Intégration de la dérivation libre de cellules souches pluripotentes induites par l'homme à l'aide de Laminin 521 Matrix

L’objectif global de ce protocole est de dériver des cellules souches pluripotentes humaines induites homogènes. Cette méthode peut être utilisée pour dériver des cellules souches pluripotentes humaines induites à de nombreuses fins, notamment la modélisation de maladies, le criblage de médicaments ou pour dériver des cellules pour des essais de thérapie cellulaire précliniques. L’avantage de ce protocole est qu’il est robuste et génère des cellules homogènes qui sont maintenues dans un système de culture convivial, sans xénogrammes et entièrement défini chimiquement.

Étant donné que les cellules iPS humaines récapitulent le patrimoine génétique du tissu donneur et peuvent potentiellement être différenciées en n’importe quel type de cellule lié à la maladie, elles fournissent d’excellents outils pour la modélisation de thèse. La biopsie, la dissection et le prélèvement de colonie sont des procédures complexes. Les voir effectués avec des mains expérimentées aide à la compréhension des procédures et facilite leur répétition.

Harriet RonnHolm et Kelly Day, deux techniciennes de laboratoire très expérimentées de l’iPS Core Facility du Karolinska Institutet, feront la démonstration de la procédure aujourd’hui. Les échantillons de biopsie cutanée peuvent être conservés dans du PBS plus 1 % de pénicilline streptomycine jusqu’à 48 heures à quatre degrés Celsius, mais doivent être traités le plus rapidement possible après leur obtention. Transférez la biopsie dans une boîte de 35 millimètres.

Immergez la biopsie cutanée dans une boîte de 35 millimètres avec deux millilitres d’éthanol à 70 % pendant 30 secondes. Ajoutez un millilitre de solution saline équilibrée stérile Hank’s complétée par 1 % de pénicilline streptomycine dans une nouvelle boîte de 35 millimètres et transférez la biopsie dans la nouvelle boîte. Transférez la biopsie dans une boîte de quatre 35 millimètres remplie d’un millilitre de solution de dispase à 0,1 % fraîchement préparée.

À l’aide de scalpels chirurgicaux stériles et de pinces, coupez la biopsie cutanée en morceaux d’un à deux millimètres cubes. Transférez les morceaux de biopsie avec la solution de dispase dans un tube de 15 millilitres et ajoutez deux millilitres supplémentaires de dispase. Rincez le plat de 35 millimètres avec un millilitre de solution de dispase et transférez la solution rincée dans le tube de 15 millilitres.

Incuber la biopsie à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, ajoutez quatre millilitres de collagénase I à 0,1 % dans le tube avec les morceaux de biopsie et incubez à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Trente minutes avant l’ensemencement des cellules, enrobez un puits dans une plaque de culture tissulaire à six puits avec un millilitre de gélatine à 0,1 % de DPBS.

Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Après quatre heures d’incubation avec de la collagénase, centrifugez les cellules digérées à 300 fois g pendant trois minutes à température ambiante. Aspirez le surnageant et remettez en suspension la digestion dans deux millilitres de milieu fibroblastique.

Retirez la solution de gélatine de la plaque de culture tissulaire à six puits préparée précédemment. Transférez la suspension cellulaire, y compris les morceaux de tissu restants, dans la plaque à six puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans une humidité élevée.

Les fibroblastes sont prêts à être acheminés dans un flacon de culture tissulaire T25 lorsqu’ils sont confluents à 80 %. Les fibroblastes au passage deux à quatre sont optimaux pour la reprogrammation car l’efficacité de reprogrammation est généralement plus élevée pour les fibroblastes à passage inférieur. Aspirez le milieu de culture cellulaire du ballon et lavez les cellules avec un millilitre de DPBS.

Aspirez le DPBS et ajoutez un millilitre de 0,5 % de trypsine EDTA. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que les cellules se détachent. Ajoutez deux millilitres de milieu de fibroblaste, remettez les cellules en suspension et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres.

Centrifuger à 300 fois g pendant trois minutes à température ambiante. Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu fibroblastique. Après avoir compté les fibroblastes à l’aide d’un hémacytomètre, ensemencez cinq fois 10 aux quatrièmes cellules dans un puits d’une plaque de culture tissulaire à 24 puits.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, étant donné que le virus Sendai sera manipulé, poursuivez la procédure dans un laboratoire BSL-2 désigné tout en utilisant l’équipement de protection individuelle approprié. Aspirez le milieu de culture cellulaire et ajoutez 250 microlitres de solution virale Sendai.

Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius. Un jour avant de cueillir les colonies, préparez des plaques de culture tissulaire à 24 puits recouvertes de LN-521. Pipetez 250 microlitres de solution LN-521 dans un puits d’une plaque de 24 puits.

Scellez la plaque à l’aide d’un parafilm et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, aspirez la solution LN-521 dans le puits de la plaque à 24 puits et ajoutez 500 microlitres d’E8 dans le puits. L’utilisation d’un filet à cheveux et d’un masque de procédure est recommandée lors du prélèvement des colonies au stéréomicroscope.

Les colonies sont prêtes à être cueillies lorsqu’elles atteignent une taille supérieure à un millimètre de diamètre, présentent des arêtes vives et se développent en monocouches homogènes. Ne choisissez pas de colonies avec des bordures floues et de grandes masses cellulaires hétérogènes non compactes. Coupez chaque colonie à l’aide d’un scalpel en petits morceaux selon un motif en forme de grille.

À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, grattez mécaniquement les feuilles cellulaires de la boîte, puis transférez la feuille dans un puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits préalablement recouverte de LN-521. La sélection des colonies est essentielle au succès de ce protocole. En cueillant quelques colonies supplémentaires, vous assurerez une fixation en nombre suffisant.

Laissez les cellules se fixer sans changer le milieu E8 pendant 48 heures. Passage enzymatique des cellules lorsque les colonies ont atteint une taille supérieure à cinq millimètres. Aspirez le milieu de culture cellulaire des cellules et lavez-les avec 250 microlitres de DPBS.

Aspirez le DPBS et ajoutez 250 microlitres de réactif de dissociation. Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Observez que les cellules ont commencé à s’arrondir.

Détachez les cellules de la plaque en rinçant les cellules avec un réactif de dissociation. Ajoutez 500 microlitres de milieu E8 dans un tube de 15 millilitres et transférez les cellules et le réactif de dissociation dans le tube. Centrifuger à 300 fois g pendant trois minutes.

Aspirez le surnageant du tube de 15 millilitres et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres de milieu E8. Comptez les cellules à l’aide d’un hémacytomètre et ensemencez 2,5 à cinq fois 10 cellules à la quatrième cellule dans un autre puits pré-enrobé LN-521 préalablement préparé contenant 500 microlitres de milieu E8 à température ambiante. Ajouter l’inhibiteur de ROCK à une concentration finale de 10 micromolaires.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius. En utilisant ce protocole, des colonies de cellules souches pluripotentes induites humaines émergent des fibroblastes transduits environ 12 jours après la transduction. Les colonies étaient prêtes à être cueillies environ trois à quatre semaines après la transduction.

Les caractéristiques préférées comprennent des masses cellulaires compactes aplaties, une croissance sous forme de monocouches homogènes et des arêtes vives. Ces images en champ clair montrent une lignée cellulaire humaine iPS homogène et entièrement reprogrammée à passage précoce par rapport à une lignée cellulaire très hétérogène. La perte du vecteur du virus Sendai a été confirmée par l’absence de marqueurs spécifiques du vecteur viral Sendai dans les cellules iPS humaines au passage 12, contrairement aux cellules iPS humaines au passage 3.

La coloration immunocytochimique de cellules dérivées pour les marqueurs de pluripotence OCT4, SSEA-4 et NANOG a donné un résultat positif homogène. L’expression de l’ARNm des gènes endogènes de pluripotence a été mise en évidence par PCR par transcriptase inverse. Les cultures cellulaires contenant des cellules partiellement reprogrammées qui n’exprimaient pas de facteurs de pluripotence ont été écartées.

Le potentiel de différenciation des cellules iPS humaines a été évalué par la formation de corps embryoïdes. La PCR en temps réel après 21 jours de différenciation du corps embryoïde a détecté l’expression de l’ARNm des marqueurs spécifiques de l’endoderme, du mésoderme et de l’ectoderme, ce qui a confirmé que les cellules iPS humaines dérivées étaient capables de se différencier dans les trois couches germinales. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée avec environ 22 heures de temps pratique sur une période d’environ 16 semaines.

Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme peuvent être différenciées en n’importe quel type de cellule du corps humain adulte pour répondre à toutes les questions pertinentes à votre domaine de recherche. Après avoir regardé cette vidéo, nous espérons que vous aurez une bonne compréhension de la façon d’effectuer les étapes nécessaires pour obtenir des cellules souches pluripotentes induites à partir de biopsies cutanées.