Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire

L’objectif général de cette expérience est de décrire comment les bactériophages sont synthétisés à partir de leur génome à l’aide d’un système de traduction de transcription sans cellules E. coli. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie synthétique, telles que l’élucidation des mécanismes d’auto-assemblage moléculaire dans les systèmes vivants. Le principal avantage de cette technique est la polyvalence de la plateforme.

De nombreux systèmes biologiques peuvent être entièrement récapitulés et affinés pour une analyse expérimentale. Commencez cette procédure par la préparation des plaques de phages comme décrit dans le protocole textuel. Utilisez l’extrémité d’une pipette Pasteur stérile pour prélever et retirer une seule plaque.

Soufflez la plaque dans les cellules diluées. Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Pour tester l’infection complète, prélevez un échantillon de 500 microlitres dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez 10 microlitres de chloroforme.

Agitez immédiatement le mélange à grande vitesse et observez si la solution se clarifie, ce qui indique une infection par les phages. Une fois que les cellules sont complètement infectées, incubez pendant encore deux heures. Ensuite, ajoutez de la DNase avant de centrifuger les cellules à 8 000 fois g et quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant, puis remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de chlorure de magnésium 1X Tris. Ajoutez 500 microlitres de chloroforme et vortex à grande vitesse pour lyser les cellules. Clarifier par centrifugation à 12 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, décampez le surnageant dans un tube conique de 15 millilitres et stockez-le à quatre degrés Celsius. Préparez quatre gradients de cinq à 45 % de saccharose en pipetant 2,5 millilitres de saccharose à 45 % dans quatre tubes d’ultracentrifugation. Recouvrez la couche d’environ 2,6 millilitres de saccharose à 5 %, en vous arrêtant lorsque le liquide atteint deux millimètres du bord du tube.

Mélangez les dégradés par rotation du tube d’inclinaison à l’aide d’un instrument de formation de gradient pendant 43 secondes à 86 degrés et 23 tr/min. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, ajoutez 500 microlitres de suspension de phage en mettant la pointe en contact avec la surface du liquide et en distribuant très lentement le volume sur le dessus du gradient de saccharose, en prenant soin de ne pas mélanger par pipetage rapide. Centrifuger à 70 000 fois g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Plongez une canule émoussée dans la solution jusqu’à ce que l’extrémité soit centrée sur le bord supérieur de la bande phage. Retirez l’anneau en tirant sur le piston de la seringue jusqu’à ce que la majorité de l’anneau lysologique ait été retirée. Ajoutez ensuite le volume de saccharose avec le phage en suspension dans trois ou quatre tubes d’ultracentrifugation.

Remplissez les tubes à trois et quatre millimètres du haut du tube avec du 1XTM froid. Recouvrez les tubes d’un film de paraffine et retournez-les pour mélanger. Remettez les tubes dans une ultracentrifugeuse et dépensez-les à 145 000 fois g pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Versez rapidement le surnageant et égouttez-le à l’envers sur des lingettes jetables. Répartissez 200 à 400 microlitres de 1XTM froid sur tous les granulés et remettez-les en suspension pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Aucune secousse n’est requise.

La veille de la fabrication des titres, préparez une culture de cellules hôtes d’E. coli dans 10 millilitres de milieu de croissance LB et laissez la culture dans un incubateur à agitation réglé à 250 RPM et 37 degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, préparez un mélange maître en pipetant 5,25 millilitres de gélose supérieure, 220 microlitres d’échantillons de phages dilués et 50 microlitres de cellules bactériennes hôtes dans un tube de culture de 14 millilitres. Boucher le tube de culture et vortex à grande vitesse.

Récupérez deux plaques de culture de l’incubateur à 37 degrés Celsius. Ajoutez ensuite lentement 2,5 millilitres de mélange maître au centre de la première assiette. Tournez doucement la plaque à la main pour répartir uniformément le mélange principal de manière à ce qu’il s’étende sur toute la plaque de culture.

Attendez 20 minutes pour assurer la solidification de la gélose supérieure. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant quatre à sept heures. Comptez les plaques et déterminez la concentration de phages pour chaque échantillon de réaction.

Diluez une partie du stock de phages à 400 microlitres avec un tampon 1XTM dans un tube frais de 1,5 millilitre. Ajouter un volume égal de Tris phénol chloroforme à la dilution. Agitez doucement le mélange sur une bascule de laboratoire ou à la main pendant cinq minutes.

Ensuite, centrifugez l’émulsion résultante à 17 000 fois g dans une centrifugeuse de paillasse pendant cinq à 10 minutes. Retirer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube en prenant soin de ne pas perturber la limite interphasique. Répétez ces étapes deux fois de plus pour un total de trois extractions au phénol.

Transférez la phase aqueuse dans un tube frais et ajoutez un volume égal de chloroforme. Agitez et centrifugez avant de transférer l’échantillon d’ADN aqueux dans un tube propre. Ensuite, ajoutez 0,4 volume d’acétate de sodium à trois molaires et trois volumes d’éthanol à 95 %.

Placez le tube dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pour les précipitations de la nuit. Centrifuger à 17 000 fois g dans une centrifugeuse de paillasse pendant 10 à 15 minutes. Retirez et jetez le surnageant, soit par décantation, soit par pipetage.

Ajoutez ensuite 500 microlitres d’éthanol à 70 % et secouez doucement le tube jusqu’à ce que le granulé se détache du fond du tube. Après la centrifugation, retirez et jetez l’éthanol en prenant soin de ne pas déranger le granulé. Après avoir ajouté de l’éthanol et centrifugé comme précédemment, retirez et jetez l’éthanol une deuxième fois, en prenant soin de ne pas déranger le granulé.

Faites sécher la pastille à l’air libre sur la paillasse pendant 30 à 60 minutes. Une fois sec, ajoutez 50 microlitres d’eau doublement distillée à la pastille et incubez pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius pour la remettre en suspension. Déterminez la concentration d’ADN à l’aide de mesures d’absorption à 280 nanomètres.

Pour effectuer la réaction acellulaire, aliquote le volume indiqué d’extrait brut, soit 33 % du volume final de la réaction, dans un tube de microcentrifugation. Préparez le mixage principal comme indiqué dans le protocole de texte. Ajouter le volume approprié de chaque composant à l’extrait brut.

Après avoir ajouté le dernier composant, homogénéisez la réaction par vortex. Divisez ensuite le mélange principal en n tubes de microcentrifugation. Ensuite, ajoutez les volumes indiqués des composants variables au tableau de mixage principal.

Ajoutez de l’eau à chaque réaction pour atteindre le volume de réaction final souhaité avant de tourbillonner. Ensuite, incubez les tubes de microcentrifugation à 29 degrés Celsius pendant au moins huit heures ou toute la nuit. Après avoir préparé les cellules pour le titre de phage comme décrit dans le protocole de texte, titrez la solution finale de réaction acellulaire LB comme démontré précédemment dans cette vidéo.

Voici les résultats représentatifs d’une réaction acellulaire synthétisant le phage phi X 174. Cette plaque de phage montre une réaction de phage réussie qui a été titrée à une dilution appropriée, évidente par le nombre dénombrable de plaques. Cependant, une réaction réussie peut mal se manifester si le facteur de dilution est trop faible pour le rendement en phages de la réaction.

Cette plaque montre un nombre incalculable de plaques. On voit ici une plaque avec une distribution inhomogène des plaques de phages en raison d’un pré-équilibrage insuffisant de la température de la plaque de culture. Pendant le titre de phage, la plaque de culture a solidifié la réaction dans la partie inférieure droite de la plaque.

Les conditions d’encombrement moléculaire ont un effet important sur la synthèse des phages pour phi X 174 et, T7.In particulier, le rendement en phages pour T7 diminue de trois ordres de grandeur lorsque les concentrations de PEG passent de 4 à 2 % en poids par volume. Une fois maîtrisée, la purification des phages et l’extraction de l’ADN peuvent se faire en deux jours si elles sont effectuées correctement. La réaction acellulaire ne prend que quelques heures lorsqu’il n’y a aucun problème.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver des phages, d’extraire et de purifier leur ADN, et d’utiliser le résultat pour reconstituer un phage entièrement infectieux à l’aide du système de réaction acellulaire. Travailler avec du phénol peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles qu’une blouse de laboratoire, une protection oculaire et des gants doivent être portées lors de cette procédure. Tous les travaux avec des récipients ouverts de phénol doivent être effectués dans une hotte.