Reconstruction tridimensionnelle de l’Architecture vasculaire de l’ovaire de souris de clarté affranchis Passive

L’objectif global de ce protocole est de fournir une vue tridimensionnelle complète de la distribution capillaire dans les follicules ovariens de souris et de montrer leurs relations. L’ovaire est un organe essentiel en reproduction et en endocrinologie. Comptez chaque stade de développement du follicule et des cellules somatiques.

De plus, contrairement à d’autres organes, l’ovaire ne présente pas la ramification répétée de l’unité fonctionnelle. Le système vasculaire local peut être avec le système nerveux sont également capables de subir des changements majeurs dans chaque cycle menstruel chez les femmes adultes. L’application de la clarté passive dans l’ovaire nous permet de voir la distribution globale et la connexion entre ces cellules et follicules dans l’ovaire.

La clé principale de cette mesure est qu’elle a le moins d’effet sur l’ovaire et qu’elle tient compte de l’élimination de divers marqueurs. Grâce à la reconstruction de l’image microscopique, nous avons fourni une carte de l’ovaire. Certains détails des vaisseaux, des neurones et des follicules peuvent être observés clairement.

Pour l’analyse d’images, certaines options d’Imaris ont été utilisées pour évaluer les relations entre l’ovaire et les structures. Préparez les solutions de profusion selon les instructions de l’article et conservez-les sur de la glace. Anesthésie les souris et assure-toi qu’elles n’ont pas de réponse de pincement des orteils.

Vaporisez de l’éthanol, faites une incision sur l’oreillette droite, puis profuser instantanément le ventricule gauche avec 20 ml de PBS glacé à la vitesse de 10 ml par minute pour évacuer le sang. Ensuite, abondez l’animal avec une solution d’hydrogel froide à la même vitesse. Prélever les ovaires ainsi que l’utérus pour maintenir l’intégrité de la morphologie ovarienne.

Transférez les ovaires séparés dans la solution froide d’hydrogel. Au microscope stéréoscopique, on enlève les tissus adipeux autour de l’ovaire. Pour un meilleur résultat de fixation tissulaire, nous recommandons l’ablation de la bourse ovarienne.

Conservez les ovaires dans une solution d’hydrogel pendant trois jours. Après trois jours, transférez les ovaires dans un tube en verre et remplissez le tube avec une solution d’hydrogel fraîche. Étirez le parafilm sur le dessus du tube, puis enroulez un autre parafilm autour du col du tube.

Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles entre le parafilm et la solution d’hydrogel. Placez le tube de verre sur un incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux heures jusqu’à ce que le gel se forme. Retirez soigneusement l’excès de gel autour des ovaires à l’aide d’un filtre en papier.

Mettez les ovaires dans un tube de 15 ml et remplissez le tube avec 10 ml de solution éclaircissante. Placez le tube sur un incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins deux mois. Changez la solution de clarification tous les jours pendant les trois premiers jours, puis chaque semaine jusqu’à ce que l’ovaire soit clairsemé.

Toutes les procédures d’immunomarquage sont effectuées à 37 degrés centigrades sur un agitateur. Tout d’abord, lavez l’ovaire avec du PBST pendant 24 heures. Deuxième incubation de l’ovaire en anticorps primaire dilué par PBST pendant deux jours.

Troisièmement, lavez les anticorps primaires avec le tampon PBST. Quatrièmement, incubez l’ovaire avec l’anticorps secondaire souhaité dans PBST pendant deux jours. Cinquièmement, lavez les anticorps secondaires avec PBST.

Sixièmement, transférer l’ovaire dans une solution d’appariement de l’indice de réfraction pour l’homogénéisation de l’IR. Vérifiez la transparence visuelle, lorsque l’ovaire a été complètement clarifié, il peut être imagé. Tout d’abord, préparez un plat à fond de verre propre.

Fabriquez un cylindre de mastic et façonnez-le en forme de fer à cheval. Appuyez fermement le bord extérieur sur la lame de verre pour créer un espace scellé. La hauteur du mastic doit être un peu plus élevée que celle de l’ovaire.

Déplacez l’ovaire avec précaution vers le centre et ajoutez la solution de montage. Poussez un plat sur le mastic et utilisez deux morceaux de mastic pour le fixer. Lorsque l’ovaire est prêt à être photographié, un microscope confocal Nikon avec objectif 16X peut être sélectionné pour l’imager.

Pour l’imagerie avec un microscope confocal, choisissez d’abord l’objectif de la dalle Ni-E. Dans l’acquisition du panneau, sélectionnez le nombre de canaux. Tout d’abord, utilisez l’onglet Eye Port et le joystick du contrôleur XY pour déplacer le tissu vers le centre du champ grâce à la vérification par des oculaires de microscope.

Deuxièmement, après avoir éteint la lumière de l’obturateur, cliquez sur l’onglet en direct pour régler la puissance laser, HV et le décalage pour chaque canal. Dans le panneau Correction de l’intensité Z, ajustez l’acquisition pour la couche supérieure, cliquez sur le bouton plus pour définir la couche supérieure, déplacez l’objectif vers le bas et réglez la puissance HV et laser appropriée au bas du tissu et ajoutez les informations de la couche la plus basse, cliquez sur Vers ND pour synchroniser le réglage avec le panneau et l’acquisition. Et lors de l’acquisition, définissez d’abord le nombre d’étapes de numérisation.

Cliquez sur les onglets Z et grande image. Deuxièmement, allez dans la fenêtre de numérisation de la grande image pour définir la taille du champ en fonction de la bordure du tissu. Troisièmement, revenez à l’acquisition ND pour saisir la taille des champs de balayage et choisissez le chevauchement entre 10 et 50 %, puis cliquez sur exécuter la correction Z et attendez le processus d’imagerie.

Utilisez d’abord imagic pour ouvrir le fichier NIS d’origine. Cliquez sur le bouton image, choisissez les canaux de couleur et d’affichage, puis cliquez sur fichier, choisissez les séquences d’images et enregistrez-les séparément en tant que fichiers tiff. Deuxièmement, utilisez Imaris pour ouvrir l’un des fichiers tiff.

Cliquez sur le bouton Modifier et choisissez Ajouter des chaînes pour ajouter le reste. Le nom et la couleur peuvent être modifiés lors du réglage de l’affichage. L’épaisseur du tissu doit également être corrigée dans les propriétés de l’image.

Troisièmement, cliquez sur le bouton Modifier et choisissez Recadrer 3D pour couper la partie supplémentaire. Tout d’abord, cliquez sur le bouton du filament et cliquez sur suivant. Allez dans le panneau de tranches, trouvez un vaisseau de traçage et la distance, puis revenez au Surpass, entrez l’électricité statique et cliquez sur suivant.

Deuxièmement, ajustez le seuil de départ et le seuil de consigne. Dans le panneau de l’appareil photo, choisissez la sélection, appuyez sur Maj et cliquez sur le point pour supprimer la partie supplémentaire. Troisièmement, choisissez le seuil le plus élevé et cliquez sur Suivant.

Ne sélectionnez pas détecte des points et passez au suivant. Certaines parties en excès peuvent être supprimées dans le panneau d’édition. La couleur peut être modifiée en cliquant dessus.

L’architecture 3D du système vasculaire ovarien a été étudiée à la suite de l’immunomarquage CD31. La structure 3D peut être observée soit par tranches à travers d’autres tranches, soit dans son intégralité par le rendu volumique. Le CD 31 est la coloration du système vasculaire folliculaire de souris adulte.

Grâce à la reconstruction des capillaires par les filaments, nous avons pu montrer la relation entre les follicules individuels et leurs capillaires. L’ovaire, comme une femme, est toujours actif et interchangeable. Cependant, en raison des limites de l’analyse histologique traditionnelle, il est très difficile de décrire les relations entre des constituants aussi complexes.

La méthode nouvellement développée, la clarté passive, peut nous aider à surmonter l’obstacle optique, à maintenir l’intégrité de l’ensemble des tissus et à fournir des indices fonctionnels.