Mesurer les variations In Vivo des neurotransmetteurs extracellulaires pendant naturellement récompenser les comportements chez les femelles Hamsters syriens

L’objectif global de cette procédure expérimentale est de mesurer la libération de neurotransmetteurs chez les animaux éveillés. Bien que cette vidéo démontre l’application aux neurosciences comportementales, avec la capacité de caractériser la libération de neurotransmetteurs spécifiques, en relation avec des événements comportementaux spécifiques, cette technique peut être utilisée dans une variété d’autres sous-disciplines des sciences neurologiques, telles que l’injection de drogues. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer la libération de neurotransmetteurs en temps quasi réel in vivo.

Commencez par injecter 500 microgrammes de progestérone dans 0,1 millilitre d’huile de coton, par voie sous-cutanée, quatre heures avant l’introduction de l’homme pour induire la réceptivité sexuelle. Assurez-vous de tester chaque animal au début de la phase d’obscurité de son cycle quotidien, car les comportements sociaux des rongeurs sont sujets à des modifications dans des conditions de test à la lumière blanche et à la lumière rouge. Préparez les solutions d’étalonnage fraîches le jour du test dans des tubes à centrifuger en verre de 20 millilitres.

Pour la solution d’analyte, dissolvez 7,4 milligrammes d’acide L-glutamique dans 10 millilitres d’eau ultra pure en inversant doucement le tube. Ensuite, faites la solution d’interférence en dissolvant 176,1 milligrammes d’AA dans 10 millilitres d’eau ultra pure. Configurez l’étalonnage en plaçant un agitateur magnétique sur la base d’un support d’anneau de laboratoire de base.

Placez un bécher chemisé de 20 millilitres sur le dessus de l’agitateur magnétique et fixez-le à l’aide d’une pince moyenne à deux griffes. Connectez le bécher chemisé à un bain-marie en circulation pour chauffer la solution tampon à 37 degrés Celsius. Ajoutez une barre d’agitation magnétique et 20 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de 100 millimolaires, ou PBS, dans le bécher chemisé.

Ensuite, placez le support d’étalonnage du capteur sur le dessus du bécher chemisé et placez un préamplificateur d’étalonnage à quatre canaux sur le dessus, en le fixant en place à l’aide d’une pince à angle droit. Ensuite, connectez le préamplificateur à un appareil de conditionnement et d’acquisition de données pour enregistrer les données d’étalonnage. Testez la sensibilité de chaque biocapteur enzymatique au glutamate avant l’enregistrement expérimental en plaçant la sonde dans le support d’étalonnage, au sommet d’un bécher gainé, en immergeant la cavité de détection et une partie du fil de référence en chlorure d’argent dans la solution tampon.

Lancez un nouvel enregistrement sur l’interface de l’ordinateur à l’aide d’un logiciel d’acquisition téléchargeable gratuitement. Ensuite, connectez chaque capteur testé à un port d’un préamplificateur d’étalonnage à quatre canaux. Laissez les capteurs atteindre une ligne de base stable.

Commencez à ajouter les injections d’analyte lorsque les capteurs ont atteint une ligne de base stable. Utilisez le trou dans le support d’étalonnage pour introduire une pointe de pipette dans la solution tampon. Ensuite, utilisez l’outil d’annotation rapide des touches du logiciel d’enregistrement pour annoter lorsqu’une injection est effectuée.

Ensuite, faites 10 injections micromolaires de glutamate en pipetant 40 microlitres de la solution d’analyte dans la solution tampon. Attendez que le capteur se stabilise entre les ajouts. Ensuite, ajoutez trois injections de solution d’analyte avant d’ajouter une seule injection de la solution interférente d’AA.

Tapissez la chambre d’essai avec de la litière prélevée dans la cage de l’animal. Retirez l’obdurateur occlusif de la canule de guidage et insérez l’électrode en fibre de carbone ou la sonde enzymatique à travers l’arbre de guidage. Connectez le capteur au système d’enregistrement.

Stabilisez ensuite la connexion du capteur en vissant une goupille sur le support de tête. Ensuite, placez l’animal dans la chambre d’essai. Commencez l’enregistrement de la vidéo et du signal ampérométrique verrouillé dans le temps dans le logiciel.

Laissez le capteur s’équilibrer dans le cerveau avant les tests expérimentaux. Ensuite, introduisez un stimulus mâle dans la chambre d’essai. Après le premier montage avec insertion pénienne par le stimulus mâle, continuez l’enregistrement pendant 10 à 30 minutes supplémentaires, selon les objectifs expérimentaux.

Enfin, après un test comportemental, débranchez le capteur femelle. Retirez les deux hamsters de la chambre d’essai, ainsi que la litière, pour nettoyer la chambre avec de l’éthanol à 70 %. Commencez par visionner et annoter les vidéos, à l’aide d’un logiciel gratuit téléchargeable dans le commerce, au ralenti pour coder précisément les comportements verrouillés dans le temps du signal ampérométrique.

Commencer la lordose dans le cadre lorsque la femelle initie une dorsiflexion de son dos et dévie sa queue vers le haut. Annotez la fin de la lordose lorsque la femelle met fin à cette posture, ce qui se produit souvent lorsque la femelle se réadapte à un autre endroit de la chambre d’essai. Ensuite, annotez Start AI lorsque la femelle est en posture de lordose et que le mâle déplace son museau vers la région anogénitale de la femelle, où des reniflements, des léchages ou des caresses de sa région périnéale peuvent se produire.

Mettre fin à l’IA lorsque le mâle retire son museau de la région anogénitale de la femelle. Ensuite, annotez Start Mount lorsque le mâle s’approche et place ses pattes avant sur la femelle dans une posture de montage, quelle que soit l’orientation de la tentative de monture. De même, annotez Démarrer l’intromission lorsqu’une poussée réussie permet au pénis masculin monté d’accéder au vagin de la femelle.

Le cas échéant, annotez l’éjaculation, qui peut être noté par un mouvement de pas avec la patte arrière du mâle. Enfin, annotez l’intromission finale et la montée finale simultanément dans le cadre lorsque le mâle a retiré ses deux pattes avant et n’a donc aucun contact avec la femelle. En raison de l’incapacité fréquente de visualiser son retrait, codez simultanément ces deux comportements pour permettre la cohérence et la fiabilité tout au long des épisodes d’accouplement.

Sous l’onglet Fichier, sélectionnez la fonction Exporter et choisissez l’onglet TSV pour enregistrer les mesures de tension en tant que fichier d’extension TSV. Ouvrez chaque fichier à l’aide d’un tableur et enregistrez-le au format XLS/XLSX. Enfin, ajoutez manuellement des annotations pour le début de la lordose de préaccouplement en même temps que le comportement de lordose commence qui inclut également un comportement de monture, et également au début d’un nouvel accès d’accouplement si la femelle reste dans la posture de lordose.

Pendant les épisodes d’accouplement, la fugacité dopaminergique dans les titulaires du noyau se produit lors de l’insertion vaginale, ou entracte, par le mâle. Un schéma similaire a été observé chez d’autres animaux en ce qui concerne la libération de glutamate. Avec des éphémères rapides qui correspondent à des interruptions individuelles dans le noyau dorsal du noyau accumbens lors d’un épisode copulatoire.

Une fois maîtrisée, cette technique, à l’exclusion des chirurgies stérotactiques préparatoires, peut être réalisée en une journée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de s’assurer que chaque capteur est fonctionnel. Bien que cette vidéo montre l’enregistrement d’une seule sonde, cette approche peut être étendue à l’enregistrement simultané en double.

Mais cela ajoute une couche de complexité qui n’est pas négligeable. Cette vidéo est présentée dans des conditions de luminosité pour une visibilité facile. Cependant, nous réalisons nos expériences comportementales dans des conditions sombres, et ce paramètre peut être modifié en fonction de besoins expérimentaux spécifiques.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’analyse histologique ultérieure des tranches de cerveau, peuvent être effectuées afin d’identifier et de confirmer l’emplacement exact du capteur. De plus, une analyse plus approfondie des données, à l’aide des données comportementales codées, peut être effectuée en ce qui concerne les paramètres d’intérêt. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer la libération de neurotransmetteurs, y compris les neurotransmetteurs non électro-actifs comme le glutamate en temps quasi réel chez les animaux éveillés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de calibrer les sondes glutamatergiques, d’implanter des sondes, d’exécuter une expérience comportementale mesurant les changements dans la libération de neurotransmetteurs à différents composants du comportement et de coder ces données pour une analyse ultérieure. N’oubliez pas que lorsque vous travaillez avec des animaux vivants, soyez sensible à leur confort et à leur bien-être général pour garantir vos meilleurs résultats et ceux des animaux.