Analyse de végétaux de promoteur : Identification et caractérisation de racine Nodule promoteur spécifique chez le haricot commun

Les racines poilues sont utilisées pour obtenir des racines transformées chez Phaseolus avec une construction rapporteure. Les racines transgéniques résultantes sont utilisées pour examiner l’expression du gène rapporteur. Les études d’expression des promoteurs sont cruciales pour comprendre les modèles d’expression spatio-temporelle des gènes.

Aujourd’hui, nous allons démontrer les méthodologies d’induction des racines poilues et étudier les modèles d’expression des promoteurs dans les racines poilues transgéniques dans des conditions symbiotiques de nodules racinaires chez Phaseolus. Estrada-Navarrete et ses collègues ont déjà établi le système racinaire poilu induit par Agrobacterium rhizogenes chez Phaseolus. La méthode actuelle permettra d’accélérer la durée de l’induction des racines poilues et d’améliorer ainsi la polyvalence du système.

Mon collègue Manoj-Kumar Arthikala et les étudiantes de premier cycle Alma Leticia et Brenda Mariana de mon laboratoire feront la démonstration des procédures. Pour commencer, recherchez la séquence du gène NIN dans la base de données du génome de Phaseolus vulgaris à partir de Phytozome, et sélectionnez la longueur de séquence requise en amont de l’ATG. Concevoir les oligonucléotides en suivant l’analyse de séquence du promoteur appropriée.

L’ADN génomique de Phaseolus fraîchement préparé servira de matrice pour amplifier la séquence promotrice par PCR. Préparez le mélange maître de PCR avec de la Taq polymérase haute fidélité et des composants de PCR standard, ainsi que les oligonucléotides préalablement conçus. Aliquote le mélange maître dans des tubes PCR de 2 mL, et effectuez l’amplification du fragment promoteur dans un thermocycleur et avec un programme approprié.

Séparez le produit de PCR par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1,2 %. Visualisez le fragment NIN amplifié à 700 paires de bases sous transillumination UV. Excisez, éluez et clonez le fragment dans le vecteur d’entrée Gateway pENTR/D-TOPO en suivant les instructions standard.

Transformez deux microlitres du mélange réactionnel en cellules E. coli compétentes à 42 degrés Celsius pendant 50 secondes, et mettez l’E. coli transformé sur LB complété par 50 milligrammes par litre de kanamycine. Cultivez les cellules plaquées à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Effectuer une réaction PCR pour des plasmides isolés à partir de colonies d’E. coli sélectionnées au hasard à l’aide d’oligonucléotides M13.

Le fragment à 1024 paires de bases doit indiquer des clones positifs. Effectuez la réaction LR entre le clone d’entrée positive et le vecteur binaire de destination. Transformez deux microlitres de mélange réactionnel en E.coli et sélectionnez les colonies sur 100 milligrammes par litre de spectinomycine à 37 degrés Celsius.

Amplifiez les plasmides avec des oligonucléotides spécifiques du NIN. Le clone positif devrait amplifier à 700 paires de bases. Séquencez et vérifiez l’exactitude du fragment de clone.

Mobiliser la construction du promoteur NIN dans des cellules électrocompétentes K599 Agrobacterium rhizogenes. Et encore une fois, confirmez le clone avec des oligonucléotides spécifiques du promoteur. Le soufre stérilise les graines de Phaseolus vulgaris et les fait germer sur des papiers filtres stériles et humides pendant deux jours dans l’obscurité à 28 degrés Celsius.

Étalez 150 microlitres de cellules d’Agrobacterium rhizogenes avec la construction NIN et le vecteur de contrôle sur des plaques LB avec sélection de spectinomycine. Cultivez la culture pendant la nuit à 28 degrés Celsius. Épépinez les plantules de Phaseolus et grattez les cellules d’Agrobacterium rhizogenes avec une pointe pliée de 200 microlitres de la plaque.

Et remettre en suspension dans un tube Eppendorf avec un ml d’eau distillée stérile. Prélever les cellules d’Agrobacterium rhizogenes dans une seringue de trois mL et placer les plantules de Phaseolus dans un tube préalablement préparé. Piquez légèrement les hypocotyles des graines germées avec la pointe de l’aiguille, en injectant simultanément les cellules d’Agrobacterium rhizogenes.

Il faut veiller à ce que l’aiguille ne passe pas à travers l’hypocotyle. Maintenez les semis injectés dans une chambre de croissance à 28 degrés Celsius avec une photopériode de 16 heures de lumière et huit heures de photopériode sombre. Les callosités sur les hypocotyles blessés devraient être visibles au bout de cinq à sept jours.

Après deux semaines, retirez la racine primaire en coupant la tige à deux centimètres sous les racines poilues, et transplantez-les dans des pots contenant de la vermiculite stérile. Simultanément, inoculer les plantes avec un ml de Rhizobium tropici pour induire la nodulation. Assurez-vous de diluer la culture de Rhizobium à 6 à OD 600.

Maintenez les plantes dans une chambre de croissance à 28 degrés Celsius, 16 heures de photopériode à la lumière et huit heures à l’obscurité, et irriguez avec une solution B et D. Pour étudier les modèles d’expression spatio-temporelle du promoteur NIN, l’échantillonnage est effectué à différents points temporels. Retirez les plantes sans endommager les racines et lavez les racines sans aucune tache de vermiculite.

Sélectionnez au hasard les racines des plantes NIN et témoins, et procédez à la coloration histochimique GUS en incubant les échantillons dans le tampon de dosage GUS à 37 degrés Celsius pendant 16 heures dans l’obscurité. Observez les racines colorées par GUS au microscope stéréoscopique et composé. Cette image montre l’expression du promoteur NIN induite par Rhizobium dans les racines primaires.

L’expression du promoteur NIN a également pu être observée dans les cellules ciliées racinaires infectées par Rhizobium. De plus, l’expression GUS peut être documentée à différents stades du développement du nodule racinaire. Aucune expression GUS n’a été observée dans les racines de lutte antivectorielle.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la conception de vos constructions promotrices et de l’étude des modèles d’expression promotrice dans les racines poilues transgéniques de Phaseolus. Ce système pourrait être étendu pour étudier les modèles d’expression des promoteurs sous d’autres interactions symbiotiques et pathogènes chez Phaseolus et également chez d’autres eudicotylédones.