Name: Détection de la colonisation de Escherichia Coli entéro-hémorragique en hôte murin par système de Bioluminescence Non invasif In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Découvrez la détection de la colonisation d'EHEC chez la souris par imagerie de bioluminescence non invasive in vivo. Cette méthode permet de suivre la présence bactérienne en temps réel sans sacrifice animal.

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Nous reconnaissons Chi-Chung Chen de la Department of Medical Research, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taïwan) à l’aide de la souris, maladies infectieuses et le soutien du centre animaux Laboratoire National Cheng Kung University. Ce travail est soutenu par le ministre de la Science et la technologie (MOST) accorde (plus 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011,-005 and106-2321-B-006) aux CC.

ATTENTION : EHEC O157 : H7 est un niveau de biosécurité 2 (BSL-2) pathogène selon les Centers for Disease Control and Prevention (CDC) instruction de biosécurité (https://www.cdc.gov/). Par conséquent, toutes les procédures expérimentales impliquant ECEH doivent être effectuées dans un établissement de BSL-2. Porter des gants et blouses tout en exécutant l’expérience. Travailler dans une cabinet de biosécurité certifiée (BSC). Désinfecter le banc expérimental avant et après la procédure expérimentale avec l’éthanol à 70 %. Tous les instruments ou matériel que EHEC contact (ou potentiellement contact) doit être désinfecté avec l’éthanol à 70 % ou l’eau de Javel. Les déchets contaminés (ou potentiellement contaminés) devraient être soigneusement scellé et stérilisés à l’autoclave. Portez un masque, des lunettes de protection, double gants ou une combinaison, si nécessaire. Les souris femelles C57BL/6 de 6 semaines ont été achetés et maintenues à la laboratoire Animal Center de la National Cheng Kung University (NCKU). Les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité emploi de NCKU (numéro d’agrément 104-039) et d’institutionnels animalier.
1. génération de bactéries ECEH marqués au Bioluciferase
<ol><li>Mélanger 50 ng d’acide désoxyribonucléique (ADN), 1 μL de 10 μM avant et marche arrière amorces, désoxynucléotides de 2,5 mM 2 μL (dNTPs), 2 μl 10 x tampon, 0,2 μL ADN polymérase et eau bidistillée stérile (ddH2O) pour un volume final de 20 μL d’amplifier le anti-kanamycine cassette, de gène nptII 24. La matrice d’ADN est du pBSL18024, qui est acheté depuis le projet National de BioResource (PRBN). Les conditions de la PCR sont répertoriées dans le tableau 1 et la séquence d’amorçage est disponible dans le tableau 2.</li>
	<li>Ligaturer les produits PCR à un vecteur de clonage commercial suivant le kit du protocole (voir Table des matières).</li>
	<li>Le fragment de gène nptII depuis le vecteur de clonage par NsiI et SmaI l’accise et de cloner dans pBBR1MCS4, qui est digéré par la NsiI et ScaI du pAKlux29 pour créer le plasmide résistant à la kanamycine, pWF27813.</li>
	<li>L’opéron luxCDABE , de la luciférase exprimant le plasmide9, pAKlux2, par SpeI-HF et ScaI et clone de l’accise à SpeI-HF et SmaI digéré pWF278 pour générer la kanamycine résistant et luciférase exprimant le plasmide, pWF27913. Remarque : Pour les extractions de plasmide et les fragment excisé des purifications, utilisez l’extraction de plasmide commerciale et le kit d’extraction de gel, respectivement. Pour la digestion enzymatique, mélanger 100 ng ADN, 1 tampon de x 10 μL, 1 μL de chaque enzyme de restriction sélectionné et ddH stérile2O pour un volume total de 10 μL et incuber à 37 ° C pendant 2,5 à 3 h.</li>
	<li>Transformer le plasmide pWF279 cellules compétentes d’Escherichia coli O157 : H7 EDL933 par électroporation avec 2 500 V pour 4 ms.</li>
	<li>Incuber les cellules bactéries transformées en milieu Luria-Bertani (LB) 1 mL à 37 ° C pendant 1 h.</li>
	<li>Plaque de la bactérie sur une gélose LB additionné de 50 µg/mL de kanamycine à 37 ° C pendant 16-18 h.</li>
	<li>Vérifier le signal de bioluminescent de la plaque par un in vivo d’imagerie machine le lendemain. Prélever une colonie unique sur la plaque et il culture dans 3 mL LB additionné de 50 kanamycine µg/mL à 37 ° C pendant 16-18 h.</li>
	<li>Préparer bactérienne stock moyen en diluant 100 % glycérol stérile ddH2O faire la solution de glycérol de 30 %.</li>
	<li>Congeler le résistant à la kanamycine e. coli O157 : H7 EDL933 bactéries porteuses de plasmide luciférase comme un stock bactérien dans un bouchon à vis cryovial comme un ratio de 1:1 de solution de glycérol bactéries culture et 30 % à-80 ° C. La concentration finale de glycérol est de 15 %.</li>
</ol>2. préparation de bactéries ECEH bioluminescente pour l’Inoculation par voie orale
NOTE : L’organigramme de la chronologie des procédures expérimentales pour la préparation de l’ECEH et gavage oral de souris est présentée dans la Figure 1 pour aider à la préparation expérimentale.
<ol><li>Bactéries strie e. coli O157 : H7 EDL933 hébergeant des plasmides de luciférase sur une gélose LB avec 50 kanamycine µg/mL de stock de-80 ° C. Cultiver les bactéries pendant 16-18 h à 37 ° C.</li>
	<li>Prélever une colonie unique sur la plaque pendant la nuit et de la culture dans un milieu 3 mL LB avec 50 kanamycine µg/mL pendant 16 à 18 h dans un incubateur à 37 ° C à 220 tr/mn.</li>
	<li>Repiquer les bactéries (dilution 1 : 100) en kanamycine (50 µg/mL) contenant le bouillon LB pour 2,5 à 3 h dans un incubateur à 37 ° C à 200 tr/min. (Par exemple, ajouter 2 mL cultivées pendant la nuit à 200 mL LB additionné à la kanamycine (50 µg/mL), les bactéries).</li>
	<li>Incuber les bactéries pour 2,5 à 3 h et mesurer la valeur de la densité optique à 600 nm (OD600) jusqu'à ce que la valeur est de 0,9 à 1. Le nombre de cellules bactériennes a atteint une densité d’environ 108 d’unités formant colonies (UFC) / mL.</li>
	<li>Centrifuger les bactéries re-cultivées à 8 000 x g pendant 30 min, 4 ° C.</li>
	<li>Éliminer le liquide surnageant sans agiter le culot de bactéries et laver le culot avec 100 mL de solution saline 0,9 % stérile normale par agitation douce.</li>
	<li>Répétez une fois les étapes 2.5 et 2.6.</li>
	<li>Après le lavage, centrifuger la culture bactérienne à 8 000 x g pendant 30 min, 4 ° C et éliminer le surnageant doucement.</li>
	<li>Le culot de condensat à 100 fois avec du sérum physiologique 0,9 %. Par exemple, si les bactéries de 200 mL sont centrifugés, ajouter physiologique de 2 mL pour suspendre le culot.</li>
	<li>Confirmer les bactéries UFC (il faut environ 109 UFC/100 μL après la condensation dans une solution saline normale) en ensemençant les bactéries concentrées à travers une dilution en série 10 fois25.</li>
</ol>3. souris Gavage Oral d’ECEH
<ol><li>Traiter les souris C57BL/6 femelles de 6 semaines avec de l’eau streptomycine (5 g/L) pendant 24 h.</li>
	<li>Après 24 h, passer à l’eau potable ordinaire pour un autre 24h avant le gavage. Après le traitement de l’eau ordinaire pendant 24 h, les souris sont prêts pour gavage oral d’ECEH.</li>
	<li>Remplir la seringue de 100 bactéries ECEH de μL en tirant sur le piston. N’assurer aucune bulle d’air dans la seringue. Enlever les bulles à faire claquer la seringue avec les doigts.</li>
	<li>Soulever l’animal doucement et placez-le sur le dessus de la cage avec soin.</li>
	<li>Saisir la souris par la queue avec soin, et l’animal sera prise au sommet de la cage et tenter de s’éloigner.</li>
	<li>Freiner doucement la souris en saisissant la peau du cou et le dos de l’animal avec le pouce et l’index pour empêcher le mouvement de la tête de la souris.</li>
	<li>Maintenez le pointeur de la souris en position verticale pour insérer l’aiguille de gavage et s’assurer que la tête de la souris est bien immobile et verticale.</li>
	<li>Insérer l’aiguille de gavage dans la bouche de la souris après le toit de la bouche et descendre dans le œsophage et vers l’estomac.</li>
	<li>Quand l’aiguille insérée est la moitié ou les deux-tiers longueur chez la souris, injecter 100 bactéries ECEH μL, qui contiennent environ 109 UFC cellules.</li>
</ol>4. visualisation
<ol><li>Après le gavage oral, détecter les signaux bioluminescents sur 1 à 2 jours.</li>
	<li>Avant d’examiner les signaux bioluminescentes des animaux, anesthésier les en les plaçant dans une chambre de 2,5 % isoflurane avec 1,5 L/min d’oxygène.</li>
	<li>Attendez 2 à 5 min jusqu'à ce que toutes les souris deviennent inconscient et le déplacement de l’arrêt. Les animaux sont prêts pour la détection in vivo de la bioluminescence.</li>
	<li>Détecter et image bioluminescentes signaux d’animaux par un in vivo système d’imagerie. Veuillez voir la Section 5 « D’Acquisition de données » pour le fonctionnement du logiciel. Au cours du processus d’imagerie, tous les animaux subissent un approvisionnement continu de 2,5 % isoflurane avec 1,5 L/min d’oxygène.<ol>
<li>Cliquez sur fichier > direct et manuellement, se concentrer sur la souris.</li>
		<li>Sélectionner l’intensité de l’exposition temps et laser.</li>
		<li>Cliquez sur acquérir > capturer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour l’imagerie ex vivo , euthanasier les souris par dislocation cervicale et retirez l’intestin entier des souris infectées. Placer les intestins dans une image et une boîte de Pétri à 9 cm in vivo système d’imagerie. Le réglage est le même que le in vivo l’imagerie sauf que le champ de vision est réglé comme A/B. Veuillez voir la Section 5 « D’Acquisition de données » pour plus de détails. Remarque : Méthode pour la dislocation cervicale : maîtriser les souris sur le dessus de la cage en saisissant la queue d’une main pour que les animaux saisir la cage. Placer un marqueur ou le pouce et l’index de l’autre main contre l’arrière du cou à la base du crâne. Poussez vers l’avant avec la main ou un objet tout en retenant la tête et tirer vers l’arrière avec la main qui tient la queue rapidement. Examinez pour confirmer un arrêt respiratoire et aucun battement de cœur.</li>
</ol>5. Acquisition de données
Remarque : Le logiciel utilisé pour l’acquisition de données est répertorié dans la Table des matières.
<ol><li>Pour l’acquisition de l’image, ouvrez le panneau de contrôle d’Acquisition du logiciel (Figure 2).</li>
	<li>« Luminescents », sélectionnez « photographie » et « Overlay ».</li>
	<li>Temps d’exposition défini comme « Auto ». La valeur Binning comme « Moyenne ».</li>
	<li>Néc ƒ/stop 1 luminescentes et 8 pour la photographie. Ƒ/stop contrôles de la quantité de lumière reçue par le détecteur de CCD.</li>
	<li>Définissez le champ de vision basée sur le champ des images qui présentent un intérêt à acquérir. Option « D » peut tenir cinq souris âgés de 6 semaines et leur image tout à la fois. « C » peut l’image trois souris âgés de 6 semaines dans un champ.</li>
	<li>Une fois que les souris/échantillons sont prêts pour l’imagerie, cliquez sur « Acquérir » pour l’acquisition d’images.</li>
	<li>Ouvrir les données d’image qui a été acquis.</li>
	<li>Ouvrez le panneau de la Palette d’outils (Figure 3).</li>
	<li>Sélectionnez Outils ROI. Nous vous recommandons le cercle (celui le plus à gauche) dans la plage de la région de bioluminescente sur images (Figure 4).</li>
	<li>Cliquez sur « Mesure ROIs » (icône représentant un crayon) pour mesurer l’intensité bioluminescente surface (Figure 3). Le panneau de retour sur investissement des mesures et les valeurs de quantification apparaissent (Figure 5).</li>
	<li>Utiliser la mesure de la configurer sur le coin gauche du panneau mesures de ROI pour sélectionner les valeurs/informations nécessaires (Figure 6), sinon cliquez sur « Exporter » pour exporter ce tableau de données et l’enregistrer comme fichier .csv (Figure 5).</li>
	<li>Utilisez les valeurs de la colonne « Flux Total (p/s) » comme la quantification bioluminescentes intensité dans le fichier .csv.</li>
</ol>

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<li>Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+%28EHEC%29+infection+and+hemolytic+uremic+syndrome+%28HUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS).</a> BMC Med. 10, (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il a été signalé que EHEC transformé avec plasmide de la luciférase a été utilisé pour examiner sa localisation en hôtes ou gene expression in vivo8,11,12. Le modèle murin démontré ici a aussi signalé pour détecter le moment de EHEC colonisé et la localisation dans hôte murine8. Néanmoins, nous fournissons le protocole en détail comment administrer l’inoculation à des souris ECEH par voie intraga...

EHEC O157 : H7 est un pathogène qui provoque la diarrhée1, HS2, HUS3et une insuffisance rénale aiguë même4 par contamination de l’eau ou de nourriture. EHEC est un enterobacterium pathogène et colonise dans le tube digestif de l’homme1. Lorsque EHEC a tout d’abord adhérer à l’épithélium intestinal hôte, ils injectent les facteurs de colonisation dans les cellules de l’hôte à travers le système de sécrétion type III (T3SS) qui fonctionne comme une seringue moléculaire induisant une fixation et effacement (A/E) lésion suite à appliquer adhérence (colonisation)5. Ces gènes impliqués dans la formation de lésions A/E sont codés par le locus de l’entérocyte effacement (LEE) pathogénicité île5.
Bioluminescence est une réaction chimique produisant de la lumière, dans laquelle luciférase catalyse la luciférine de substrat pour générer de la lumière visible6. Ce processus enzymatique nécessite souvent la présence d’oxygène ou de l’adénosine triphosphate (ATP)6. Bioluminescence imaging (BLI) permet aux chercheurs de la visualisation et la quantification des interactions hôte-pathogène dans les animaux vivants7. BLI peut caractériser le cycle d’infection bactérienne chez les animaux vivants en suivant les bactéries bioluminescentes comme ils migrent vers et envahissent les différents tissus7; Cela révèle une progression dynamique de l’infection. En outre, la charge bactérienne chez les animaux est liée à la bioluminescence signal8; Il est donc un indicateur commode pour estimer les conditions pathologiques des animaux d’expérimentation d’une manière simple et directe.
Le plasmide utilisé ici contenait l’opéron luciférase, luxCDABE, qui est de la bactérie Photorhabdus luminescens qui encode ses propres luciférase substrat7,9. En transformant ce plasmide exprimant luciférase en bactéries, les processus de colonisation et l’infection peuvent être surveillés en observant ces bactéries bioluminescentes animaux vivants. Dans l’ensemble, BLI et bactéries marquées bioluminescence permettent aux chercheurs de suivre le nombre de bactéries et de l’emplacement, la viabilité bactérienne avec des antibiotiques/thérapie de traitement et l’expression de gène bactérien infection/colonisation6, 7. on a signalé des nombreuses bactéries pathogènes qui expriment l’opéron luxCDABE d’examiner leur expression de cycle ou de gène d’infection dans l’infection. Ces bactéries, y compris des uropathogènes e. coli10à EHEC8,11,12,13, entéropathogène e. coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, et Vibrio cholerae20, ont été documentés.
Plusieurs modèles expérimentaux ont été développés pour faciliter l’étude des EHEC colonisation in vitro et in vivo21,22,23. Cependant, il y a un manque de modèles animaux appropriés pour étudier l’ECEH colonisation in vivoet ainsi une pénurie résultante de détails. Pour faciliter l’étude du EHEC colonisation mécanisme in vivo, il est utile de construire des modèles animaux pour observer et quantifier la colonisation d’ECEH dans les animaux vivants dans une méthode non invasive.
Ce manuscrit décrit un modèle de colonisation de souris-ECEH qui utilise un système exprimant bioluminescent pour surveiller la colonisation EHEC au fil du temps chez les hôtes vivants. Souris sont inoculées par voie intragastrique avec marqué bioluminescence EHEC et le signal de bioluminescent est détecté chez les souris avec un non invasif in vivo d’imagerie système13. Souris infectées avec marqué bioluminescence ECEH ont montré des signaux bioluminescentes significatives dans leur intestin après que 2 jours après l’infection, ce qui suggère que ces bactéries ont colonisé dans l’intestin de l’hôte après que 2 jours après l’infection. Données d’image ex vivo ont montré que cette colonisation est spécifiquement dans le caecum et le côlon des souris. En utilisant ce modèle de souris-ECEH, la colonisation de EHEC bioluminescente peut être détectée dans l’accueil de la vie par une in vivo d’imagerie système, afin d’étudier les mécanismes détaillés de la colonisation des bactéries entériques, qui peut favoriser une meilleure compréhension dans Changements physiologiques et pathologiques induits par ECEH.

<table><tbody><tr><td>Incubateur à agitateur</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>incubation de bactéries&nbsp ;</td></tr><tr><td>Incubateur à secousses orbitales</td><td>FIRSTEK</td><td>S300</td><td>incubation de bactéries&nbsp ;</td></tr><tr><td>pBSL180</td><td></td><td></td><td>source du gène nptII</td></tr><tr><td>pAKlux2</td><td></td><td></td><td>source de luxCDABE opéron</td></tr><tr><td>T& Un kit de clonage</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYC001-20P</td><td>à utiliser pour le clonage TA</td></tr><tr><td>Nsi I</td><td>NEB</td><td>R0127S</td><td>utilisation pour le clonage de plasmides&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>NEB</td><td>R0122S</td><td>utilisation pour le clonage de plasmides&nbsp ;</td></tr><tr><td>Spe I-HF</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td>utilisation pour le clonage de plasmides&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sma Je</td><td>Utilisation du NEB</td><td>R0141S</td><td>pour le clonage de plasmides&nbsp ;</td></tr>Utilisation de la <tr><td>T4 ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>pour le clonage de plasmides&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>utilisation pour l’amplification PCR</td></tr><tr><td>10X Ex Taq Buffer</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>utilisation pour l’amplification</td></tr><tr><td>PCR dNTP Mixture&nbsp ;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>utilisation pour l’amplification PCR</td></tr><tr><td>Machine PCR</td><td>appliquée Biosystem&nbsp ;</td><td>2720 Thermocycleur&nbsp ;</td><td>&nbsp ; pour l’amplification par PCR</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>SIGMA</td><td>G5516-1L</td><td>à utiliser pour la solution de stockage de bactéries</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434-5KG-R</td><td>produit chimique pour la fabrication du milieu LB, 10 g/L</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1612.00</td><td>Produit chimique pour la fabrication du milieu LB, 10 g/L</td></tr><tr><td>Poudre d’extrait de levure</td><td>Affymetrix</td><td>23547-1 KG</td><td>Produit chimique pour la fabrication du milieu LB, 5 g/L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1802.00</td><td>produit chimique pour la fabrication de la gélose LB</td></tr><tr><td>kanamycine&nbsp ;</td><td>Antibiotiques Sigma</td><td>K4000-5G</td><td>, à utiliser pour la séléciton</td></tr><tr><td>streptomycine&nbsp ;</td><td>Antibiotiques Sigma</td><td>S6501-100G</td><td>, éliminer le microbiote chez la souris</td></tr><tr><td>EDL933 cellule compétente</td><td>La méthode maison</td><td></td><td>est sur le document supplémentaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>MicroPulser</td><td></td><td>pour électroporation</td></tr><tr><td>Cuvettes d’électroporation</td><td>Gene Pulser/MicroPulser</td><td>1652086</td><td>pour électroporation</td></tr><tr><td>Centrifugeuse à grande vitesse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti, J-26S XP</td><td>utilisation pour la centrifugation des bactéries&nbsp ;</td></tr><tr><td>Rotor à angle fixe</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td>pour la centrifugation des bactéries&nbsp ;</td></tr><tr><td>Rotor à angle fixe</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA10.5</td><td>pour la centrifugation des bactéries&nbsp ;</td></tr><tr><td>bouteilles centrifuges</td><td>Beckman Coulter</td><td>REF357003</td><td>utilisation pour la centrifugation des bactéries&nbsp ;</td></tr><tr><td>bouteilles centrifuges</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>3141-0500</td><td>utilisation pour la centrifugation des bactéries&nbsp ;</td></tr><tr><td>Biophotomètre Eppendorf Plus&nbsp ;</td><td>eppendorf</td><td>AG 22331 hambourg</td><td>pour la mesure de la valeur OD600 des</td></tr><tr><td>souris C57BL/6</td><td>Blouse de laboratoire du Centre des animaux de laboratoire du NCKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, gants</td><td></td><td></td><td>pour la protection du personnel.</td></tr><tr><td>isoflurane&nbsp ;</td><td>Panion & BF Biotech Inc.</td><td>G-8669</td><td>pour anesthésie de souris,</td></tr><tr><td>seringue de 1 ml</td> de qualité pharmaceutique<td></td><td></td><td>utilisation pour le gavage oral de souris</td></tr><tr><td>Aiguille d’alimentation réutilisable à pointe sphérique de 22 G</td>&phi ;<td></td><td> 0,9 mm X L 50 mm</td><td>à utiliser pour le gavage oral de souris</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>utilisation pour l’expérience sur les souris</td></tr><tr><td>Système d’imagerie Xenogen IVIS 200</td> Spectre <td>Perkin Elmer</td><td>IVIS</td><td>utilisation pour la capture d’images bioluminescentes&nbsp ;</td></tr><tr><td>Logiciel d’image vivante</td><td>Perkin Elmer</td><td>version 4.1</td><td>à utiliser pour quantifier les données d’image</td></tr></tbody></table>

détection de la colonisation de escherichia coli entéro-hémorragique en hôte murin par système de bioluminescence non invasif in vivo

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Entérohémorragique Escherichia coli (EHEC) O157 : H7, qui est un agent pathogène d’origine alimentaire de cette causesdiarrhea, la colite hémorragique (HS), et de syndrome hémolytique et urémique (SHU), coloniser pour le tractus intestinal de l’homme. Pour étudier le mécanisme détaillé de EHEC colonisation in vivo, il est essentiel d’avoir des modèles animaux de surveiller et de quantifier la colonisation ECEH. Nous montrons ici un modèle de colonisation souris-ECEH en transformant le plasmide exprimant bioluminescent à EHEC de surveiller et de quantifier la colonisation ECEH chez les hôtes de la vie. Animaux inoculés avec marqué bioluminescence EHEC affichent des signaux bioluminescentes intenses chez les souris par détection avec un non invasif en vivo système d’imagerie. Après que 1 à 2 jours après l’infection, signaux bioluminescentes pourraient toujours être détectés chez les animaux infectés, ce qui suggère que les EHEC colonisent en hôtes pendant au moins 2 jours. Nous démontrons également que ces EHEC bioluminescentes localiser à l’intestin de souris, plus précisément dans le caecum et le côlon, des images ex vivo . Ce modèle de colonisation souris-EHEC peut servir d’outil pour faire avancer les connaissances actuelles sur le mécanisme de colonisation ECEH.

Que nous administrons marqué bioluminescence EHEC (~ 109 cellules bactériennes) à des souris C57BL/6 femelles 6 - anciennes semaine par gavage. Après l’inoculation par voie orale d’ECEH chez la souris à 1 h, les animaux ont été examinés pour signal de bioluminescence par le système d’imagerie in vivo comme illustré à la Figure 7. Les résultats ont montré un signal fort de bioluminescent chez des souris de gavage avec marqué bioluminescence...

Un protocole détaillé d’un modèle de souris pour entérohémorragique Escherichia coli (EHEC) colonisation en utilisant des bactéries marquées bioluminescence est présenté. La détection de ces bactéries bioluminescentes par un non invasif in vivo d’imagerie système animaux vivants peut avancer notre compréhension actuelle de la colonisation de l’ECEH.

Détection de la colonisation de Escherichia Coli entéro-hémorragique en hôte murin par système de Bioluminescence Non invasif In Vivo

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

L'objectif général de cette expérience est de détecter la colonisation par Escherichia coli entérohémorragique chez la souris à l'aide d'un système d'imagerie non invasif in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathogénicité de E. coli entérohémorragique, telles que la colonisation. Le principal avantage de cette technique est que la colonisation par EHEC peut être détectée chez l'animal vivant sans qu'il soit nécessaire de sacrifier l'animal.Pour commencer, étaler une souche d’E. coli O157:H7 EDL933 conservée à −80 °C et portant un plasmide luciférase sur une gélose LB contenant 50 microgrammes par millilitre de kanamycine. Faire croître les bactéries pendant 16 à 18 heures à 37 °C. Prélever une colonie isolée depuis la plaque précédente et l’ensemencer dans 3 millilitres de milieu LB contenant 50 microgrammes par millilitre de kanamycine.Ensuite, incuber la culture à 37 °C et 220 tr/min pendant 16 à 18 heures. Le jour suivant, préparer deux millilitres d'une dilution au 1/100 de la culture de nuit et l'ensemencer dans 200 millilitres de milieu LB contenant du kanamycine. Incuber la culture à 37 °C et 200 tr/min pendant 2,5 à 3 heures ou jusqu'à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne une valeur comprise entre 0,9 et 1.Ensuite, centrifuger les bactéries recultivées à 8000 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Jeter le surnageant sans perturber le culot et laver les bactéries avec 100 millilitres de solution saline normale stérile à 0,9 % par agitation douce. Après le lavage, centrifuger à nouveau la culture bactérienne et jeter délicatement le surnageant.Ensuite, utilisez une solution saline normale stérile à 0,9 % pour concentrer le culot 100 fois. Après avoir traité les souris avec de l'eau contenant de la streptomycine pendant 24 heures selon le protocole décrit dans le texte, remplissez une seringue avec 100 microlitres de bactéries EHEC. Soulevez délicatement l'animal et placez-le avec précaution sur le dessus de la cage.Ensuite, saisissez délicatement la souris par la queue de manière à ce que l'animal s'accroche au dessus de la cage et tente de s'échapper. Immobilisez doucement la souris en utilisant le pouce et l'index pour prendre la peau souple du cou et du dos de l'animal afin d'empêcher la tête de bouger. Puis, maintenez la souris en position verticale et assurez-vous que la tête de la souris reste immobilisée dans cette position.Insérez l'aiguille d'administration intragastrique dans la bouche de l'animal en suivant le palais et faites-la descendre dans l'œsophage en direction de l'estomac. Lorsque l'aiguille insérée est enfoncée à moitié ou aux deux tiers du trajet chez la souris, injectez les 100 microlitres de bactéries EHEC contenant environ 10 puissance 9 UFC de cellules. Après avoir visualisé les cellules bioluminescentes conformément au protocole décrit dans le texte, ouvrez le panneau de contrôle d'acquisition du logiciel.Sélectionnez luminescent, photographier et superposition. Réglez le temps d'exposition sur automatique. Ensuite, réglez le binning sur moyen.Régler le diaphragme à une ouverture de un pour la luminescence et de huit pour la photographie. Le diaphragme contrôle la quantité de lumière reçue par le détecteur CCD. Une fois les échantillons de souris prêts pour l'acquisition d'images, cliquer sur acquérir pour démarrer la prise de vue.Ouvrez les données d'image acquises, puis ouvrez le panneau de la palette d'outils. Sélectionnez les outils de région d'intérêt (ROI), tels que le cercle, pour définir la zone bioluminescente sur les images. Ensuite, à l'aide de l'icône de crayon, cliquez sur Mesurer les ROI afin de mesurer l'intensité de la bioluminescence de surface.Le panneau de mesure des régions d’intérêt (ROI) et les valeurs de quantification apparaîtront. Ensuite, dans le coin gauche du panneau des mesures de ROI, utilisez l’option « Configurer la mesure » pour sélectionner les valeurs ou informations nécessaires. Sinon, cliquez sur « Exporter » pour exporter ce tableau de données et l’enregistrer au format fichier csv.Enfin, utilisez les valeurs de la colonne flux total p/s comme quantification de l'intensité de la bioluminescence dans le fichier csv. Comme le montre cette image, un signal de bioluminescence intense a été observé chez les souris exposées à une gavage oral avec une inoculation d'EHEC marquée par bioluminescence. Sur cette figure, les souris infectées avec l'EHEC sauvage EDL933 marqué par bioluminescence ont présenté des signaux bioluminescents intenses dès deux jours après l'infection, suggérant que l'EHEC s'était installé chez les hôtes en moins de deux jours.Cependant, les souris infectées par une souche mutante d'E.coli présentant des défauts dans les lipopolysaccharides n'affichent aucune bioluminescence, ce qui suggère qu'un nombre réduit, voire aucun, de bactéries a colonisé ces souris. Afin de localiser les bactéries marquées par bioluminescence, les intestins des animaux sacrifiés ont été analysés ex vivo. Les organes provenant de souris infectées par l'EHEC marqué par bioluminescence présentaient un signal bioluminescent significatif dans le caecum et le colon, indiquant une colonisation de ces organes.En revanche, les souris infectées par un mutant LPS ont montré une bioluminescence réduite dans le tissu intestinal, ce qui est conforme à l'image in vivo. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de réaliser l'expérience en utilisant le système IV pour surveiller la colonisation par l'EHEC chez la souris.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Méthodes pour l'imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez les animaux vivants sont décrits. Les agents pathogènes sont modifiées pour exprimer la luciférase permettant d'imagerie optique du corps entier des infections chez les animaux vivants. Les modèles animaux peuvent être infectés par des pathogènes exprimer la luciférase et le cours résultant de la maladie de visualiser en temps réel par imagerie par bioluminescence.

En utilisant la luciférase aux infections bactériennes chez les souris image

Bioluminescent imagerie bactérienne<em&gt; In Vivo</em

Source : Valentine, M. E., et al. Génération de mutants de délétion de gène dans le cadre chez Pseudomonas aeruginosa et test d’atténuation de la virulence dans un modèle murin simple d’infection. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo démontre l’utilisation de la bioluminescence pour visualiser et comparer le comportement in vivo de souches bactériennes virulentes et atténuées chez la souris. Il décrit la préparation de suspensions bactériennes bioluminescentes et leur injection intrapéritonéale chez...

Suivi de la dynamique d’infection bactérienne chez une souris à l’aide de la bioluminescence

Source : Kuo, C., et al. Détection de la colonisation entérohémorragique d’Escherichia coli chez l’hôte murin par un système de bioluminescence in vivo non invasif. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo montre la préparation d’une suspension entérohémorragique d’Escherichia coli exprimant la luciférase à partir de stocks congelés pour une utilisation comme inoculum oral dans des modèles animaux. Cela permet un suivi bioluminescent en temps réel de la colonisation intestinale pendant les études...

Préparation de l’inoculum bioluminescent entérohémorragique d’Escherichia coli

Source : de Vries, C. R., et al., Un modèle d’inoculation retardée de l’infection chronique de la plaie par Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Cette vidéo présente une technique d’imagerie bioluminescente pour surveiller la progression de l’infection bactérienne dans un modèle murin vivant. Des bactéries pathogènes conçues avec le système rapporteur luxABCDE émettent de la lumière au site d’infection, permettant la visualisation des bactéries métaboliquement actives. En imageant la...

Imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez la souris

Source : Seman, B. G., et al. Un modèle d’imagerie néonatale de septicémie bactérienne à Gram négatif. J. Vis. Exp. (2020)La vidéo présente un modèle murin néonatal pour étudier l’infection systémique à l’aide de bactéries bioluminescentes encapsulées. Les nouveau-nés sont injectés avec des suspensions bactériennes à forte ou faible dose et sont renvoyés à leur mère pour des soins postnataux. Les bactéries encapsulées échappent à la détection immunitaire précoce, se propagent systémiquement et...

Modéliser l’infection chez les souris néonatales à l’aide de bactéries bioluminescentes encapsulées

Source : Valentine, M. E., et al., Génération de mutants de délétion génique dans le cadre chez Pseudomonas aeruginosa et test de l’atténuation de la virulence dans un modèle simple d’infection chez la souris. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo démontre l’utilisation d’une approche d’imagerie basée sur la bioluminescence pour surveiller l’infection bactérienne dans un modèle murin vivant. L’imagerie séquentielle bioluminescente et par rayons X permet la visualisation en temps réel et la...

Imagerie en temps réel de l’infection bactérienne dans un modèle murin utilisant la bioluminescence

Source : Luyts, N., et al. Suivi longitudinal des infections urinaires et leur traitement chez la souris par imagerie bioluminescente. J. Vis. Exp. (2021).Cette vidéo montre l’induction et le suivi de l’infection des voies urinaires dans un modèle murin utilisant l’E. coli bioluminescente injectée dans la vessie, où se produisent l’adhésion, l’invasion et la réplication intracellulaire bactérienne. La lumière émise par l’opéron bioluminescent sert de marqueur en temps réel de la charge...

Visualisation de l’infection des voies urinaires dans un modèle murin utilisant la bioluminescence

Imagerie multi-modalité est une approche intéressante pour l'étude de la colonisation bactérienne dans les petits modèles animaux. Ce protocole décrit l'infection de souris avec...

4D imagerie multimodalité des<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infections chez les souris

Ce manuscrit décrit l’administration intravésicale de bactéries uropathogènes avec un opéron lux pour induire une infection des voies urinaires chez la souris et l’analyse longitudinale in vivo ultérieure de la charge bactérienne à l’aide de l’imagerie par bioluminescence.

Suivi longitudinal des infections des voies urinaires et leur traitement chez la souris à l’aide de l’imagerie par bioluminescence

La naissance prématurée (accouchement &lt; 37 semaines) est un problème de santé mondial urgent, avec des options de prévention et de traitement sous-optimales. Nous présentons un modèle murin d’accouchement prématuré induit par une infection bactérienne vaginale ascendante et décrivons comment analyser la morbidité et la mortalité néonatales qui en résultent.

Modélisation de l’infection vaginale ascendante, de l’accouchement prématuré et de la morbidité néonatale chez la souris

Découvrez la détection de la colonisation d'EHEC chez la souris par imagerie de bioluminescence non invasive in vivo. Cette méthode permet de suivre la présence bactérienne en temps réel sans sacrifice animal.

Détection de la colonisation de Escherichia Coli entéro-hémorragique en hôte murin par système de Bioluminescence Non invasif In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal

Détection de la colonisation de Escherichia Coli entéro-hémorragique en hôte murin par système de Bioluminescence Non invasif In Vivo

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