Name: Mise en place d’un imitateur précieux de la maladie d’Alzheimer dans le modèle Animal Rat par Injection intracérébroventriculaire de protéine bêta-amyloïde composite (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Découvrez comment créer un modèle de maladie d'Alzheimer chez le rat par injection intracérébroventriculaire de protéine bêta-amyloïde composite. Cette méthode permet d'évaluer les troubles de la mémoire spatiale et les changements neuronaux pathologiques.

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Le projet a été soutenu par la Fondation de sciences naturelles provinciales Hebei (no. C2009001007, H2014406048), l’Administration provinciale de Hebei de la médecine traditionnelle chinoise (no 05027) et le projet de Construction du sujet clé du Collège Provincial de Hebei en Chine.

Cette procédure était conforme à la réglementation d’Administration de Animal expérimental émis par le Comité d’état de la Science et technologie de la Chine le 31 octobre 198811. Les scientifiques suivent les directives établies et approuvées par leurs organismes de réglementation animales institutionnels et nationales.
NOTE : Animal et régents : quatre mois mâles Sprague-Dawley (300-350 g) ont été fournis pour cette expérience. Tous les rats étaient logés en groupes (quatre ou cinq par cage) à une température de 23 ± 1 ° C, avec un cycle lumière-obscurité de 12 h. Nourriture et l’eau étaient disponibles ad libitum. Les rats ont été acclimatés à des conditions de logement pendant 7 jours avant que la procédure a été effectuée. AB25-35 a été dissous dans une solution saline de DMSO de 1 % à 1 mg/mL et sonication pendant 5 min dans un oscillateur ultrasonique jusqu'à dissolution complète. AlCl3 et RHTGF-β1 ont été dissous dans une solution saline à 1 % et 0,1 mg/mL, respectivement. Rouge Congo, nitrate d’argent et autres produits chimiques étaient purs et ont été achetées sur le marché ordinaire.
1. intervention chirurgicale
Remarque : 20 mâles Sprague-Dawley ont été micro avec Aβ composite dans le ventricule latéral et le noyau thalamique antérodorsale et désigné comme le groupe composite imprégnées par l’Aß. Un autre 20 rats ont été soumis à la même opération mais reçu saline microinjection de 0,1 % DMSO et désigné comme le groupe opérés.
<ol><li>Anesthésier les rats avec l’isoflurane 100 % par inhalation et ensuite freiner sur un appareil stéréotaxique du cerveau.</li>
	<li>Raser la fourrure sur le sommet de la tête avec des ciseaux chirurgicaux et désinfecter avec iodophore. Ensuite, la couverture chirurgicale serviette jetable sur la tête.</li>
	<li>Faites une incision sur la peau de tête le long de la calvaria longitudinal médian avec ciseaux et Bistouris chirurgicaux.</li>
	<li>Séparer le tissu sous-cutané et le fascia, essuyer la voûte crânienne du crâne avec un coton sec stérile pour arrêter le saignement et marquez le bregma avec un marqueur.</li>
	<li>Se référer au Rat Brain stéréotaxiques carte12; Si l'on considère le bregma comme point d’origine, marquer les trois points, le noyau thalamique antérodorsale (ad) (postérieur (P) : 2,0 mm pour le bregma ; latérale (L) : 1,4 mm à la ligne médiane) d’injection RHTGF-β1 et fixant une vis, la (zone de ventricule latéral (LV) postérieur (P) : 0,8 mm pour le bregma ; latérale (L) : 2. 0 mm à la ligne médiane) pour injecter AB25-35 et AlCl3 et la deuxième vis de fixation de lieu (Front (F) : 2,0 mm pour le bregma ; latérale (L) : 1,5 mm à la ligne médiane).</li>
	<li>Doucement percer trois trous de 1 mm de diamètre avec une perceuse bone flexible, désignée aux trois points ci-dessus du crâne (1.5. étape). Ne pas visser à fond plus profond que nécessaire pour éviter les coups de couteau le tissu cérébral.</li>
	<li>Arrêter le saignement et nettoyer la surface du crâne à plusieurs reprises avec du coton sec stérile.</li>
	<li>Insérer une aiguille reliée à la pompe de la micro-injection, au cerveau à 4,6 mm de profondeur et doucement injecter 1 μL RHTGF-β1 (10 ng) dans le domaine de la publicité. Souhaitez-vous l’aiguille 2 min après l’injection et tirer lentement l’aiguille (supplémentaire 1 fichier).</li>
	<li>Fixer les deux vis dans le crâne, désigné dans les points de l’annonce et la deuxième vis fixant le lieu du crâne (qui ont été désignées en 1.5. étape) avec un petit tournevis. Ne pas visser à fond plus profond que nécessaire pour éviter les coups de couteau le tissu cérébral.</li>
	<li>Assemblage du système d’implantation de canule (2 fichier supplémentaire), insérer la canule factice dans la canule guide après désinfection par haute pression.</li>
	<li>Insérer la canule guide de tubes en acier inoxydable au cerveau à 4,6 mm zone de LV dans le trou du crâne (Supplemental fichier 3), avec l’aide du titulaire de la canule d’appareil stéréotaxique rats'.</li>
	<li>Mélanger le matériau de base de prothèse dentaire avec prothèse base eau au ratio de 1,5 g / mL 1, mettre la pâte pour couvrir le piédestal en plastique de canule guide et deux vis pour immobiliser la canule guide et jusqu'à la couverture de l’incision de la peau entière afin d’éviter l’infection de la peau.</li>
	<li>Jour 2 de l’opération, anesthésier les rats avec l’isoflurane inhalation à l’aide de la petite Machine d’anesthésie Animal. Retirer la canule factice, insérer la canule interne dans la canule guide et visser la vis de fixation pour immobiliser la canule interne.</li>
	<li>Mettre le tuyau de polyéthylène qui relie la pompe microinjection à la canule interne et régler la vitesse d’injection et 1 μL/min Microinject l’AB25-35 ou AlCl3 pour le LV.</li>
	<li>Microinject 4 μg (1 μL) AB25-35 par jour pendant 14 jours le matin et 3 μL AlCl3 (1 %) par jour pendant 5 jours dans l’après-midi sous anesthésie isoflurane.</li>
	<li>Attendre 5 min après l’injection, délicatement retirer la canule interne et insérer la canule factice à nouveau dans la canule guide.</li>
	<li>Sur la chirurgie post 15 jours (ce qui correspond au dernier jour d’injection d’AB25-35), démonter le système d’implantation de canule. Retirez doucement le solide matière base de prothèse dentaire avec ciseaux chirurgicaux et forceps, dévisser les deux vis, retirer la canule guide et désinfecter la plaie avec betadine. Remplir le trou du crâne avec ciment osseux et suture de la peau avec une méthode simple suture interrompu.</li>
	<li>Effectuer la même opération avec le groupe opérés et microinject salin de DMSO de 0,1 %.</li>
	<li>
Soins infirmiers postopératoires
	<ol>
<li>Maison 2 rats par cage après opération et fournir de la nourriture pendant 30 jours. Remarque : 18 rats du groupe opérés ont survécu (90 % taux de réussite de l’opération) et 19 rats dans le composite Aβ groupe traité ont survécu (taux de réussite de 95 % de l’opération).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dépistage des Rats modèle réussi et l’évaluation de la mémoire spatiale avec Morris Water Maze
<ol><li>
Labyrinthe aquatique de Morris Remarque : Le labyrinthe de l’eau de Morris a servi à évaluer les rat mémoire spatiale13. Le labyrinthe de l’eau de Morris est un réservoir circulaire en acier inoxydable avec 120 cm de diamètre et 50 cm de profondeur. Le test de labyrinthe de l’eau a été réalisé, basée sur le paradigme de « règles d’or » décrit en neurosciences comportementales par J. Nunez14.<ol>
<li>Noircir l’eau de la piscine avec quelques gouttes de colorant alimentaire.</li>
		<li>Maintenir la profondeur de l’eau à 31,5 cm et la température à 23 ± 1 ° C.</li>
		<li>Définir une plate-forme circulaire plexiglass transparent de 1,5 cm sous la surface de l’eau.</li>
		<li>Soutiennent que tous les signaux spatiales dans le labyrinthe de l’eau sont invariables pendant les essais de labyrinthe de l’eau.</li>
		<li>Diviser la piscine en 4 quadrants égales par des lignes imaginaires pour la collecte de données descriptives.</li>
		<li>Placez la plateforme cachée dans le premier quadrant (Q1) du labyrinthe aquatique.</li>
		<li>Capturer le rat nage des comportements (mesurées en latence, trajectoire ou passage) grâce à une caméra vidéo, sur le labyrinthe de l’eau lié à un logiciel analyse graphique sur ordinateur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dépistage des rats modèle réussi au groupe imprégnées d’Aβ composite
	<ol>
<li>Jour 45 de chirurgie, effectuer le labyrinthe de l’eau de Morris formation pendant 4 jours consécutifs dépister les rats modèle réussi avec troubles de la mémoire et de collecter le ratio de projection (SR). Note : Le SR est défini comme la latence moyenne de chaque rat imprégnées d’Aβ composite et le groupe opérés de rats pour trouver la plate-forme cachée sous l’eau de surface sur J4 d’eau formation de labyrinthe. « A » est la latence moyenne de chaque rat imprégnées d’Aβ composite pour trouver la plate-forme cachée et « B » est la latence moyenne du groupe opérés des rats pour trouver la plate-forme cachée, jour 4 de labyrinthe aquatique de formation, dans l’équation suivante : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56157/56157eq1.jpg"> Quand SR était supérieur à 0,2 pour un composite imprégnées d’Aβ rat, le rat était considéré comme un rat de modèle réussi avec troubles de la mémoire de composite imprégnées d’Aβ rat15. Les performances de la mémoire intraday a été calculée pour les données de 2 essais par la valeur moyenne des rats pour trouver la plate-forme cachée. Le processus de l’épreuve de labyrinthe de l’eau de Morris a été conçu de sorte que les rats étaient autorisés à nager dans le réservoir de labyrinthe d’eau et de la recherche pour la plate-forme cachée dans les 60 s. Si un rat n’a pas trouvé la plate-forme cachée dans les 60 s, puis le rat a été mis sur la plate-forme avec la main de l’expérimentateur. Quand un rat atteint sur la plate-forme cachée (indépendamment ou assistée), le rat a été loué y rester pendant 20 s. Ensuite, le rat a été retiré de la cuve et permet une récupération physique pour 10 s entre les 2 épreuves.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. examen de neurone
<ol><li>Sur la chirurgie post jour 86, sous anesthésie isoflurane, euthanasier les rats par décapitation (Figure 1).</li>
	<li>Mettre le cerveau sur la glace et séparer délicatement les deux hémisphères dans le raphé. Prenez l’hémisphère gauche du chiasma optique et le fixer à 4 % de formaldéhyde pour l’observation de la lumière microcopy de l’hématoxyline neurone et éosine (HE), rouge Congo ou de nitrate d’argent stain (voir Sections 4-6). Difficulté de la zone de hippocampe CA1 hémisphère droit au glutaraldéhyde à 2,5 % pour l’observation de microcopy électronique (Section 7).</li>
	<li>Traiter le cerveau pour la préparation des échantillons microcopy lumière/electron, comme précédemment décrit16,17.</li>
</ol>4. neurone HE coloration
<ol><li>Déparaffiner chaque diapositive (20 min chacun) avec gradient alcool (100 %, 95 %, 90 %, 80 % et 70 %) à l’eau distillée dans une hotte aspirante.</li>
	<li>Détachant pendant 3 min avec l’hématoxyline (0,5 % p/v) et puis les rincer à l’eau du robinet pour enlever la teinture indépendante de diapositives.</li>
	<li>Rincer avec de l’acide chlorhydrique 0,1 % dans l’alcool pour 1 s pour enlever la couleur des noyaux non colorés.</li>
	<li>Plonger dans la solution d’ammoniaque de 0,5 % pendant 2 min jusqu'à ce que le bleu clair de tours de fond.</li>
	<li>Détachant pendant 1 min avec 1 % éosine.</li>
	<li>Déshydrater pendant 5 min avec dégradé (alcool 70 %, 80 %, 90 %, 95 % et 100 %).</li>
	<li>Claire dans le xylène et monter avec milieu de montage résineuse.</li>
	<li>Observer et compter les neurones vivants de la tache d’HE par 0,125 mm dans le milieu CA1 de l’hippocampe et par 0,0352 mm2 dans le cortex cérébral à un grossissement de x 400 avec un microscope optique par une personne aveuglé à la conception expérimentale.</li>
</ol>5. Congo une coloration rouge pour doser le neurone Aβ fardeau
<ol><li>Déparaffiner chaque diapositive (20 min) avec gradient alcool (100 %, 95 %, 90 %, 80 % et 70 %) à l’eau distillée dans une hotte aspirante.</li>
	<li>Détachant pendant 20 min avec le rouge Congo solution (rouge Congo 0,5 g, alcool méthylique 80 mL, 20 mL glycerinum) de travail.</li>
	<li>Rincer à l’eau distillée pendant 5 min.</li>
	<li>Différencier rapidement avec une solution alcaline de 80 % d’alcool (hydroxyde de potassium 0,2 g d’alcool/100 mL) pour 3 s.</li>
	<li>Rincer deux fois, pendant 5 min avec de l’eau distillée.</li>
	<li>Contre-coloration à l’hématoxyline Gill pendant 3 min.</li>
	<li>Rincer à l’eau du robinet pendant 2 min.</li>
	<li>Tremper dans de l’eau ammoniaque (ajouter quelques gouttes d’hydroxyde d’ammonium pour l’eau du robinet et bien mélanger) pendant 30 s ou jusqu'à ce que les sections vire au bleues.</li>
	<li>Rincer à l’eau du robinet pendant 5 min.</li>
	<li>Déshydrater avec dégradé (alcool 70 %, 80 %, 90 %, 95 % et 100 %).</li>
	<li>Claire dans le xylène et monter avec milieu de montage résineuse.</li>
	<li>Observer et compter les cellules colorées au rouge Congo à un grossissement de x 400, avec un microscope optique par une personne aveuglé à la conception expérimentale.</li>
</ol>6. Nitrate d’argent souillant pour doser le neurone NFT Formation
<ol><li>Déparaffiner chaque diapositive (20 min) avec gradient alcool (100 %, 95 %, 90 %, 80 % et 70 %) à l’eau distillée dans une hotte aspirante.</li>
	<li>Plonger dans la solution de nitrate d’argent de 20 % et de capsulage agent pendant 20 min dans le noir.</li>
	<li>Laver à l’eau distillée deux fois, 5 min à chaque fois.</li>
	<li>Plonger dans la solution d’ammoniaque argent. Déposez l’ammoniac en solution dans 20 % solution de nitrate d’argent et ajouter jusqu'à ce que la solution va de turbidité de clarification. Simultanément, agiter la solution avec un agitateur en verre pendant 15 min et puis mis dans l’hydroxyde d’ammonium 1 % dilué pendant 2 min.</li>
	<li>Placez la lame dans la solution de travail en développement pour les 3-7 min jusqu'à ce que le bloc noir dans l’axone peut être observé.</li>
	<li>Plonger dans la solution d’ammoniaque de 0,1 % dilué pendant 1 min, puis rincer avec de l’eau pendant 1 min.</li>
	<li>Disposer avec thiosulfate de sodium 5 % pendant 2 min et puis rincez à l’eau pendant 5 min.</li>
	<li>Déshydrater avec dégradé (alcool 70 %, 80 %, 90 %, 95 % et 100 %).</li>
	<li>Claire dans le xylène et monter avec milieu de montage résineuse.</li>
	<li>Observer et de consigner la cellule pour les taches de nitrate d’argent à un grossissement de x 400 avec un microscope optique par une personne aveuglé à la conception expérimentale.</li>
</ol>7. hippocampe neurone Ultrastructure mesure
<ol><li>Couper l’hippocampe du rat CA1 en plusieurs cubes (1 x 1 x 1 mm3) et les déposer au glutaraldéhyde à 2,5 % pendant 2 h à 4 ° C.</li>
	<li>Rincer les cubes avec du PBS trois fois (pH 7,2, 10 min à chaque fois).</li>
	<li>Difficulté les cubes en acide osmique à 1 % pendant 2 h à 4 ° C.</li>
	<li>Rincer les cubes dans l’eau bidistillée 3 x (10 min à chaque fois).</li>
	<li>Déshydrater avec gradient alcool 50 %, 70 % et 90 % (10 min pour chacun), 100 % deux fois (15 min à chaque fois).</li>
	<li>Remplacer par l’oxyde de propylène deux fois (15 min à chaque fois), propylène oxyde : résine au 1:1 (60 min à chaque fois à température ambiante) et l’oxyde de propylène : résine 1:4 (60 min à chaque fois à température ambiante). Faire tremper dans de la résine (120 minutes, à température ambiante).</li>
	<li>Incorporer l’EPON 812 et polymériser (5 h/35 ° C, 60 ° C/5 h, 5 h/80 ° C).</li>
	<li>Les coupes semi-fines (1 µm), tache de bleu de méthylène et localiser sous le microscope.</li>
	<li>Tacher les sections ultra-minces (50 nm) avec du citrate-o-acétate d’uranyle et de plomb.</li>
	<li>Examiner sous un microscope électronique à JEM-1400 et de recueillir des images.</li>
</ol>

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<li>Morley, J. E., Farr, S. A., Kumar, V. B., Armbrecht, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SAMP8+mouse%3A+a+model+to+develop+therapeutic+interventions+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">The SAMP8 mouse: a model to develop therapeutic interventions for Alzheimer's disease.</a> Curr Pharm Des. 18, 1123-1130 (2012).</li>
<li>Puzzo, D., Gulisano, W., Palmeri, A., Arancio, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+Alzheimer%27s+disease+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 10, 703-711 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il est bien connu que la perte de l’apprentissage et la mémoire sont les signes cliniques majeurs chez AD patients2. La procédure décrite ici est une méthode in vivo pour étudier les AD ; Nous avons adapté un protocole déjà publié qui se sont avérés un médicament pour pallier les déficits de mémoire et des lésions neuronales dans un modèle de rat4. Notre protocole fournit des détails importants pour obtenir des données précieuses, ainsi qu’un taux de survie élevé des animaux qui modélisent avec succès des opération, déficits de mémoire, blessures de neurone, fardeau de bêta-amyloïdes et des dépôts de NFT, pour imiter les AD (dans la présente expérience, le taux de survie et modèle de fonctionnement sont plus de 90 %). Ces rats modèle fructueux ont été utilisés pour mesurer leur mémoire spatiale avec le test de labyrinthe de l’eau de Morris. Le procès de navigation positionnement trouvé que l’Aβ composite peut causer rat acquisition mnésique ; le procès de la sonde a trouvé que l’Aβ composite peut diminuer la rétention de rat de mémoire ; et la reprise du procès a trouvé que l’Aβ composite peut entraîner rat réapprentissage de déficience. Ces données d’essai Morris water maze montrent que l’Aβ composite peut induire la mémoire spatiale de rat. Dans l’ensemble, injectant des rats intracerebroventricularly AB25-35 en combinaison avec AlCl3 et TGF-β1 créé un réalisable et crédible le in vivo AD-comme modèle animal pour le laboratoire.
Des études antérieures ont montré que le volume du cerveau chez les patients AD est de 10 % inférieur à celui des individus en bonne santé. Atrophies diverses se trouvent dans l’hémisphère cérébral par observation visuelle. Le degré d’atrophie corticale est positivement reliée à l' insuffisance de mémoire19. À l’histologie, le grand nombre de perte de neurone et grave pathologie morphologique dérange directement la fonction de mémoire dans AD patients20. Dans la présente étude, l’observation microscopique de lumière/electron a trouvé que les rats micro avec Aβ composite affichent bouleversements neuropathologiques de la maladie, y compris la perte de neurones et la perturbation de la structure neuronale et subcellulaire. Ce résultat confirme le trouble de la mémoire spatiale de rat induit par l’Aß composite et est similaire à l’état des patients atteints de ma.
Il est bien connu que le fardeau de bêta-amyloïdes cérébrales et agrégation NFT sont considérés comme les principaux traits de histopathogenic en AD. Ils peuvent détruire la structure neuronale, perturber la signalisation neuronale, perturber la fonction neuronale et aboutir à la démence avancée17. Le présent modèle animal trouvé fardeau Aβ et agrégation NFT dans le cerveau, qui suis d’accord avec l’état de patients AD. Par conséquent, les blessures de neurones présents chez le rat induite par l’Aß composite peuvent servir comme modèle pour étudier la pathologie neuronale et la stratégie de traitement de la ma.
Voici des exemples des effets de la drogue dans les modèles de rat AD de dépistage : Zhao et al., a indiqué que les deux flavonoïdes de Scutellaria tiges et feuilles (SSF) et Scutellaria barbata (SBF) peut atténuer les troubles de la mémoire rat et l’apoptose induite par composite Aβ8,9. Guo et al., a aussi déclaré que SBF peut inhiber l’agrégation NFT et phosphorylation excessive de protéines tau à côté de Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 et Thr231 et diminuer l’expression de GSK-3β, CDK5 et PKA ARNm et de protéines chez les rats traités Aβ compositées21 . Simultanément, Shang et al., ont également rapporté que SBF peut supprimer la prolifération des astrocytes et les cellules microgliales et l’inférieure Aβ1-40, la Aβ1-42, et β-site APP clivage enzymatique 1 (BACE1) expression de l’ARNm dans le cerveau d’Aβ compositée rats22. D’après ces résultats, notre modèle animal est avantageux sur autre modèle AD-like, qui impliquent plus de fonction neuronale et de structure et de trouble.
Pour autre modèle AD-like, injection unique intracérébroventriculaire de bêta-amyloïdes à des rats peut provoquer des déficits de mémoire de rat, la perte de neurone et prolifération de neurogliocyte, mais peut ou peut ne pas avoir de dépôts Aβ et NFT23. Des rats exposés à des doses élevées Al semblent avoir un taux de réussite élevé, imitateur AD et un modèle animal rentable, avec troubles de la mémoire, perte de neurone, prolifération de neurogliocyte et plaque sénile (SP) et agrégation NFT dans le cerveau. Cependant, la forte dose d’Al peut provoquer des lésions du foie de rat et anorexie, accompagnée d’une diminution de poids24. Le rat âgé est un autre modèle de type AD. Les rats âgés montrent des déficits de mémoire, des changements pathologiques de structure neuronale/sous-structure, des dépôts de lipofuscine, mais sans fardeau d’Aβ et agrégation NFT. Rats de plus de 24 mois d’âge sont considérés comme des personnes âgées pour ce modèle et donc il faut une plus longue période d’alimentation et donc le coût est supérieur de17,25. Des souris transgéniques SAMP8 et APP sont les plus proche simulent à AD et ils sont des modèles le plus idéales pour enquêter sur les AD. Mais les deux modèles animaux sont plus chers et sont limités à utiliser dans le laboratoire26,,27. Comparaison avec les modèles animaux ci-dessus, notre modèle de composite modèle animal imprégnées d’Aβ a un moindre coût et haute performance, ce qui en fait un outil idéal pour l’étude AD.
En conclusion, une injection intracérébroventriculaire d’AB25-35 combiné avec AlCl3 et TGF-β1 aux rats vous propose un modèle animal précieux in vivo afin de mieux comprendre les troubles de la mémoire spatiale, lésions neuronales, fardeau de bêta-amyloïdes et le dépôt de NFT AD sous-jacent. Ce modèle fournit un rapide et relativement simple protocole expérimental avec un animal élevé survivre taux et taux de succès élevé modèle de fonctionnement, ainsi qu’un taux élevé de chevauchement d’activités, qui ont montré pour être plus économique. Le présent modèle animal est un modèle efficace pour imiter les AD et peut valider davantage en étant utilisé pour imiter les diverses autres maladies.

Il est bien connu que l’AD est une maladie neurodégénérative chronique et progressive, avec perte de mémoire progressive comme le syndrome clinique principal. Il y a dans la pathologie générale, atrophie des tissus du système nerveux, neurones et perte de synapse, ainsi que subcellulaire structure et la fonction troubles neuronaux, qui sont tous impliqués dans le développement et la manifestation clinique de AD1,2. Il est signalé que, lorsque les animaux était intracerebroventricularly injecté avec bêta-amyloïdes, certains événements neurotoxiques se produisent dans le cerveau impliquant la perte de neurone, perturbation de l’homéostasie du calcium, l’apoptose neuronale et de surproduction espèces réactives de l’oxygène3. Toutefois, plusieurs facteurs sont impliqués dans la pathogenèse de la ma, et il est donc essentiel d’établir un meilleur modèle d’annonce.
Un protocole détaillé est décrit ici pour établir une en vivo mimique AD modèle grâce à une injection intracérébroventriculaire AB25-35 et AlCl3, combiné avec l’injection de noyau thalamique antérodorsale RHTGF-β1 aux rats. Cette modelhighly de rat imite la fonction neuronale humaine et histopathogenesis de la ma, y compris les troubles de la mémoire, la perte de neurone et dommage de structure, apoptose, fardeau d’Aβ intracellulaire et NFT agrégation4,5,6 , 7 , 8 , 9. l’AlCl3 empêche l’Aβ déposé formant Aβ soluble, et le RHTGF-β1 peut promouvoir la production d’Aß déposée et faciliter AD occurrence10. Cette attaque de plusieurs facteurs, le neurone est conformément à la pathogenèse multiples de AD.
L’expérience entière s’étend sur 82 jours : la Figure 1 présente une chronologie de la conception expérimentale, avec le point de temps de chirurgie animale, modèle animal dépistage, test de la mémoire spatiale animaux et préparation des échantillons. Le premier jour de l’opération, RHTGF-β1 a micro dans le noyau thalamique antérodorsale. Le deuxième jour d’opération, AB25-35 et AlCl3 ont été microinjected dans le ventricule latéral quotidiennement pour 14 jours consécutifs, le matin et 5 jours consécutifs dans l’après-midi, respectivement. Tous les rats ont été autorisés à récupérer pendant 45 jours après l’opération. Le labyrinthe de l’eau de Morris a été utilisé pour dépister les rats modèle réussi avec troubles de la mémoire et pour évaluer la mémoire spatiale des rats. Les rats ont subi 4 jours consécutifs de labyrinthe aquatique de formation avec 2 essais par jour et le jour 4 de la formation, les rats ont été évalués avec la performance de labyrinthe d’eau Morris pour troubles de la mémoire. Tous les rats ont continué d’être nourri de 37 jours après la projection de modèle animal. La mémoire spatiale des rats a été testée dans le labyrinthe de l’eau de Morris à plus de 7 jours consécutifs, du 79 au jour 85 après l’opération. Tous les rats ont été sacrifiés par décapitation jour 86 pour la préparation d’échantillons de cerveau.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56157/56157fig1.jpg"> La figure 1. Chronologie de la conception expérimentale. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56157/56157fig1large.jpg">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Rat Sprague-Dawley</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, Chine</td><td>SCXK(Jing) 2012-0001</td><td>300&amp;ndash ; 350 g</td></tr><tr><td>Labyrinthe d’eau Morris</td><td>Académie chinoise des sciences médicales et Institut de recherche médicale de l’Union de Pékin, Chine</td><td>Pas</td><td></td></tr><tr><td>d’anesthésie mobile pour petits animaux</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chine</td><td>R580</td><td></td></tr><tr><td>Appareil stéréotaxique cérébral</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chine</td><td>68001</td><td></td></tr><tr><td>Foret osseux flexible</td><td>Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. Chine</td><td>BW-sD908</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission</td><td>Japan Co., Ltd. Japon</td><td>JEM-1400</td><td></td></tr><tr><td>Pompe de micro-injection à deux canaux</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chine</td><td>RWD202</td><td></td></tr><tr><td>EM microtome</td><td>Hitachi Co., Ltd. Chine</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>Canule factice</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chine</td><td>62001</td><td>0.D.0.64&amp;fois ; I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html</td></tr><tr><td>Canule de guidage</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chine</td><td>62101</td><td>0.D.0.40mm/M3.5</td></tr><tr><td>Canule interne</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chine</td><td>62201</td><td>0.D.0.41&amp;times ; I.D.0.25mm/<img alt="Special » src=">M3.5</td></tr><tr><td>Serrez l’écrou</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chine</td><td>62501</td><td>0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5</td></tr><tr><td>Vis de fixation</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chine</td><td>62514</td><td>M1.2&amp;times ; L2.0mm (100BAO)</td></tr> <tr><td>Le tournevis</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chine</td><td>62999</td><td>45 * 1mm</td></tr><tr><td>Tube PE</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Chine</td><td>62302</td><td></td></tr><tr><td>Amyloïde bêta 25-35</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>États-Unis SCP0002-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance transformant humain recombinant-&amp;beta ; 1</td><td>PeproTech Inc.</td><td>États-Unis 100-21</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorure</td><td>d’aluminium Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. Chine</td><td>3011080</td><td></td></tr><tr><td>rouge Congo</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. Chine</td><td>3010016</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate d’argent</td><td>Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd.</td><td>Chine 20150720</td><td></td></tr><tr><td>Matériau de base pour prothèse dentaire</td><td>Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. Chine</td><td>20170609</td><td></td></tr></tbody></table>

mise en place d’un imitateur précieux de la maladie d’alzheimer dans le modèle animal rat par injection intracérébroventriculaire de protéine bêta-amyloïde composite

Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein

La maladie d’Alzheimer (ma) est une maladie cérébrale irréversible progressive qui détruit la mémoire lentement et qui s’accompagne de changements de structure et de la perte de neurone. Avec l’augmentation d’Alzheimer dans le monde entier, la pathologie et le traitement de la maladie est devenue un foyer dans l’industrie pharmaceutique internationale. Ainsi, la mise en place du modèle animal pour imiter les AD en laboratoire est de grande importance.
Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’établissement d’un imitateur de la ma chez un animal rat modèle cependant une injection intracérébroventriculaire d’amyloïde bêta protéine 25-35 (AB25-35) combiné avec le trichlorure d’aluminium (AlCl3) et le noyau thalamique antérodorsale injection d’humain recombinant, transformant le facteur de croissance-β1 (RHTGF-β1) à des rats. Les marqueurs liés de l’AD ont été mesurés, y compris : la mémoire spatiale, structure neuronale et sous-structure, Aβ neuronale et la production d’enchevêtrements neurofibrillaires (NFT). Ce modèle de rat démontre des troubles de la mémoire spatiale, la structure neuronale et des changements pathologiques de sous-structure, fardeau Aβ intracellulaire de neurone et agrégation NFT et fournit un imitateur étroit du désordre structure et la fonction neuronal à celle de la clinique Patients atteints de ma. Ainsi, le présenté AD rat modelprovides un outil précieux en vivo pour explorer la fonction neuronale, pathologie neuronale et dépistage des drogues d’AD.

Il s’agit d’un protocole pour imiter la maladie d’Alzheimer chez des rats par l’évaluation des troubles de la mémoire spatiale, des changements pathologiques neuronales, fardeau de protéine (Aβ) bêta-amyloïde neuronale et l’agrégation enchevêtrements neurofibrillaires, induite par l’injection d’AB25-35 combiné Trichlorure d’aluminium et recombinantes humaines transformant le facteur de croissance-β1.

Mise en place d’un imitateur précieux de la maladie d’Alzheimer dans le modèle Animal Rat par Injection intracérébroventriculaire de protéine bêta-amyloïde composite

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle reproduit la maladie d'Alzheimer chez le modèle animal rat par injection intracérébroventriculaire de l'A-bêta 25 à 35, combinée au chlorure d'aluminium et au facteur de croissance transformant bêta un humain recombinant. Elle offre également un protocole expérimental rapide et relativement simple, avec un taux de survie élevé chez les animaux, un taux élevé de réussite du modèle ainsi qu'un taux élevé de duplication, ce qui s'est révélé plus économique.Les implications de cette technique s'étendent à l'évaluation de l'efficacité de médicaments contre la maladie d'Alzheimer, car ce modèle animal présente des troubles de la mémoire et des perturbations neuronales proches de l'état des patients atteints de la maladie d'Alzheimer. La démonstration de la procédure sera effectuée par Cheng Jianjun, un technicien de mon laboratoire. Sur un rat anesthésié, commencez par couper les poils au sommet de la tête avec des ciseaux chirurgicaux, puis désinfectez avec de l'iodophore.Ensuite, pratiquer une incision sur la peau de la tête le long de la calvaria médiane longitudinale à l’aide de bistouris chirurgicaux et de ciseaux. Séparer les tissus sous-cutanés et la fascia, nettoyer la calvaria du crâne avec du peroxyde d’hydrogène à 0,3 %, puis marquer le bregma à l’aide d’un stylo marqueur. Ensuite, marquer trois points : le noyau thalamique antérodorsal destiné à l’injection de RHTGF bêta un et à la fixation d’une vis, la région du ventricule latéral, ou VL, pour l’injection d’A-bêta 25-35 et d’AICI3, et enfin l’emplacement de fixation de la seconde vis.Percez délicatement trois trous d'un diamètre d'un millimètre à l'aide d'un foret osseux flexible sur les trois points marqués du crâne. Arrêtez le saignement et nettoyez régulièrement la surface du crâne avec du coton stérile et sec. Ensuite, insérez une aiguille reliée à une pompe de micro-injection dans le cerveau à une profondeur de 4,2 millimètres, puis injectez doucement un microlitre de RHTGF bêta un dans la région ad.Conserver la microinjection pendant deux minutes après l'injection. Ensuite, la retirer lentement. Fixer les deux vis dans le crâne, aux points préalablement marqués, à l’aide d’un petit tournevis.Après la fixation de la vis, assembler le système d'implantation de la canule en insérant d'abord la canule factice dans la canule guide après désinfection par immersion dans de l'alcool à 75 % pendant 24 heures. Ensuite, insérer la canule guide en tube d'acier inoxydable dans le cerveau à 4,6 millimètres dans la région des ventricules latéraux (LV) à travers le trou pratiqué dans le crâne, à l’aide d’un support de canule fixé sur l’appareil stéréotaxique du rat. Puis, mélanger le matériau de base pour prothèse dentaire avec de l’eau pour base de prothèse dans un rapport de 1,5 gramme par millilitre.Appliquez la pâte pour recouvrir le socle en plastique de la canule guide ainsi que les deux vis destinées à immobiliser la canule guide. Recouvrez entièrement l'incision cutanée afin d'éviter toute infection cutanée. Le jour suivant, retirez la canule factice et insérez la canule interne dans la canule guide.Vissez la vis de fixation pour immobiliser la canule interne. Placez le tube en polyéthylène reliant la pompe de microinjection à la canule interne, puis réglez la vitesse d'injection à un microlitre par minute. Microinjectez l'A-bêta 25-35 dans le LV. Attendez cinq minutes après la fin de l'injection, puis retirez délicatement la canule interne.Ensuite, réinsérez la canule factice dans la canule guide. Au jour 15 après la chirurgie, démontez le système d'implantation de canule en retirant le matériau de base de prothèse solidifié à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de forceps, puis désinfectez la plaie avec un iodophore. Enfin, comblez le trou du crâne avec du ciment osseux et fermez la peau selon une méthode de suture simple interrompue.Commencez par noircir l'eau du bassin à l'aide d'un colorant alimentaire noir. Maintenez la profondeur de l'eau à 31,5 centimètres et la température à 23 ± 1 degré Celsius. Ensuite, placez une plateforme circulaire transparente en plexiglas de 1,5 centimètre sous la surface de l'eau.Ensuite, divisez le bassin en quatre quadrants égaux à l’aide de lignes imaginaires pour la collecte descriptive des données. Placez la plateforme cachée dans le premier quadrant, ou Q1, du labyrinthe aquatique. Enfin, enregistrez les comportements de natation du rat à l’aide d’une caméra vidéo au-dessus du labyrinthe aquatique, reliée à un logiciel d’analyse graphique sur ordinateur.Ces résultats indiquent que le groupe de rats soumis à une intervention factice nageait toujours librement, tandis que les rats du groupe traité par l'A-bêta composé nageaient systématiquement autour du périmètre du bassin en nage adaptative dans le labyrinthe aquatique de Morris. Au cours des quatre jours de dépistage des rats modèles présentant un déficit de mémoire, tous les rats ont vu leur temps pour trouver la plateforme cachée diminuer progressivement. En outre, les latences du groupe traité par l'A-bêta composé pour localiser la plateforme cachée étaient significativement plus longues que celles du groupe soumis à une intervention factice, ce qui démontre que l'A-bêta composé peut exacerber l'altération de la réapprentissage de la mémoire chez le rat.Dans l'essai de rétention de la mémoire d'une journée, le groupe traité par l'A-bêta composé a mis moins de temps à nager, a parcouru une distance de nage moindre et a effectué moins de passages en 60 secondes, par rapport au groupe soumis à une opération factice. Enfin, outre les modifications pathologiques, le nombre de neurones était également significativement réduit dans l'hippocampe et le cortex cérébral du groupe traité par l'A-bêta composé par comparaison avec le groupe soumis à une opération factice. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 à 30 minutes si elle est correctement exécutée.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à éviter que la canule guidée ne tombe de la vis cérébrale. Après cette procédure, d'autres méthodes comme le test de labyrinthe peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple si le modèle d'AD simulé a été couronné de succès. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les maladies neurodégénératives in vivo.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mettre en place des modèles animaux mimant la maladie d'Alzheimer par injection intracérébroventriculaire de l'amyloïde bêta 25 à 35 combinée au chlorure d'aluminium et au facteur de croissance transformant bêta un humain recombinant chez le rat. N'oubliez pas que le travail avec le polyméthacrylate de méthyle peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de masques et de gants doivent toujours être prises lors de cette procédure.

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Cette vidéo montre la procédure d'injection de peptides amyloïdes monomères dans le cerveau antérieur d'un poisson-zèbre adulte pour générer une toxicité amyloïde, imitant les lésions neuronales observées dans la maladie...

Établissement d'un modèle de maladie d'Alzheimer dans le cerveau d'un poisson-zèbre par injection de peptide amyloïde

Cette vidéo montre la procédure d’injection de peptides bêta-amyloïdes, de chlorure d’aluminium et d’un facteur de croissance neuro-inflammatoire, qui contribuent collectivement à la formation de plaques amyloïdes toxiques dans la région de l’hippocampe. Cela provoque des troubles de la mémoire chez le rat, caractéristiques de la maladie d'Alzheimer.

Établissement d’un modèle de rat de la maladie d’Alzheimer par injection d’un peptide bêta-amyloïde

Cette vidéo démontre l'infusion stéréotaxique précise de bêta-amyloïde dans le gyrus denté pour établir un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. La détermination précise des coordonnées et l'administration contrôlée des protéines bêta-amyloïdes entraînent une dégradation neuronale, perturbent le traitement de la mémoire et contribuent au développement de la maladie d'Alzheimer.

Perfusion cérébrale stéréotaxique directe de protéines bêta-amyloïdes pour un modèle de maladie d’Alzheimer

Ici, nous présentons un protocole pour la perfusion cérébrale stéréotaxique directe de bêta-amyloïde. Cette méthodologie fournit un modèle murin vivo alternatif pour aborder les effets à court terme de la bêta-amyloïde sur les neurones cérébraux.

Infusion stéréotaxique des oligomères bêta-amyloïde dans les Hippocampus souris

Pour étudier la maladie de co-morbide de la maladie d'Alzheimer (AD) et l'état de la course dans un modèle roman, trois tâches de comportement sont décrites qui permettent d'évaluer à la fois le contrôle moteur et comportements cognitifs. Ces tâches comprennent la tâche de faisceau à pied, tâche de cylindre et labyrinthe aquatique de Morris.

Moteur et hippocampique apprentissage spatial et dépendante Référence évaluation de la mémoire dans un modèle de rat transgénique de la maladie d&#39;Alzheimer avec des maladies

Le amyloïde-β (Aß) -injected modèle animal permet à l'administration d'une quantité et d'espèces de fragments Aß défini et réduit les différences individuelles au sein de chaque groupe d'étude. Ce protocole décrit l'injection intracérébroventriculaire (ICV) de Aß sans instrument stéréotaxique, ce qui permet la production d'anomalies du comportement de type Alzheimer chez les souris normales.

Injection intracérébroventriculaire de Peptides amyloïde-ß chez les souris normales à Provoquer Pleinement Déficits cognitifs de type Alzheimer

Pour étudier les effets d’Aβo in vivo, nous avons développé un modèle basé sur des perfusions répétées d’Aβo soluble dans l’hippocampe couplées à une perfusion continue d’anticorps Aβo (6E10) dans l’hippocampe à l’aide de pompes osmotiques pour contrer l’effet neurotoxique d’Aβo.

Neurodégénérescence dans un modèle animal de chronique bêta-amyloïde Oligomère Infusion est contrecarré par Antibody traitement Infused avec les pompes osmotiques

Nous avons développé une méthodologie pour la 3D quantitative dans la modélisation de silico (q3DISM) de amyloïde cérébrale-β (Aß) phagocytose par les phagocytes mononucléaires dans des modèles de rongeurs de la maladie d'Alzheimer. Cette méthode peut être généralisée pour la quantification de pratiquement tous les cas de phagocytose in vivo.

3D quantitative In Silico Modélisation (q3DISM) de Cerebral bêta-amyloïde phagocytose dans les modèles rongeurs de la maladie d'Alzheimer

Ce protocole décrit la synthèse, la caractérisation et injection de peptides de monomère amyloïde-β42 pour générer les toxicité amyloïde dans adult poisson zèbre à établir un modèle de la maladie d’Alzheimer, suivi d’analyses histologiques et détection de agrégations.

Modélisation de toxicité amyloïde-β42 et neurodégénérescence dans le cerveau de poisson-zèbre adulte

Ce protocole illustre une méthode d'encapsulation cellulaire par la gélation physique rapide de l'alginate pour immobiliser des cellules. Les microbilles obtenues permettent une sécrétion contrôlée et soutenue de l'amyloïde au fil du temps et peuvent être utilisées pour étudier les effets de l'amyloïde sécrété dans les modèles in vitro et in vivo.

Fabrication de microbilles d'amyloïde-Sécrétion d'alginate pour l'utilisation dans la modélisation de la maladie d'Alzheimer

Découvrez comment créer un modèle de maladie d'Alzheimer chez le rat par injection intracérébroventriculaire de protéine bêta-amyloïde composite. Cette méthode permet d'évaluer les troubles de la mémoire spatiale et les changements neuronaux pathologiques.

Mise en place d’un imitateur précieux de la maladie d’Alzheimer dans le modèle Animal Rat par Injection intracérébroventriculaire de protéine bêta-amyloïde composite (Vidéo) | JoVE Journal

Mise en place d’un imitateur précieux de la maladie d’Alzheimer dans le modèle Animal Rat par Injection intracérébroventriculaire de protéine bêta-amyloïde composite

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