Name: Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Découvrez la synthèse de bactériophages infectieux à partir de leur génome en utilisant un système acellulaire de transcription-traduction E. coli. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes d'auto-assemblage moléculaire en biologie synthétique.

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Ce matériel est basé sur le travail pris en charge par l’Office of Naval Research award nombre de N00014-13-1-0074 (V.N.), le Human Frontier Science Program grant nombre RGP0037/2015 (à V.N.), et la Science Binational Foundation accorde 2014400 (à V.N.).

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</ol>

Les auteurs déclarent les intérêts financiers concurrents suivants : Noireaux laboratoire reçoit des fonds de recherche du MYcroarray, un distributeur de la trousse d’expression de protéine acellulaire MYtxtl.

Selon la technique de Chen, et al. 14 pour SPMC, une étape essentielle est atteinte lorsqu’il détermine les conditions appropriées pour la surinfection. Le paramètre qui contrôle plus étroitement les capacité de souche hôte de résister à une surinfection est fréquemment la concentration initiale du phage infectant. Les cellules de l’hôte doivent être en phase de croissance logarithmique avant l’infection initiale avec une très petite quantité du phage. Finalement, le phage atteindra égale...

Ces dix dernières années, la technologie d’expression acellulaire a été conçue pour les nouvelles applications en biologie liés à synthétique et quantitative de recherche multidisciplinaire emergent zones d’adresse. Initialement utilisé pour exprimer les protéines indépendants d’un organisme vivant, TXTL acellulaire-nouveaux systèmes ont été développés pour les deux sciences fondamentales et appliquées1,2, d’élargir considérablement la portée de cette technologie. La nouvelle génération de plates-formes TXTL a été conçue pour être facile à utiliser, plus efficace (atteignant 2 mg/mL de la synthèse protéique en batch mode3), plus polyvalent au niveau de la transcription4et modulaire afin d’intègrent facilement le roman naturel ou fonctions synthétiques qui étendent les fonctionnalités existantes des systèmes biologiques5,6. En particulier, systèmes TXTL acellulaires sont devenus très pratiques pour le prototypage rapide de programmes génétiques, tels que des éléments de régulation ou de petits circuits génétiques7,8,9, en réduisant la conception-construction-test cycle de quelques jours. Remarquablement, les nouveaux systèmes TXTL sont également capables de traiter de grands programmes de l’ADN telles que la synthèse complète de coliphages10,11, démontrant fort assez spectacles pour soutenir la reconstitution de l’actif de génomique ADN codée des entités vivantes.
TXTL systèmes présentent de nombreux avantages techniques par rapport aux traditionnels in vitro des épreuves biochimiques constructive. Acellulaire TXTL relie le processus de l’expression génique au produit final dans un environnement ouvert et réduit, par opposition à complex cytoplasme d’une cellule vivante. TXTL utilise l’ADN pour reconstruire les systèmes biochimiques in vitro, qui, avec des techniques modernes d’assemblage ADN, est abordable et rapide en plus d’étapes de purification de protéine fastidieux ne nécessitant ne pas. Acellulaire expression offre un accès direct à la plupart des composants dans les réactions biochimiques, ce qui permet une dissection plus profonde des interactions moléculaires12. Dans une réaction TXTL, on peut changer les paramètres biochimiques et biophysiques à volonté, qui est presque impossible dans une cellule vivante. Compte tenu de ces avantages et améliorations récentes, la technologie TXTL devient plus populaire comme une plateforme pour la biologie synthétique et quantitative. Alors que le milieu de la recherche à l’aide de TXTL croît rapidement et TXTL devient une technologie standard en bio-ingénierie, il est essentiel de comprendre comment utiliser ces plateformes afin de développer des pratiques adéquates relies à l’exécution des réactions TXTL et à la interprétation des résultats.
Dans cet article, nous décrivons comment utiliser un système TXTL tous les e. coli de synthétiser, dans les réactions d’un pot, bactériophages dans leur génome11, comme MS2 (ARN, 3,4 Ko), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 Ko) et T7 (dsDNA, 40 Ko). Nous montrons comment la quantité de phages synthétisé modifications par rapport à certains paramètres biochimiques des réactions (concentrations en magnésium et potassium). Un encombrement moléculaire, imité à travers une gamme de PEG 8000 des concentrations, a un effet dramatique sur la synthèse des phages sur plusieurs ordres de grandeur. La réalisation de ces grands systèmes biochimiques dans les réactions de simple tube à essai qui récapitulent en même temps les processus de transcription, traduction et autoassemblage, sont intéressant pour aborder des questions fondamentales liées à la biologie et la biophysique 10 (régulation des gènes, auto-assemblage), ainsi que pour développer des applications, telles que la réaffectation des fonctions phage pour construire de nouvelles nanostructures13. Outre une pratique sur TXTL, nous fournissent des méthodes pour l’amplification de phage, génome extraction et purification et quantification des phages par l’essai de plaque. Les méthodes présentées dans ce manuscrit sont appropriées pour les chercheurs qui utilisent des e. coli extrait basé des systèmes acellulaires et sont intéressés par les bactériophages.
Les protocoles présentés dans cet ouvrage peuvent être résumées comme suit : amplification 1) Phage (jour 1 : préparer l’inoculation de cellules, jour 2 : simple plaque, multiples phages croissance, concentration et jour 3 : purification du phage), 2) extraction d’ADN Double-brin du génome (extraction de phénol/chloroforme) et 3) réaction de phage acellulaire et expérience de titre (jour 1 : cellules hôtes sur plaque et faire des plaques d’agar, jour 2 : réaction acellulaire et host cell pré-culture et jour 3 : host cell culture et phage titre).

<table><tbody><tr><td>Tubes d’ultracentrifugation</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Gradient maker</td><td>BioComp Gradient Master</td><td>voir Anal Biochem. 1985 Jul ; 148(1) :254-9.</td><td></td></tr><tr><td>Seringue et canule émoussée</td><td>Monoject</td><td>8881513918 et 888202017</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette à large calibre</td><td>Fischerbrand</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de plaques</td><td>New Brunswik</td><td>Scientific Colony Counter Modèle C-110</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de culture</td><td>Fischerbrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Système acellulaire</td><td>Mycroarray Inc</td><td>Mytxtl</td><td></td></tr><tr><td>BioComp Gradient Master</td><td>BioComp Instruments</td><td>Modèle 105ME</td><td></td></tr><tr><td>Recette</td><td></td><td></td> de plaque de gélose LB <td>25 g/L de milieu Luria-Bertani (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents, numéro de produit BP1426) et 15 g/L de Bacto-Agar solide (Brenton, Dickenson and Company - numéro de produit 214010).</td></tr></tbody></table>

synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’expression acellulaire

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Une nouvelle génération de systèmes de transcription-traduction acellulaire (TXTL), machinées pour avoir une plus grande polyvalence et modularité, fournir de nouvelles capacités pour effectuer des sciences fondamentales et appliquées dans les réactions de l’éprouvette. Ces dix dernières années, TXTL acellulaire est devenu une technique puissante pour un large éventail de biologie liés à quantitative et synthétiques de zones nouvelles recherches multidisciplinaires. Les nouvelles plateformes TXTL sont particulièrement utiles à construire et à interroger les systèmes biochimiques grâce à l’exécution des circuits d’un gène synthétique ou naturelle. In vitro TXTL s’avère pratique pour rapidement les éléments de régulation prototype et réseaux biologiques aussi bien quant à rappel moléculaire auto-assemblage mécanismes trouvent dans les systèmes vivants. Dans cet article, nous décrivons comment infectieuses bactériophages, tels que MS2 (ARN), ΦΧ174 (ssDNA) et T7 (dsDNA), sont entièrement synthétisée à partir de leur génome dans les réactions d’un pot en utilisant un toutes les Escherichia coli, système TXTL acellulaire. Synthèse des trois coliphages est quantifiée à l’aide de l’essai de plaque. Nous montrons comment le rendement du phage synthétisée dépend des paramètres biochimiques des réactions. Encombrement moléculaire, imité par une concentration contrôlée de PEG 8000, détermine la quantité de phages synthétisées par ordres de grandeur. On décrit aussi comment amplifier les phages et purifier leurs génomes. L’ensemble des protocoles et des résultats présentés dans ce travail devrait être d’intérêt pour les chercheurs multidisciplinaires en bio-ingénierie et biologie synthétique acellulaire.

Nous montrons quatre résultats représentatifs. Dans la Figure 1, nous présentons un ensemble de contrôles négatifs pour s’assurer que le système TXTL acellulaire et les stocks de l’ADN du phage ne soient pas contaminées avec la vie cellules d’Escherichia coli . Nous vérifions que le système TXTL acellulaire est libre d’intact e. coli cellule contamination en ensemençant les deux une solution non incubés et couvés réaction nulle de l’ADN géno...

Une nouvelle génération de plates-formes de transcription-traduction acellulaire a été conçue pour construire des systèmes biochimiques in vitro par le biais de l’exécution des circuits de gène. Dans cet article, nous décrivons comment bactériophages MS2, ΦΧ174 et T7, sont synthétisés à partir de leur génome en utilisant un système tous les e. coli acellulaire TXTL.

Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

L'objectif général de cette expérience est de décrire comment les bactériophages sont synthétisés à partir de leur génome en utilisant un système entièrement cellulaire de transcription-translation dérivé d’E. coli. Cette méthode peut contribuer à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie synthétique, telles que l'élucidation des mécanismes moléculaires d'auto-assemblage dans les systèmes vivants. Le principal avantage de cette technique réside dans la polyvalence de la plateforme.De nombreux systèmes biologiques peuvent être entièrement recréés et finement ajustés pour l'analyse expérimentale. Commencez cette procédure par la préparation des plaques de bactériophages, comme décrit dans le protocole textuel. Utilisez l'extrémité d'une pipette Pasteur stérile pour carotter et prélever une plaque unique.Disperser la plaque dans les cellules diluées. Incuber ensuite à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Pour vérifier une infection complète, prélever un échantillon de 500 microlitres dans un tube de 1,5 millilitre et ajouter 10 microlitres de chloroforme.Vortexez immédiatement le mélange à grande vitesse et observez si la solution s'éclaircit, ce qui indique une i

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Cet article décrit la procédure à suivre pour la préparation d'une version marquée par fluorescence du bactériophage lambda, l'infection...

Après Cell-sort<em&gt; E. coli</em&gt; Après infection par le phage Lambda

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Source: Rustad, M. et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the amplification and recovery of infectious bacteriophages from E. coli cultures. It outlines the steps for plaque isolation, phage replication, controlled lysis, and purification.

Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

Preparation of Bacteriophage Lysate for Generalized Transduction

Source : Chen, Z., et al. Fabrication de particules pseudovirales marquées par fluorescence et PEGylées par chimie du dibromomaléimide-disulfure. J. Vis. Exp. (2018)Ce vidéo montre la méthode de l'expression contrôlée de la protéine de capside du bactériophage Qβ dans des E. coli modifiés. Les protéines résultantes s'assemblent spontanément en des particules de type viral, qui sont ensuite récoltées pour une bioconjugaison en aval.

Production de particules pseudo-virales dans des E. coli modifiés génétiquement

Ce protocole de cinq jours décrit toutes les étapes, de l'équipement et des logiciels supplémentaires nécessaires pour la création et l'exécution d'une Escherichia coli endogène efficace basé TX-TL système d'expression acellulaire à partir de zéro. Avec des réactifs, le protocole prend 8 heures ou moins de configurer une réaction, collecter et traiter les données.

Protocoles pour la mise en œuvre d'un Escherichia coli Sur la base du système d'expression cellulaire gratuit TX-TL pour la biologie synthétique

Ce protocole décrit la méthode, les matériaux, l’équipement et les étapes pour la préparation ascendante de l’ARN et des protéines produisant des cellules synthétiques. Le compartiment aqueux intérieur des cellules synthétiques contenait le lysate bactérien S30 encapsulé dans un bilayer lipidique (c.-à-d. liposomes stables), à l’aide d’une méthode de transfert d’émulsion d’émulsion de l’eau dans l’huile.

Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion

Il s’agit d’une méthode pour générer des virus vaccinias recombinants « sans cicatrices » à l’aide de la sélection de la gamme d’hôtes et de l’identification visuelle des virus recombinants.

Génération rapide et transparente de poxvirus recombinés à l’aide de la gamme d’hôtes et de la sélection visuelle

Les bactériophages (phages), des virus qui infectent les bactéries, font partie intégrante du microbiome intestinal. Bien que ces habitants symbiotiques déterminent la forme physique bactérienne et la dynamique des populations, on comprend peu de choses sur leur impact sur l’homéostasie intestinale et les maladies. Ce protocole étudie des phages T4 isolés dans un modèle murin, adaptable à d’autres paires phage-bactérie.

Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo

Ce protocole décrit le système de synthèse des protéines libres (CFPS) utilisé dans la construction des cellules synthétiques. Il décrit les étapes clés avec des résultats représentatifs dans différents micro-compartiments. Le protocole vise à établir les meilleures pratiques pour divers laboratoires de la communauté des cellules synthétiques, faisant ainsi progresser le développement des cellules synthétiques.

SYSTÈME DE SYNTHÈSE DE PROTÉINES ACELLULAIRES POUR LA CONSTRUCTION DE CELLULES SYNTHÉTIQUES

Ce protocole décrit une méthode pour produire et évaluer l’activité antimicrobienne et la cytotoxicité du peptide cationique Mel4 et du mimétique du peptide RK758. En intégrant la synthèse chimique, l’expression recombinante et les tests fonctionnels standardisés, il offre un flux de travail simplifié pour la production et le test de peptides et de mimiques de petites molécules.

Production et test de peptides antimicrobiens et de leurs mimiques

Découvrez la synthèse de bactériophages infectieux à partir de leur génome en utilisant un système acellulaire de transcription-traduction E. coli. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes d'auto-assemblage moléculaire en biologie synthétique.

Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire

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