fin, LCM a été utilisé précédemment pour examiner l’expression de gènes spécifiques de région de cerveau au TBI. Ce protocole permet l’examen des altérations induites par le TBI dans l’expression de gène et de micro-ARN dans les zones cérébrales distinctes au sein du même animal. Les principes du présent protocole peuvent être modifiés et appliquées à un large éventail d’études qui examinent l’expression du génome aux autres maladie et/ou dans des modèles animaux.

Le schéma présenté dans la Figure 1 illustre le flux de travail global de LCM atlas guidée de certaines régions du cerveau et des applications potentielles de l’analyse en aval. Cette étude s’est concentrée sur quatre régions cérébrales pertinentes à la pathophysiologie TBI et au développement de maladies concomitantes : FrA, AcbC, SCN et Hp. Une limitation présente dans LCM de certaines régions du cerveau, c’est que les sites anatomiques sont souvent obscurcies par l’absence de frontières définies, comme peut être vu dans la Figure 2 (A, D, G, J). L’utilisation d’un atlas du cerveau pour guider le sectionnement et de capture des régions spécifiques au laser réduit la possibilité de contamination des échantillons avec les régions du cerveau que la cible. Quand le soin de suivre les repères de tissus, pendant la découpe et après coloration de Nissl, technologie LCM pouvant constituer un moyen très cohérent d’acquisition des populations distinctes de cellules, des noyaux ou des régions,15. Les objectifs à long terme de ces études sont d’identifier les gènes et les micro-ARN pouvant potentiellement servir de substitut, biomarqueurs non-invasifs de crânien région spécifique. La première étape de ce pipeline de développement de biomarqueurs est la caractérisation des modifications transcriptional tissu-spécifique après expérimentation TBI. Ces données peuvent ensuite être corrélées avec les changements induits par la blessure dans la circulation des liquides.
Les procédures présentées ont été optimisées pour réduire les risques de dégradation de l’ARN afin de permettre l’analyse de RNA par transcription inverse d’ARN total de LCM avant quantitative PCR en temps réel (RT-qPCR). L’ARN total (y compris les petites et les grandes espèces d’ARN) a été isolé en utilisant une méthode basée sur les colonnes d’isolation sur le tissu qui a été capturé au laser de régions cérébrales individuels. Afin d’évaluer l’intégrité RNA, qualité et quantité après les procédures d’isolement, échantillons d’ARN ont été brièvement dénaturés à 70 ° C et s’exécuter sur un analyseur de RNA. Des mesures qualitatives incluent analysant les amplitudes des pics des bandes ARNr 18 s et 28 ()Figure 3), qui peut être représentant de dégradation générale et en utilisant le numéro « RNA intégrité » (RIN). Si vous utilisez des techniques de RNase prudents, RNA isolées de LCM échantillons généralement traduit par RINs allant de 6 à 8. Un RIN inférieur peut impliquer la mauvaise qualité de RNA et peut potentiellement diminuer l’exactitude de l’analyse de l’expression génique et les micro-ARN. À l’inverse, un RIN supérieur peut améliorer la confiance dans la validité des résultats de l’analyse de la RNA.
RT-qPCR a effectué un apprêt/sonde ensembles de gènes individuels et microARN (Figure 4). Environ 1 ng d’ARN total a été inverse-transcrit en ADNc et pré amplifié avant qPCR a été effectuée selon le protocole du fabricant. Les gènes liés à des traumatismes évalués dans cette étude comprenaient BCL2 associé X, régulateur de l’apoptose (Bax), CLL/lymphome de B-cellule 2 (Bcl-2), Caspase 3, Apoptosis-Related Peptidase de cystéine (Casp3) , Brain Derived Neurotrophic Factor (Bdnf) et CAMP Responsive Element Binding Protein 1 (Creb). MiR-15 b a été choisi parce qu’il s’est avéré être modifiés après expérimentation TBI dans de différents neurones mourants. Il également a validé expérimentalement et bioinformatically prédit gènes cibles avec fonctions apoptotiques (données non publiées). Pli-changement normalisée rapports ont été calculés par la méthode ΔΔCt en comparant les niveaux d’expression du gène et de micro-ARN animaux des TBI et contrôles naïf, avec la normalisation d’un gène endogène (Gapdh) ou un petit ARN (U6), respectivement. Un changement de pli supérieur à 1 indique une upregulation globale dans le gène ou micro-ARN, et à l’inverse, un pli changement inférieur à 1 indique une diminution de l’expression. Analyse statistique a montré des changements significatifs dans l’expression des gènes entre contrôle TBI et naïf (p ≤ 0,05) qui dépendaient la région du cerveau. Aucun changement significatif dans l’expression de miR-15 b ont été détectés entre contrôle TBI et naïf, mais il y avait des tendances vers une expression supérieure et inférieure d’une manière dépendante de région de cerveau. Ces données suggèrent que l’optimisation supplémentaire est nécessaire pour évaluer les changements dans l’expression de micro-ARN. Il est également possible de que la taille de l’échantillon était trop petite pour avoir une signification statistique, en partie en raison de la variabilité inhérente à l’expression. Futures études comprendra les animaux opérés pour s’assurer que le gène et modifications de l’expression microARN sont attribuées à TBI et pas en raison de la préparation chirurgicale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg"> 
Figure 1. Workflow de LCM guidée par Atlas pour l’analyse génomique aval. (A-F) Procédures de préparation animaux à qPCR en aval analyse : (A) adulte, male rats Sprague Dawley (~ 6 semaines d’âge et d’un poids de 300 g) sont anesthésiés, soumis à la percussion fluide TBI et humainement euthanasiés 24h après une blessure. (B) des cerveaux congelés frais coupes sériées (30 µm) sont basées sur les coordonnées des régions spécifiques du cerveau (AcbC, Hp, FrA, SCN) de l’atlas du cerveau de Rat Paxinos et de Watson. (C) Sections sont fixes, coloration de Nissl (1 % Violet de crésyle), déshydratés et séchée à l’air. (D). LCM sur identifié des régions du cerveau avec un système de LCM. (E) LCM Macro casquettes transféré sur un tube de 0,5 mL de RNase-libre avec 100 μL de tampon de lyse cellulaire et conservées à-80 ° c jusqu'à l’isolement d’ARN pour l’analyse génomique en aval. RNA peut ensuite être inversée-transcrit pour analyse de RT-qPCR gène ou micro-ARN pour examiner l’expression différentielle des cibles moléculaires après TBI et/ou entre les régions du cerveau d’intérêt (F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg"> 
Figure 2. LCM du TBI touchés des régions du cerveau. Les images représentant des coupes de tissus prélevés du côté ipsilatéral du site de la lésion avec IR et UV laser fonctionne sur le système de LCM (A-I). Tissu a été sectionné sur un cryostat (30 µm) et recueilli sur des lames de membrane de stylo. Sections étaient alors fixe, Nissl teinté avec violet de crésyle (1 %) et déshydraté pour identifier des régions précises du cerveau, basées sur les repères anatomiques référencés dans Paxinos et de Watson The Rat Brain Atlas. (A-C) Une région du cortex frontal association (FrA) (D-F) composants des couches pyramidales CA1, CA2 et CA3 de l’hippocampe (Hp) situé à côté des cornes entièrement formées de la couche de granule du gyrus denté (GrDG). (G-I) Une zone du noyau accumbens coRe (AcbC) proximale et rostrale à la commissure antérieure (aca). (J-K) Noyau suprachiasmatique (SCN) rostral pour le chiasma supra-optique (och). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg"> 
Figure 3. Représentant des Scans de RNA qualité. Représentant électrophérogrammes et gel associé à des images d’ARN dérivé de LCM recueillies tissu (A-D). Électrophérogrammes et associés gel images montrent RNA intact, basé sur l’apparence des bandes de gel et de pics d’ARNr 18 s et 28. Cet ARN est adapté pour toutes les applications en aval, y compris génomiques et analyses protéomiques. (A) (FrA) RNA cortex association des frontaux. RIN 6.1. (B) hippocampe (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) le noyau accumbens core RNA (AcbC). RIN 7.3. (D) , noyau suprachiasmatique RNA. RIN 7,6. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg"> 
La figure 4. Analyse en aval de gènes spécifiques à une région cérébrale et MicroRNA Expression via RT-qPCR. RT-qPCR individuel pour les gènes d’intérêt (Creb, Bdnf, Bax, Casp3, Bcl-2) et les micro-ARN d’intérêt (miR-15 b) ont été effectué sur des régions du cerveau laser capturé après TBI (Hp et AcbC n = 5, FrA n = 4) et par rapport aux animaux naïfs pas blessé (n = 4). Analyse des gènes liés à la pathogénèse TBI a été réalisée pour Hp, AcbC, FCx. les données sont présentées sous forme de rapport de changement de pli normalisée par rapport aux régions du cerveau contrôle naïf (test t non apparié avec Welch Correction ± SEM ; * p ≤ 0,05) (A). Expression différentielle de miR-15 b dans différentes régions du cerveau est offert sous forme de pli normalisée changements par rapport aux témoins naïfs (± SEM) (B). Données de SCN (n = 2) non inclus. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Les auteurs décrivent l’utilisation de laser microdissection de saisie pour prélever des échantillons de populations cellulaires distincts de différentes régions du cerveau pour l’analyse des gènes et des micro-ARN. Cette technique permet l’étude des effets différentiels de traumatisme crânien dans des régions spécifiques du cerveau de rat.

Stéréotaxique Atlas guidée Laser Microdissection de saisie des régions cérébrales touchées par lésion traumatique

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

L'objectif général de ce protocole de microdissection par capture laser est de recueillir des cellules provenant de régions cérébrales spécifiques affectées par un traumatisme crânien afin d'effectuer une analyse moléculaire. Je suis le docteur Helen Hellmich. Mon assistant diplômant, Harris Weisz, qui est étudiant en programme de physiopathologie humaine et de médecine translationnelle à la branche médicale de l'Université du Texas, va démontrer comment nous utilisons les méthodes de microdissection par capture laser dans nos études sur les lésions cérébrales.Cette méthode pourrait aider à élucider les mécanismes et les conséquences des modifications induites par un traumatisme crânien dans des régions cérébrales spécifiques, telles que le cortex frontal, qui contrôle les fonctions exécutives, et l'hippocampe, qui est important pour les processus dépendants de la mémoire. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons étudier l'effet d'un processus pathologique sur plusieurs régions cérébrales distinctes ou sur des types cellulaires individuels provenant d'un même cerveau.Avant toute procédure de microdissection laser impliquant une analyse transcriptionnelle, nettoyez toutes les surfaces avec le détergent RNace pour éliminer tout risque de contamination et de dégradation de l'ARN. Récupérez le tissu cérébral du stockage et placez-le dans un cryostat refroidi à moins 20 degrés Celsius.Laisser le cerveau s'équilibrer à la température de la chambre du cryostat pendant environ dix minutes. Placer le cerveau, côté ventral vers le haut, sur une feuille de gaze située sur la platine du cryostat. À l'aide d'un rasoir à ARN propre, sectionner la partie postérieure juste au rostral du cervelet et la partie située juste au rostral du chiasma optique.Déposer une petite quantité de milieu optimal pour la congélation dans deux moules cryogéniques distincts. Placer le cerveau contenant le cortex frontal d'association et le noyau accumbens dans l'un des moules cryogéniques, côté intérieur vers le bas. Ajouter suffisamment de milieu OCT pour recouvrir le tissu.Répétez cette étape avec le fragment de tissu cérébral contenant l'hippocampe et le noyau suprachiasmatique. Laissez complètement geler le milieu OCT pendant environ 20 minutes dans le cryostat. Une fois que le tissu et le milieu OCT sont complètement gelés, pressez une petite quantité d'OTC sur une tête de montage.Appuyez un moule cryogénique congelé sur la tête de montage et laissez l’OCT geler complètement afin que le moule contenant le tissu soit solidement fixé à la tête. Fixez l’accessoire de tête sur le support de coupe et serrez la vis. Réglez l’angle de coupe par rapport à la lame du cryostat à l’aide des leviers de réglage pour garantir que les sections soient coupées de manière uniforme.Régler l'épaisseur des sections à 30 microns. Lors de la coupe du bloc de tissu contenant l'hippocampe et les SEN, continuer la section jusqu'à ce que le chiasma optique soit aplati au niveau du bregma à 0,48 millimètre, lorsque le troisième ventricule devient apparent. Ensuite, récupérer les sections pour le MEB à partir de ce point en plaçant délicatement des lames recouvertes de membrane de naphtalate de polyéthylène à température ambiante sur la surface du tissu sectionné.Vérifiez visuellement l'adhérence à la lame en vous assurant que le tissu et l'OTC sont complètement fondus sur la lame. Conservez toutes les lames avec les sections de tissu dans le cryostat jusqu'au moment de la coloration. Arrêtez la collecte des sections au niveau du bregma à 0,72 millimètre, lorsque commence la décussation supratoptique.Pour la collecte de l'hippocampe, sectionner jusqu'à ce que les cornes de la couche granulaire du gyrus denté soient visibles au niveau du bregma à 3,00 millimètres. Prélever les sections jusqu'à ce que les sous-champs CA de l'hippocampe soient fusionnés dans les sections coronales au niveau du bregma à 4,78 millimètres. Cela permet une collecte complète de l'hippocampe sous le site de craniotomie et de lésion.Avant la coloration, laver tout le matériel et la zone de coloration dans une hotte chimique avec un détergent éliminant les RNases. Prendre le porte-lames du cryostat et le placer dans la hotte. Laisser les lames se réchauffer pendant 30 secondes.Colorer les sections avec du violet de crésyle et les dégorger avec du sérum physiologique. Laisser sécher à l'air la boîte de lames colorées pendant pas plus de dix minutes à température ambiante dans la hotte. Une fois sèches, passer immédiatement à la microdissection laser (LCM).Avant de commencer toute procédure de microdissection laser destinée à l'analyse d'ARN, nettoyez soigneusement la zone de collecte et l'espace autour de l'appareil à l'aide d'un détergent éliminant les ARNases et d'éthanol à 100 %. Activez l'interrupteur d'alimentation de l'unité générant le laser infrarouge avant d'allumer la base du microscope, puis laissez le système s'initialiser avant de démarrer le logiciel depuis le bureau. Une fois le logiciel chargé et ses étapes d'initialisation terminées, ouvrez le panneau de configuration du logiciel et appuyez sur le bouton de positionnement de la platine.La platine modulaire va se déplacer à la position permettant le chargement et le déchargement des capsules macro LCM et des lames. Placez jusqu'à trois lames à membrane en stylo dans les supports, le bord mat orienté vers la droite. Sélectionnez la zone de manipulation des capsules et des lames adjacente à la lame respective, puis cliquez sur la case à cocher MEM pour indiquer au logiciel que des lames en verre à membrane ont été chargées.Cliquez ensuite sur la diapositive souhaitée à capturer en premier. Pour capturer une image en mosaïque afin de localiser et d'orienter le tissu pour le positionnement des capuchons, sélectionnez l'option image dans la barre d'outils et choisissez acquérir un aperçu. Placez le curseur sur la zone de l'image en mosaïque, cliquez avec le bouton droit et sélectionnez placer le capuchon au centre de la région.Le logiciel placera automatiquement un bouchon sur la position sélectionnée. Après avoir localisé les lasers infrarouge et ultraviolet, choisissez l'option de dessin à main levée dans le panneau des outils de sélection. À l'aide d'un stylet tactile, dessinez autour du périmètre de la région d'intérêt en veillant à ne pas perdre le contact entre l'écran tactile et la pointe du stylet.Veillez à relier les points de départ et d'arrivée. Pour la collecte de l'hippocampe, utilisez la capture laser pour isoler les sous-régions hippocampiques CA1, CA2 et CA3 en partant de la bregma à 3,00 millimètres, en utilisant la couche granulaire complètement formée du gyrus dentelé comme repère physique pour l'identification morphologique. Après la collecte, déplacez les capsules macro LCM vers la position de contrôle qualité (QC) et vérifiez l'adhérence complète du tissu en vous assurant visuellement que le tissu découpé par ultraviolets est bien fixé à la membrane.Il est impératif que le laser UV découpe entièrement tout autour du tissu. En cas d'omission, l'adhérence du tissu sur le capot de MAC sera incomplète. Ensuite, placez rapidement chaque capot dans un tube à réaction de 0,5 millilitre sans RNase et à paroi mince contenant 100 microlitres de tampon de lyse cellulaire.Vortexez brièvement les échantillons pour assurer une lyse complète et stockez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu'au moment de réaliser l'analyse génomique en aval. Voici des images représentatives de coupes tissulaires prélevées du côté épilésional du site de lésion, à l'aide des fonctions laser infrarouge et ultraviolette du système de microdissection par capture laser (LCM). Il s'agit d'une région du cortex frontal associatif.Cette image montre la même région après la collecte. Et voici le tissu sur le capuchon après la collecte. Cette image montre les composants des couches parameatales CA1, CA2 et CA3 de l'hippocampe situées à côté des cornes complètement formées de la couche granulaire du gyrus dentelé.Les régions CA2 et CA3 ont été collectées et ces populations cellulaires sont visibles sur le capuchon. Ici, une zone du noyau accumbens, située en position proximale et rostrale par rapport à la commissure antérieure, a été ciblée et fidèlement reproduite sur le capuchon. Enfin, le noyau suprachiasmatique, situé en position rostrale par rapport au chiasma supraoptique, a été capturé par microdissection laser après un traumatisme crânien.Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour traiter un cerveau en environ huit heures. Cela inclut le traitement des tissus, la coloration et la microdissection laser. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme l'analyse épigénétique, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions concernant les profils de méthylation ou l'expression des microARN.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment effectuer la microdissection laser sur plusieurs régions cérébrales d'un même cerveau.

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Stéréotaxique Atlas guidée Laser Microdissection de saisie des régions cérébrales touchées par lésion traumatique

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