In Vivo Imagerie multimodale et analyse du modèle de néovascularisation choroïdienne souris induite par Laser

Nous présentons ici l’utilité de longitudinal en vivo imagerie dans le suivi des modifications morphologiques de la néovascularisation choroïdienne induite par laser chez les souris.

Les processus néovasculaires sont une caractéristique de plusieurs pathologies oculaires courantes. Plus particulièrement, la dégénérescence maculaire liée à l’âge exsudative ou DMLA humide pour la rétinopathie diabétique courte et proliférative et la rétinopathie du prématuré. Ensemble, ces troubles représentent la plupart des cas de cécité légale dans le monde et sont associés à des complications oculaires supplémentaires, telles que l’hémorragie vitrée et le glaucome néovasculaire.

Cependant, malgré leur prévalence, les options thérapeutiques pour les troubles néovasculaires oculaires sont limitées. La norme de soins actuelle pour la néovascularisation associée à la DMLA et à la rétinopathie diabétique proliférative est l’injection intravitréenne d’anticorps humanisés dirigés contre un médiateur critique de l’angiogenèse et de la néovascularisation, le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire ou VEGF. Cependant, malgré leur efficacité à stopper la progression de la maladie et à améliorer la vision fonctionnelle, les injections intravitréennes sont coûteuses et loin d’être sans risque.

Les complications peuvent inclure des infections, une endophtalmie, un décollement de la rétine et une hémorragie oculaire. Par conséquent, il est urgent de développer de nouvelles options de traitement efficaces, sûres et moins coûteuses. Afin de faire progresser le développement de médicaments pour les troubles néovasculaires, les modèles de petits animaux sont d’une importance cruciale.

De tels modèles doivent être reproductibles, avoir des lectures et des critères d’évaluation établis et validés, et idéalement utiliser un composé de référence cliniquement pertinent pour servir de contrôle positif. Dans ce protocole, nous présenterons le modèle de néovascularisation choroïdienne de souris, ou CNV, qui est l’un des modèles les plus couramment utilisés pour l’étude des mécanismes physiopathologiques contribuant à la CNV et le développement de nouveaux agents anti-néovasculaires. Dans le modèle CNV, la membrane de Bruch est rompue à l’aide d’un laser à argon.

Initiant ainsi des processus néovasculaires provenant de la choroïde. L’utilisation de l’imagerie longitudinale in vivo par tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral, ou SD-OCT en abrégé, et de l’angiographie à la fluorescéine, permet de suivre la prolifération et la régression de la CNV. Et ainsi, d’évaluer l’efficacité et le déroulement des nouvelles interventions pharmaceutiques.

Les progrès récents dans le traitement d’images permettent en outre la segmentation automatisée pour la mesure de l’épaisseur rétinienne, fournissant une méthodologie exempte de biais de l’investigateur pour évaluer la présence d’œdème. Nous allons discuter ici de l’utilité du nouveau logiciel InVivoVue Diver de Leica Microsystems pour la segmentation automatisée des couches rétiniennes dans le modèle CNV de souris. Enfin, nous discuterons de la manière dont l’analyse histologique de montages rétiniens entiers peut compléter l’imagerie longitudinale in vivo dans ce modèle.

Une seule goutte de tropicamide est appliquée sur chaque œil pour la dilatation pupillaire. Par la suite, l’animal est placé doucement dans l’étape d’alignement des rongeurs. La souris est ajustée pour exposer l’œil et sécurisée à l’aide du support nasal et d’un morceau de ruban adhésif de laboratoire placé doucement sur le dos.

Ensuite, une goutte de lubrifiant est appliquée sur l’œil pour hydrater, et tout excès de liquide est soigneusement éliminé à l’aide d’écouvillons en papier filtre. Enfin, la platine est alignée devant l’appareil OCT pour l’imagerie OCT de base. L’imagerie par tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral in vivo est réalisée au départ, avant l’application du laser, afin de vérifier l’absence de toute anomalie rétinienne.

Retirez délicatement la souris du support. Placez une goutte de gel Viscotears sur une lamelle pour applaner la cornée. Orientez la souris avec la tête du nerf optique au centre et concentrez le faisceau laser sur l’épithélium pigmentaire rétinien.

Effectuez trois tirs laser en évitant les vaisseaux sanguins rétiniens aux positions quatre, huit et 12 heures autour du nerf optique. Inspectez la fermeté de l’œil après tous les tirs au laser pour s’assurer de l’absence de tout saignement rétinien. Comme précédemment, alignez la souris dans le support et effectuez une angiographie à la fluorescéine et une imagerie OCT pour confirmer les dommages à la membrane de Bruch.

Pour l’angiographie à la fluorescéine, concentrez-vous d’abord sur les zones de brûlure laser en utilisant le mode de réflectance infrarouge, qui permet de visualiser les sites où le laser a été administré. Injectez soigneusement 0,1 millilitre de sel de fluorescéine sodique à 5 %, pour environ 20 grammes de poids corporel de souris sans changer la position des yeux de souris. Commencer à prendre des images d’angiographie à la fluorescéine au niveau de la choroïde et au niveau de la rétine, environ toutes les 30 secondes.

Alignez l’œil pour l’imagerie OCT comme précédemment et commencez l’imagerie. La moyenne du signal SD-OCT permet de mieux visualiser la morphologie rétinienne détaillée, comme le montre cette séquence. Une fois l’imagerie SD-OCT effectuée, retirez délicatement la souris de son support.

Appliquez du lubrifiant pour les deux yeux. À ce stade, vous pouvez choisir d’inverser l’anesthésie par injection sous-cutanée de l’antagoniste alpha-2 de la médétomidine, de l’atipamézole ou d’attendre que l’animal se rétablisse de l’anesthésie. Répéter l’imagerie in vivo SD-OCT et AF chez les animaux anesthésiés aux jours cinq, 10 et 14 du suivi.

Utilisez la fonction de segmentation automatisée du logiciel InVivoVue Diver pour les mesures de l’épaisseur rétinienne. Pour la rétine saine, l’épaisseur totale de la rétine est considérée comme l’épaisseur de toutes les couches, de la couche de fibres nerveuses à l’EPR. Dans la rétine saine, la segmentation automatisée peut détecter avec précision les couches individuelles de la rétine, comme on peut le voir dans cet exemple.

Il convient de noter que dans les endroits où la CNV est présente, la mesure manuelle de l’épaisseur de la rétine doit être effectuée pour chaque site de lésion de la CNV séparément. De la couche de fibres nerveuses à une ligne imaginaire passant par la couche EPR. Cette séquence montre le flux de travail pour les mesures manuelles de l’épaisseur sur les sites où des lésions CNV sont présentes.

La couche de fibres nerveuses est située en haut, la choroïde en bas de l’image. À l’aide de la souris ou du pavé tactile, les limites de la couche de fibres nerveuses et de la choroïde sont déterminées manuellement, et le logiciel calcule automatiquement l’épaisseur totale de la rétine en fonction de ces coordonnées. Cette figure montre des images en série prises toutes les 20 secondes au niveau choroïdien.

La première image a été acquise en mode réflectance infrarouge. Alors que les autres, après injection intrapéritonéale de fluorescéine. Les flèches blanches de l’image pointent vers des sites laserés, qui montrent une fuite de fluorescéine à des moments ultérieurs, mis en évidence par les flèches blanches de l’image 18.

Cette image montre l’imagerie en série des FA acquise au niveau rétinien. La flèche blanche de l’image 18 pointe vers un site laser, qui montre que la fuite de fluorescéine apparaît plus rapidement que les deux autres, délimités par des cercles sur l’image 18. Cette figure récapitulative montre l’évolution temporelle des images SD-OCT.

Au départ, immédiatement après l’analyse au laser, et aux points de suivi les jours cinq, 10 et 14. En résumé, le protocole d’imagerie longitudinale in vivo des lésions CNV à l’aide de l’imagerie SD-OCT et FA permet une classification rapide, multimodale et fiable de la pathologie CNV et de la présence d’œdème rétinien. Nous vous remercions de votre intérêt.