Name: Analyse de végétaux de promoteur : Identification et caractérisation de racine Nodule promoteur spécifique chez le haricot commun (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Apprenez l'induction de racines chevelues chez Phaseolus vulgaris pour étudier l'expression des promoteurs nodulaires spécifiques. Cette méthode améliore la compréhension de la régulation génique chez les légumineuses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été partiellement soutenu par la Dirección General de Asuntos del Personal Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (subvention no. IN219916 Maes et IA205117 à M.-K. A) et le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (subvention CONACYT no 240614 à M.L.).

1. identification, isolement et le clonage de P. Vulgaris NIN promoteur
<ol>
	<li>Identifier la séquence du promoteur du gène d’intérêt. Il y a plusieurs bases de données de génome et outils d’analyse disponibles pour les plantes telles que Phytozome, plantes Ensembl, NCBI, etc. A légumineuse promoteur P. vulgaris NIN (PvNIN ; Phvul.009G115800) a été utilisé dans cette étude20.</li>
	<li>Oligos de conception pour porte d’entrée ou des enzymes de restriction traditionnelle clonage selon le système de vecteur utilisé (Figure 1 a). NOTE : Standard (bp 25-35), des amorces de morue dessalée fonctionnent bien. Séquences d’oligo inverse qui flanquent entre le promoteur et le gène sont conseillés.</li>
	<li>Amplifier la région promotrice de PvNIN (ou de la région promotrice du gène d’intérêt) de fraîchement isolées P. vulgaris en utilisant l’ensemble des oligo promoteur spécifique de l’ADN génomique. Utilisez une polymérase de haute fidélité avec les conditions suivantes de la PCR : 95 ° C pendant 5 min ; 30 cycles (95 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 1 min) ; et 72 ° C pendant 5 min.</li>
	<li>Exécutez le fragment amplifié sur gel d’agarose à 1 % à 60 V sur une plaque de gel de 7 x 10 cm et éluer les amplicons correspondants (700 bp, Figure 1 b) et clone dans le vecteur pENTR/D-TOPO selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Transformer 2 µL de la réaction en compétentes d' Escherichia coli cellules utilisant les instructions du fabricant et la plaque 150 µL du mélange transformation sur frère lysogénie (LB) additionné de kanamycine 50 mg/L (Kan50). Cultiver les cellules plaqués à 37 ° C pendant la nuit.</li>
	<li>Prélever 3-6 colonies et culture que durant la nuit dans le milieu LB contenant Kan50. Isoler l’ADN à l’aide de la méthode de choix de plasmide et d’analyser le plasmide par PCR en utilisant le vecteur spécifique M13 oligos. Pour l’ACP, utilisation 100 ng de plasmide, 12:03 des oligos, 10 X tampon PCR 0,5 U Taq DNA polymérase et 10 mM dNTPs.</li>
	<li>Utiliser les conditions suivantes de l’amplification PCR ; 95 ° C pendant 3 min ; 30 cycles (95 ° C pendant 30 s, 58 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 75 s) ; et 72 ° C pendant 7 min. visualiser les produits PCR sur un gel d’agarose à 1 %. S’assurer que les insertions correctes ont une bande à 1 024 bp et vecteurs sans volonté d’insertions ont une bande de bp 324 (Figure 1).</li>
	<li>Effectuer la réaction de LR entre le vecteur d’entrée (pENTR/D-TOPO-PvNIN) et destination des vecteurs pBGWFS7.021 en utilisant un mélange commercial enzyme selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Transformer 2 µL de réaction LR en compétent e. coli cellules utilisant des techniques standard tel que décrit dans les instructions du fabricant et la plaque 150 µL du mélange de transformation sur LB additionné de 100 mg/L de spectinomycine (Spe100). Cultiver les cellules plaqués à 37 ° C pendant la nuit.</li>
	<li>Prélever environ 5 colonies et leur culture du jour au lendemain dans un milieu LB contenant Spe100. Isoler l’ADN à l’aide d’une méthode de choix de plasmide et d’analyser le plasmide de PCR avec les oligos promoteur spécifique.</li>
	<li>Utiliser les conditions de la PCR dans l’étape 1.3. Visualiser les produits PCR sur un gel d’agarose à 1 % pour confirmer l’amplification. Amplicons sont 700 bp.</li>
	<li>Le plasmide positive pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (Figure 1) de la séquence avec les oligos promoteur spécifique de vérifier l’authenticité de l’insert.</li>
	<li>Transformer les plasmides en souche a. rhizogenes K599 (Toutefois, les autres souches d’a. rhizogenes peuvent être utilisés). Ajouter 2 µL de la préparation de plasmide dans 50 µL de cellules electrocompetent et electroporate dans une cuvette de 1 mm avec les paramètres suivants : 1.8 kV, 25 µF et 200 Ω.</li>
	<li>Récupérer des cellules en ~ 500 µL de milieu SOC et agiter à 28 ° C pendant 2 h. plaque sur LB-Spe100 et pousse à 28 ° C pendant 2 jours.</li>
	<li>Effectuer le criblage de colonie comme indiqué dans l’étape 1.7 et utiliser les conditions de la PCR comme dans l’étape 1.3. Faire des stocks de glycérol de clones positifs et les stocker à-80 ° C.</li>
	<li>Utiliser a. rhizogenes culture nourrissait vecteur vide pBGWFS7.0 comme contrôle négatif.</li>
</ol>
2. A. Rhizogenes transformé des racines velues de l’haricot
<ol>
	<li>Stériliser les graines de haricot (P. vulgaris CV Jamapa Negro) (environ 20) dans 50 mL d’éthanol à 96 % pendant 1 min et jeter l’éthanol ; Ajouter ensuite 50 mL d’eau de Javel (hypochlorite de sodium) de la 20 % pendant 10 min, avec un mélange constant dans une hotte à flux laminaire. Enlever l’eau de Javel et laver à l’eau stérile excès 3 fois. Remarque : Les autres cultivars P. vulgaris peuvent être utilisés pour l’induction de racines chevelues.</li>
	<li>Faire germer les graines stérilisées sur papier-filtre stérile imbibé de Broughton &#38; Dilworth (B &#38; D) solution22 (tableau 1) pendant 2 jours dans l’obscurité à 28 ° C.</li>
	<li>La veille de la transformation de préparer ce qui suit :
	<ol>
		<li>-Ensemencer sur 150 µL de la culture a. rhizogenes , hébergeant le vecteur binaire (préparé en étapes 1.13 et 1.14) sur solide LB Spe100 et poussent à 28 ° C durant la nuit.</li>
		<li>Remplir un tube de 15 mL avec B &#38; solution D et remplacer le bouchon à vis avec double couche d’aluminium. Cela s’assemble en un tube de verre de 22 cm contenant 10 mL de B &#38; D solution (Figure 2) et autoclave il.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Le jour de la transformation, assembler les matériaux stériles suivants dans une hotte à flux laminaire : germer les graines de l’étape 2.2, plaque de culture d’étape 2.3.1, tubes de l’étape 2.3.2, eau bidistillée stérile (10 mL), pipettes et pointes de pipette, une pince stérile, et les seringues de 3 mL.</li>
	<li>Utiliser un embout de 200 µL courbé à racler les cellules a. rhizogenes de la plaque dans un tube de microcentrifuge et remettre en suspension dans 1 mL de l’eau stérile double. De même, préparer les hématies vecteur séparément.
	<ol>
		<li>Mélanger les cellules doucement pour remettre en suspension. Ne pas vortexer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Faire un trou de 3 mm sur la feuille d’aluminium de l’étape 2.3.2 en utilisant un embout de la pipette stérile des tubes.</li>
	<li>Recueillir les cellules (promoteur ou vector control) de l’étape 2.5 avec la seringue et piquer légèrement l’hypocotyle des graines germées avec la pointe de l’aiguille (Figure 2). Remarque : Veillez à ce que l’aiguille pénètre (4 à 6 fois) les tissus vasculaires et injecter petit (~ 5 µL) supprime des cellules sur la plaie à des endroits différents autour de l’hypocotyle.</li>
	<li>Insérer délicatement les racines des semis injectés dans le trou de 3 mm du tube 15 mL contenant B &#38; solution D. Retourner l’installation entière dans le mL 22 tubes en verre et joint pour conserver l’humidité.</li>
	<li>Incuber les tubes dans une chambre de croissance maintenue à 28 ° C avec 16 h lumière : 8 h photopériode sombre. Notes : 3-4 jours après l’incubation, les plantes grandissent sur le bord des tubes de verre de 22 mL.</li></ol>A ce stade, retirer les capuchons et sceller la jante avec parafilm autour de la tige, comme illustré dans la Figure 2I.
	<li>Observer les cals sur les sites blessantes à 5-7 jours et trouver ~ racines velues 2 cm par 10 à 12 jours après transformation. Remarque : Il est important de maintenir le B &#38; solution D constamment dans des tubes de plastique et de verre.</li>
	<li>Après 2 semaines, retirer la racine primaire en coupant la tige à 2 cm en dessous des racines velues et transplanter les racines primaires dans des pots contenant de la vermiculite stérile. Maintenir les plantes dans une chambre de croissance (16 h lumière : 8 h obscurité à 28 ° C) et irriguer avec B &#38; solution D.</li>

3. promoteur analyse : NIN promoteur Expression dans les Nodules rhizobiennes du haricot commun
<ol>
	<li>Pour l’induction de nodosités racinaires, inoculer Rhizobium tropici ou Rhizobium etli (qui sont compatibles avec le haricot commun) dans 100 mL de milieu PY (peptone de 0,5 g, 0,3 g d’extrait de levure) additionné de 700 mM CaCl2 et 20 mg mL−1 acide nalidixique. Incuber à 30 ° C pendant 24 h avec agitation à 300 tr/min. Remarque : Des antibiotiques spécifiques pourraient être utilisés dans le cas de transgéniques Rhizobium.</li>
	<li>Les cellules dans une centrifugeuse pendant 3 min à 2 800 x g à la température ambiante de granule et resuspendre dans 10 mL de 10 mM MgSO4. Ajuster le diamètre extérieur de cellules à 0,6 à OD600 par dilution avec du 10 mM MgSO4.</li>
	<li>Inoculer 1-2 mL de la culture (préparée à l’étape 3.2) par plant (promoteur tant vector control) pour induire la croissance des nodules sur les racines velues. Arroser les plantes avec B &#38; solution D azote limité (2 mM KNO3) pour promouvoir la nodulation.</li>
	<li>Selon les besoins expérimentaux, recueillir les racines velues à différents moments. Collecte d’échantillons pour l’étude des cordons d’infection entre 3-5 jours après l’inoculation (dpi). Remarque : Nodule primordiale et jeunes nodules peuvent être étudiés à 6-9 et 10-12 jours PPP, respectivement. Enfin, les nodules matures et fonctionnels peuvent être étudiées au dpi de 14-21 et des nodules de sénescence à &#62; 28 dpi.</li>
	<li>Traiter les nodules racinaires / l’activité des gènes rapporteurs (GUS ou GFP). Analyser l’activité GUS selon le protocole décrit par Jefferson23. Observez GFP sous le microscope de fluorescence. Exciter la fluorescence GFP avec un laser à argon bleu ion (488 nm) et recueillir la fluorescence émise de 510 à 540 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+promoters+and+cis-actingregulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements.</a> Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).</li>
<li>Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+Thirst+for+Genome+Sequencing%2C+Data+Interpretation%2C+and+Database+Usage+in+Genomic+Era%3A+The+Road+towards+Fast-Track+Crop+Plant+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+Research+International%22%5BJournal%5D)">Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement.</a> Genetics Research International. , 684321(2015).</li>
<li>Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplast+isolation%2C+transient+transformation+of+leaf+mesophyll+protoplasts+and+improved+Agrobacterium-mediated+leaf+disc+infiltration+of+Phaseolus+vulgaris%3A+Tools+for+rapid+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis.</a> BMC Biotechnol. 16 (1), 53(2016).</li>
<li>Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+localization+of+a+symbiosis-specific+phosphate+transporter+is+mediated+by+a+transient+reorientation+of+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).</li>
<li>Kryvoruchko, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MtSWEET11%2C+a+Nodule-Specific+Sucrose+Transporter+of+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).</li>
<li>Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+cortical+cell+division+during+root+nodule+development+in+Lotus+japonicus+is+accompanied+by+auxin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response.</a> Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).</li>
<li>Suzaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoreduplication-mediated+initiation+of+symbiotic+organ+development+in+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus.</a> Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).</li>
<li>Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-affinity+phosphate+transporter+GmPT5+regulates+phosphate+transport+to+nodules+and+nodulation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean.</a> Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).</li>
<li>Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Functional+Analysis+of+a+Novel+Group+of+Legume-specific+WRKY+and+Exo70+Protein+Variants+from+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean.</a> Sci Rep. 6, 32090(2016).</li>
<li>Montiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene+is+required+for+root+infection+by+Rhizobia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia.</a> Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).</li>
<li>Arthikala, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PvRbohB+negatively+regulates+Rhizophagus+irregularis+colonization+in+Phaseolus+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris.</a> Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).</li>
<li>Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RbohB+a+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene%2C+enhances+symbiosome+number%2C+bacteroid+size%2C+and+nitrogen+fixation+in+nodules+and+impairs+mycorrhizal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization.</a> New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).</li>
<li>Barraza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+PvTRE1+enhances+nodule+biomass+and+bacteroid+number+in+the+common+bean%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean.</a> New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).</li>
<li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autophagy-related+kinase+is+essential+for+the+symbiotic+relationship+between+Phaseolus+vulgaris+and+both+rhizobia+and+arbuscular+mycorrhizal+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi.</a> Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).</li>
<li>Nanjareddy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Legume+TOR+Protein+Kinase+Regulates+Rhizobium+Symbiosis+and+Is+Essential+for+Infection+and+Nodule+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development.</a> Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).</li>
<li>Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter+of+the+Vicia+faba+L.+gene+VfEnod12+encoding+an+early+nodulin+is+active+in+cortical+cells+and+nodule+primordia+of+transgenic+hairy+roots+of+Vicia+hirsuta+as+well+as+in+the+prefixing+zone+II+of+mature+transgenic+V.+hirsuta+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules.</a> Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).</li>
<li>Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+Sesbania+rostrata+leghemoglobin+glb3+gene+5%27-upstream+region+in+transgenic+Lotus+corniculatus+and+Nicotiana+tabacum+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants.</a> Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).</li>
<li>Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+network+governing+nodule+organogenesis+and+infection+in+the+model+legume+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus.</a> Nat Commun. 12, 1-10 (2010).</li>
<li>Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaseolus+vulgaris+RbohB+functions+in+lateral+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development.</a> Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).</li>
<li>Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+expressed+genes+in+mycorrhized+and+nodulated+roots+of+common+bean+are+associated+with+defense%2C+cell+wall+architecture%2C+N+metabolism%2C+and+P+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182328(2017).</li>
<li>Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li>
<li>Broughton, W. J., Dilworth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+leghemoglobin+synthesis+in+snake+beans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Control of leghemoglobin synthesis in snake beans.</a> Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).</li>
<li>Jefferson, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1178271/">Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system.</a> Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).</li>
<li>Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+induction+of+soybean+hairy+roots+and+propagation+of+the+soybean+cyst+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode.</a> Planta. 210 (2), 195-204 (2000).</li>
<li>Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Composite+Plants+in+Medicago+truncatula+used+for+Nodulation+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2633(2011).</li>
<li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+expression+of+hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+roots+and+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules.</a> Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).</li>
<li>Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.bio-protocol.org/e795">Hairy Root Transformation in Lotus japonicus.</a> Bio-protocol. 3 (12), e795(2013).</li>
<li>Jacobs, T. B., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+CRISPR+Vector+Construction+and+Characterization+of+DNA+Modifications+by+Generation+of+Tomato+Hairy+Roots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots.</a> J. Vis. Exp. (110), e53843(2016).</li>
<li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-transformation+of+the+Phaseolus+spp.%3A+a+tool+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics.</a> Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Au cours de l’analyse fonctionnelle des gènes, l’étude des modèles d’expression de gène joue un rôle crucial dans la compréhension de la régulation spatiale et temporelle de la gènes in vivo. Une méthode bien connue pour étudier les profils d’expression génique consiste à cloner la région promoteur du gène d’intérêt, en amont des gènes rapporteurs comme gènes de marqueur fluorescent (GFP, DP, etc.) ou de β-glucuronidase. Ici, nous avons sélectionné une région promotrice racine nodule symbiose (RNS) spéc...

Les promoteurs sont des outils biologiques moléculaires importants qui jouent un rôle crucial dans la compréhension de la régulation de l’expression des gènes d’intérêt. Les promoteurs sont des séquences d’ADN situées en amont de la traduction les séquences de codon d’initiation de gène et ils portent les mentions réglementaires centrales de gènes ; donc, leur annotation correcte et la caractérisation sont essentiels pour comprendre la fonction des gènes. Selon les profils d’expression, promoteurs de la plante sont classés comme constitutive, tissu-spécifique, ou spécifique au développement-stade et inductible1. Avancées dans les technologies de transcriptomique, amélioration de la modélisation informatique et la disponibilité d’un nombre croissant de séquences de génomes de différentes espèces de plantes ont facilité la prédiction à grande échelle de séquences promoteur2.
En revanche, il est également essentiel d’établir des outils d’évaluation de promoteur et de techniques de transformation génétique qui sont rapides, efficaces et reproductibles. À la différence des autres plantes de modèle, la caractérisation fonctionnelle des gènes de légumineuse (P. vulgaris) haricot commun est entravée principalement en raison du caractère récalcitrant de Phaseolus SP pour transformation génétique stable. Systèmes de transformation passagère servent d’alternative pour le gène rapide caractérisation fonctionnelle des études3. Dans la recherche de légumineuse de symbiose, l’interaction entre la plante-hôte légumineuse et bactérie rhizobienne est un des systèmes plus tractable modèle pour l’analyse fonctionnelle des gènes spécifiques des nodules et des études de promoteur. Jusqu'à présent, plusieurs promoteurs de légumineuse liés à ces symbioses ont été caractérisés, c'est-à-dire, Medicago truncatula PT44, SWEET115, Lotus japonicus Cyclope, UBQ6, VAG17, Glycine max PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, etc.. CIS éléments influencent directement la régulation génique. Le facteur de transcription ENBP1A se lie à une région régulatrice du Cis (−692 bp) d’early noduline VfENOD12, et cela facilite l’expression d’un gène rapporteur dans les primordiums de nodules de Vicia faba16. Remplacement des régions régulatrices de Cis (−161 à −48 bp) du promoteur nodule spécifique leghémoglobine GLB3 avec l’hétérologue tronqué promoteurs δ-p35S et δ-pNOS, a entraîné une perte de spécificité de nodule et réduit l’activité du promoteur17 .
Les rapports précédents montrent que le facteur de transcription NIN est requis pour l’initiation de l’infection rhizobienne dans les cellules des poils absorbants et est aussi essentielle à l’organogénèse nodulaire dans L. japonicus18. Dans la présente étude, les auteurs décrivent un protocole d’identification, isolement, clonage et caractérisation du nodule spécifique promoteur dans les racines velues de haricot commun. Pour y parvenir, nous avons sélectionné un promoteur de NIN spécifiques symbiose rhizobiens de P. vulgaris et cloné dans une fusion transcriptionnelle au journaliste chimérique GUS-enhanced::GFP. De plus, ce protocole décrit un système rapid et versatile de transformation génétique chez le P. vulgaris à l’aide de a. rhizogenes induit racines velues. Ce système génère des racines velues en moins de 2 semaines après transformation. Enfin, nous avons évalué l’expression spatio-temporelle du promoteur NIN en nodules racinaires rhizobiums colonisés par GUS coloration.
La procédure décrite ici peut être utile pour l’étude de la nodulation et la mycorhization11 des plantes légumineuses, mais aussi pour l’étude des modèles d’expression de promoteur en racines19. De plus, ce protocole est facile à utiliser dans les laboratoires non spécialisés.

<table><tbody><tr><td>Amorces pour le test qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN Forward</td><td>CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN Reverse</td><td>CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 Forward</td><td>GTA AAA CGA CGG CCA G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 Reverse</td><td>CAG GAA ACA GCT ATG AC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Kit de clonage</td><td>Invitrogen</td><td>K243520</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzyme Mix&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>11791100</td><td></td></tr><tr><td>pBGWFS7.0&nbsp ;</td><td>Biologie des systèmes végétaux</td><td>https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/</td><td></td></tr> <tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10966018</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction</td> Kit <td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Pfx DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>Biologie moléculaire certifiée Agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>1613102</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chimiquement compétent E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-250G</td><td></td></tr><tr><td>Gérace bactériologique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de spectinomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1441</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Peptone bactériologique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td> <td>de calciumSigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Acide nalidixique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate</td><td>de magnésium Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Solution de chargement de gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7654</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Veriti Thermocycleur</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Sigma</td><td>Sigma 1-14K</td><td></td></tr><tr><td>Unité de documentation en gel</td><td>Carestream</td><td>Gel Logic 212</td> PRO <td></td></tr><tr><td>MaxQ SHKE6000 6000 Incubateur à secousses - 115VAC</td><td>Thermo scientific</td><td>EW-51708-70</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de croissance végétale</td><td>MRC</td><td>PGI-550RH</td><td></td></tr><tr><td>Horizantal laminarair flow cabinate</td><td>Lumistell</td><td>LH-120</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Leica</td><td>DM4500 B</td><td></td></tr><tr><td>Petridish</td><td>sym laboratorios</td><td>90X15</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blade</td><td>Fisher scientific</td><td>53223</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL Centrifugeuse conique Tubes</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en verre de 22 mL</td><td>Thomas scientific</td><td>45048-16150</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de végétaux de promoteur : identification et caractérisation de racine nodule promoteur spécifique chez le haricot commun

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

Les séquences en amont du gène séquences codantes sont désignées comme des séquences promotrices. Étudier les profils d’expression des promoteurs sont très importantes dans la compréhension de la régulation des gènes et des profils d’expression spatio-temporelle des gènes cibles. En revanche, il est également essentiel d’établir des outils d’évaluation de promoteur et de techniques de transformation génétique qui sont rapides, efficaces et reproductibles. Dans cette étude, nous avons étudié le modèle d’expression spatio-temporelle du promoteur création (NIN) rhizobiennes symbiose spécifique nodules de Phaseolus vulgaris dans les racines velues transgéniques. À l’aide de bases de données du génome de plante et les outils d’analyse nous avons identifié, isolé et cloné le promoteur de NIN P. vulgaris dans une fusion transcriptionnelle au journaliste chimérique β-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. De plus, ce protocole décrit un système rapid et versatile de transformation génétique chez le P. vulgaris à l’aide d' Agrobacterium rhizogenes induit racines velues. Ce système génère des racines velues de ≥ 2 cm 10 à 12 jours après la transformation. Ensuite, nous avons évalué l’expression spatio-temporelle du promoteur NIN en racines velues Rhizobium inoculés à des intervalles périodiques après l’inoculation. Nos résultats dépeints par activité GUS montrent que le promoteur de NIN était actif au cours du processus de nodulation. Ensemble, le présent Protocole montre comment identifier, isoler, cloner et caractériser un promoteur de la plante dans les racines velues de haricot commun. De plus, ce protocole est facile à utiliser dans les laboratoires non spécialisés.

L’objectif de cette étude était d’évaluer le modèle d’expression spatio-temporelle des nodules spécifiques P. vulgaris NIN. Pour ce faire, une région bp 700 en amont du codon d’initiation traduction du gène NIN est sélectionné et un ensemble d’oligos a été conçu comme l’illustre la Figure 1 a. En utilisant une polymérase de haute fidélité, le fragment de promoteur NIN a été amplifié, isolé (Figure 1 b) et cloné ...

Analyses d’expression promoteur sont essentielles pour améliorer la compréhension de la régulation des gènes et de l’expression spatio-temporelle des gènes cibles. Ici, nous présentons un protocole visant à identifier, isoler et cloner un promoteur de la plante. En outre, les auteurs décrivent la caractérisation du nodule spécifique promoteur dans les racines velues de haricot commun.

Analyse de végétaux de promoteur : Identification et caractérisation de racine Nodule promoteur spécifique chez le haricot commun

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Les racines pelées sont utilisées pour obtenir des racines transformées chez Phaseolus à l'aide d'une construction rapporteuse. Les racines transgéniques obtenues servent à examiner l'expression du gène rapporteur. Les études d'expression des promoteurs sont essentielles pour comprendre les profils d'expression spatiotemporels des gènes.Aujourd'hui, nous allons démontrer les méthodologies permettant l'induction de racines pelées et l'étude des profils d'expression des promoteurs dans des racines pelées transgéniques, dans des conditions de symbiose de nodulation racinaire chez Phaseolus. Estrada-Navarrete et ses collègues ont précédemment mis au point un système de racines pelées induites par Agrobacterium rhizogenes chez Phaseolus. La méthode actuelle permettra d'accélérer la durée d'induction des racines pelées, améliorant ainsi la polyvalence du système.Les procédures seront démontrées par mon collègue Manoj-Kumar Arthikala et les étudiantes de licence Alma Leticia et Brenda Mariana de mon laboratoire. Commencez par rechercher la séquence du gène NIN dans la base de données du génome de Phaseolus vulgaris sur Phytozome, puis sélectionnez la longueur de séquence requise en amont

plant-promoter-analysis-identification-characterization-root-nodule

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous démontrons comment les plantes racines chevelues composite peut être utilisé pour étudier les interactions plante-Rhizobium et la nodulation dans les difficiles à transformer les...

Génération de plantes dans les composites Medicago truncatula Utilisées pour les dosages nodulation

Le système inductible de racines latérales (LRIS) permet l’induction synchrone des racines latérales et est présenté pour Arabidopsis thaliana et le maïs.

Lateral système inductible Racine dans<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Et de maïs

Nous avons développé un protocole simple et efficace pour la préparation de grandes quantités de protoplastes de soja afin d’étudier les mécanismes réglementaires et signalisation complexes dans des cellules vivantes.

Une méthode Simple pour l’isolement de protoplastes de soja et Application aux Analyses d’Expression génétique transitoire

L’objectif du protocole présenté ici est d’étudier la réponse de transcriptomique des isolés endosphère Bacillus mycoides aux exsudats racinaires de pommes de terre. Cette méthode facilite l’identification des gènes bactériens importants impliqués dans les interactions plantes-microorganismes et est en principe applicable aux autres endophytes et plantes, avec des ajustements mineurs.

Interactions plantes-microorganismes : Réponse transcriptionnelle de Bacillus Mycoides d’exsudats racinaires de pommes de terre

Visualisation et en mesurant la croissance racinaire in situ sont extrêmement difficile. Nous présentons une méthode de rhizobox personnalisable pour suivre le développement racinaire et prolifération au fil du temps en réponse à l’enrichissement en éléments nutritifs. Cette méthode est utilisée pour analyser les différences génotypiques maïs dans la plasticité de la racine en réponse à une source d’azote organique.

Un protocole de Rhizobox optimisé pour visualiser la croissance racinaire et la réceptivité aux nutriments localisées

Nous présentons ici deux protocoles pour transformer les plantes de pomme de terre. La transformation par Agrobacterium tumefaciens mène à une plante transgénique complète tandis que l' Agrobacterium rhizogenes produit transgéniques racines velues lors d’un shooting de type sauvage pouvant être autonome propagés. Ensuite, nous détectons activité du promoteur par GUS coloration dans les racines transformées.

Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation des pommes de terre et de l’activité du promoteur d’un gène de subérine par GUS Staining

La traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) offre la possibilité de disséquer les programmes de développement avec un traitement minimal des organes et des tissus. Le protocole donne de l’ARN de haute qualité à partir de cellules ciblées avec un sous-unité ribosomal étiquetée protéine fluorescente verte (GFP). Les outils d’analyse en aval, tels que qRT-PCR ou ARN-seq, révèlent des profils d’expression spécifiques aux tissus et aux cellules.

Traduire la purification de l’affinité ribosome (TRAP) pour étudier le développement de la racine d’Arabidopsis thaliana à une échelle spécifique au type cellulaire

Nous présentons ici un protocole pour la production à haute efficacité de racines velues de soja transgéniques.

Transformation racinaire poilue du soja pour l’analyse de la fonction génique

Ici, nous fournissons le protocole détaillé d’une méthode de transformation en une étape médiée par Agrobacterium tumefaciens pour produire des plantes composites.

Procédé efficace et reproductible de production de plantes composites par transformation racinaire velue basée sur Agrobacterium rhizogenes

Utiliser glycosidases spécifiques pour éliminer les sucres de glycoprotéines suivi par SDS-PAGE est une méthode utile pour détecter des modifications glycane sur des échantillons de protéines et est un bon choix pour des études glycobiologie initiale. Les changements suivants déglycosylation peuvent être détectés comme des changements dans la mobilité de gel ou par coloration avec glycane réactifs sensibles.

Identification et caractérisation des glycosylation des protéines spécifiques en utilisant des endo-et exoglycosidases

Apprenez l'induction de racines chevelues chez Phaseolus vulgaris pour étudier l'expression des promoteurs nodulaires spécifiques. Cette méthode améliore la compréhension de la régulation génique chez les légumineuses.

Analyse de végétaux de promoteur : Identification et caractérisation de racine Nodule promoteur spécifique chez le haricot commun (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse de végétaux de promoteur : Identification et caractérisation de racine Nodule promoteur spécifique chez le haricot commun

Explorer plus de vidéos