Name: Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Découvrez la dissection et l'immunofluorescence du cerveau adulte de Drosophila melanogaster pour étudier les neurones des corps pedonculeux et des photorécepteurs. Cette méthode permet d'analyser la morphologie neuronale et la connectivité synaptique.

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Nous tenons à remercier Changhui Pak et Alysia Vrailas Mortimer pour initialement enseigner SMK la technique de dissection du cerveau. Nous remercions également les membres du groupe de laboratoire de Ken Moberg, en particulier les tours de Chris, pour la lecture critique du manuscrit. Anticorps reconnaissant Fas2 (1, 4) et chaoptin (24B10) ont été extraites de la Banque d’hybridome études du développement. Anticorps 24B10 a été déposé à la DSHB par Seymour Benzer et Nansi Colley24,60,61, anticorps 1 4 a été déposé à la DSHB par Corey Goodman 22,23,56. Stocks de mouches ont été obtenues depuis le centre de Stock de Bloomington. Nous tenons également à remercier l’Ohio Agricultural Research et Development Center (OARDC) MCIC Imaging Center pour l’utilisation du microscope confocal à l’image du cerveau dans la Figure 4 a et B. SMK est soutenu par une subvention du NICHD (1 R15 HD084241-01 a 1).

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

La méthode de dissection et visualisation décrite ci-dessus peut être utilisée dans une grande variété d’immunomarquage et vivre des applications d’imagerie. Nous ont esquissé un protocole général immunostaining et ont mis en évidence dans lequel MARCM peut être utilisé pour visualiser la morphologie axone des neurones individuels du corps aux champignons. En outre, ces procédures générales peuvent également être utilisés pour l’imagerie des autres régions du cerveau en fixe ou adulte fraîchement disséqué brains48,65. L’imagerie Live peut fournir une approche plus efficace lors de l’analyse des profils d’expression des pièges d’enhancer, gènes rapporteurs ou imitateur lignes66, par exemple. Pour prévenir la capture d’artefacts de la mort cellulaire en imagerie live de GFP dans les tissus non fixées, cerveau doit être disséqué en 1 x Saline tamponnée au Phosphate (PBS) ou HL3 médias48, montés sur des glissières de pont en 1 x PBS (ou HL3) et imagés dans moins de 15-20 min de soins devraient également être prises pour éliminer autant trachée possible du cerveau disséqué avant l’imagerie, puisqu’il peut interférer avec la visualisation de la fluorescence de la GFP.
Alors que les conditions de coloration pour l’évaluation de la morphologie des champignons neurones corps et photorécepteurs sont relativement bien établi24,61,67, la localisation d’une protéine spécifique d’intérêt dans ces cellules types peuvent exiger une vaste dépannage et optimisation. En particulier, plusieurs étapes critiques, y compris la dilution des anticorps, concentration de l’élément tampon bloquant et fixation, doivent être optimisés pour générer des résultats plus fiables et reproductibles. Tout d’abord, la concentration optimale d’anticorps primaire doit être déterminée. Bien que les anticorps disponibles dans le commerce ont souvent une dilution suggérée (et souvent au départ, nous commençons à l’aide de cette concentration), ces valeurs sont rarement déterminées empiriquement sur des tissus de drosophile . Par conséquent, à l’essai une série de dilutions de l’anticorps primaire qui gamme au-dessus et au-dessous de suggestion de départ du fabricant souvent se traduit par une coloration plus spécifiques. Alors que la dilution de l’anticorps primaire peut avoir un effet significatif sur la coloration de précision et doit être déterminée avec précision, les cerveaux de temps sont incubés dans l’anticorps primaire contenant les solutions peuvent varier considérablement avec peu d’effet sur le résultat global. Par exemple, nous avons observé des résultats similaires lors de l’incubation disséqué de cerveau avec l’anticorps primaire d’anticorps Fas2 pour deux, trois ou même quatre jours à 4 ° C. Bien que nous recommandions d’au moins deux nuits, nous avons également incubés cerveaux dans la solution d’anticorps primaire pour une seule nuit et obtenu une coloration reproductible. Ce qui est important, limitant la quantité de temps de cerveaux est incubés dans l’anticorps secondaire à 3 h à température ambiante (ou une nuit à 4 ° C) aide limite non-spécifiques d’anticorps secondaires aux tissus du cerveau.
En second lieu, il peut être nécessaire d’utiliser des réactifs de « blocage » supplémentaires afin d’éliminer le signal de fond indésirables. Options consistent à accroître la concentration de NGS à environ 10 %, en ajoutant 1 à 10 % Bovine Serum Albumin (BSA) au blocage ou primaire/secondaire solutions d’anticorps ou adsorption préalable des anticorps primaires pendant la nuit à 4 ° C avec des embryons de drosophile (voir référence68, section 2.9, étape 3).
Alors que nous avons écrit le protocole ci-dessus en utilisant PTN comme tampon suggérée pour la fixation de tous, lavage et les étapes d’incubation anticorps, fixation du tissu dans les autres tampons (par exemple, PLP et PEM, répertoriées dans le Tableau des matériaux) peut entraîner des différences profondes dans force du signal. Par exemple, des études antérieures ont démontré que la cycline E est indétectable dans les disques imaginaux larvaires quand les tissus sont fixés à traditionnel 4 % paraformaldéhyde, dilué dans du PBS, mais est bien visible lorsque les tissus sont fixés dans un tampon PLP (Ken Moberg, personnels communication et référence69). En plus des modifications dans la mémoire tampon composants, modifier l’heure et la température pour la fixation du tissu peut affecter aussi significativement par immunofluorescence souillant et peut être déterminées empiriquement si nécessaire. En règle générale, temps de fixation doit être suffisamment long pour permettre une réticulation suffisante des composants cellulaires, et le maintien à long terme de la morphologie cellulaire dans l’ensemble tout en étant limité assez pour l’empêcher de trop-réticulation et « enterrer » des épitopes des protéines. Par conséquent, quand initialement optimisation des conditions de coloration pour un anticorps primaire nouvellement acquise, nous généralement limiter le temps de fixation à environ 20 min et fixera souvent des tissus à des températures plus froides.
Plusieurs contrôles devraient figurer dans toute expérience d’immunofluorescence pour étudier la spécificité des anticorps primaires et secondaires ainsi que l’effet des transgènes/génétique sur le phénotype observé. Pour vérifier si l’anticorps primaire utilisé spécifiquement reconnaît la protéine d’intérêt, tissu de mouches manque cette protéine et/ou tissus surexprimant la protéine devrait figurer comme témoins. L’ajout de protéine purifiée excès peut également être incluse pour déterminer si l’anticorps primaire reconnaît autres épitopes dans le cerveau de mouche. Enfin, n’importe quel signal fluorescent présent lorsque les anticorps primaires sont omises représente le niveau de liaisons non spécifiques par les anticorps secondaires sélectionnés.
Plusieurs commandes importantes devraient également figurer afin d’évaluer la contribution du bagage génétique ou la présence de transgènes à intensité de coloration ou de la morphologie neuronale. Par exemple, les mouches utilisées pour l’expérience MARCM dans la Figure 5 contient plusieurs transgènes (hsFLP, SAMU-CD8-GFP, FRT82B, cuve &#62; GAL80 et OK107-GAL4), chacune d'entre elles doit être analysée séparément pour les effets sur la morphologie du corps aux champignons. À une morphologie corps très minimale, champignon des mouches contenant OK107-GAL4 et SAMU-CD8-GFP doit être analysée. Il peut également être nécessaire d’évaluer l’effet du choc thermique et production recombinase Flp sur le développement de champignons corps en analysant les mouches contenant hsFLP et FRT82B. Bien que MARCM peut fournir la perspicacité significative dans la question de savoir si une protéine donnée contrôle autonome guidage axonal, le nombre de contrôles devra effectuer avec précision cette conclusion peut être une limitation mineure de cette technique. Dans les expériences moins compliquées, contrôles similaires sont également applicables. Par exemple, prenons une expérience où le système de GAL4/UAS est utilisé en combinaison avec un transgène ARNi à coup de masse expression d’une protéine d’intérêt dans tous les neurones. Dans cette expérience, au moins deux transgènes seront présents : un pilote de GAL4 pan-neuronale, comme Elav-GAL4 et le transgène SAMU-Arni . La morphologie des neurones corps aux champignons chez les mouches contenant chacune de ces transgènes seuls devrait être étudiée en plus de la condition expérimentale où les mouches abritent les deux transgènes chez la mouche même.
Enfin, pour déterminer si la protéine d’intérêt est exprimée dans les neurones du corps aux champignons c’est généralement nécessaire de cerveaux co tache avec anticorps anti-Fas2. Par ailleurs, des protéines fluorescentes comme GFP, DP ou la membrane liée CD8-GFP peuvent aussi être exprimées en utilisant le système de GAL4/UAS et utilisé en combinaison avec des anticorps reconnaissant la protéine d’intérêt. Car Fas2 ne reconnaît que les axones fasciculées qui forment les lobes α et β du corps aux champignons, l’utilisation de GAL4 axée sur la, membranaires CD8-GFP a été particulièrement utile pour le marquage des neurones corps aux champignons.
Défauts dans le guidage axonal ne sont souvent pas 100 % ressuage et même cerveau de même génotype peut montrer une variabilité. Par conséquent, lors de l’analyse nouvellement généré des allèles mutants pour déceler les défauts dans corps du champignon ou pathfinding photorécepteur, une combinaison d’allèles différents et des approches devrait être utilisée. La plupart des études dans la littérature utilisent plusieurs approches différentes pour étudier si une protéine joue un rôle autonome cellule dans le contrôle de guidage axonal : J’ai) analyse de pathfinding défauts chez les homozygotes mouches null (préférence en utilisant les différent nuallèles ll), ii) analyse de pathfinding défauts chez les mouches manque la protéine d’intérêt que dans les neurones (généralement par l’intermédiaire d’Arni), iii) analyse MARCM des défauts de pathfinding et iv) expériences où le gène est ré-exprimé dans les neurones null homozygotes de sauvetage mouches. Idéalement, plusieurs douzaines cerveaux par génotype devrait être analysés pour déceler les défauts dans la morphologie neuronale.
Bien que le protocole décrit ici est principalement axé sur la localisation par immunofluorescence des protéines dans le tissu fixe, plusieurs futures applications de cette technique sont développées aux tissus du cerveau live image. Une fois que les cerveaux est disséqués (généralement dans les milieux de culture cellulaire), ils peuvent être ensuite cultivées pendant plusieurs jours à 25 ° C. Ces méthodes de culture ex vivo sont développés afin d’enquêter sur une grande variété de processus biologiques, tels que l’activité de la protéine qui favorise la régénération axonale après blessure70,71, intracellulaire signalisation dynamique72et73de la développement neuronal.

Bien que le système nerveux de drosophile est inférieur à celle des humains et des rongeurs, sa complexité fournit un modèle puissant, facile d’approche pour mieux comprendre ses homologues vertébrés. Dans de nombreux cas, les génomes de vertébrés et mouches codent des protéines très similaires qui régissent les mécanismes de développement du système nerveux. En fait, plusieurs des gènes requis pour développement neuronal chez les vertébrés ont orthologues chez les mouches, y compris ceux impliqués dans les voies de signalisation qui contrôle patterning, neurogenèse et guidage axonal1,2,3 ,4,5. Par exemple, la nétrine est un ligand requis pour guidage axonal chez les mammifères et de d. melanogaster6,7,8. Tandis que la nétrine a été isolé à l’origine d’embryon de poulet de tissu du cerveau6, des études ultérieures ont révélé que la nétrine joue un rôle conservé au cours du développement du système nerveux central embryonnaire (CNS) dans drosophile8. Autres études ont utilisé des écrans génétiques dans l' embryon Drosophila CNS pour identifier des ligands conservées et récepteurs requis pour l’axonal dans drosophile et vertébrés9.
Alors que la mouche embryonnaire CNS a été largement utilisée dans le passé pour identifier les ligands des récepteurs et les protéines de signalisation intracellulaires requis pour guidage axonal8,9, travaux récents a étudié la façon dont beaucoup de ces protéines contrôlent aussi les décisions de pathfinding lors des étapes ultérieures du développement. Plus précisément, enquête du corps aux champignons (MB) et le développement de neurone photorécepteur rétinien (Figure 1) a fourni les mécanismes que pathfinding de contrôle, la formation des synapses, élagage axone et plusieurs autres aspects de neuronale développement10,11,12,13,14,15,16,17. Les neurones photorécepteurs connectent la rétine mouche aux régions du cerveau adulte appelée limbe et médullaire et crucial pour relayer l’information visuelle vers le cerveau (évaluée par18,19), tandis que les neurones corps champignons sont centralement situé dans le cerveau de mouche et sont nécessaires pour l’apprentissage et la mémoire de20,21. Les neurones photorécepteurs et les neurones intrinsèques des organes aux champignons, appelées cellules de Kenyon, utilisent des mécanismes évolutionnaires conservées guidage axonal diffusible et dépendante du contact pour trouver leurs cibles post-synaptiques. En plus d’être visible dans les mouches adultes, photorécepteur et MB neurones peuvent également être directement visualisées dans les larves et les nymphes avec anticorps ou journaliste gènes22,23,24,25. La possibilité de visualiser facilement ces deux ensembles de neurones à différents moments du développement a favorisé leur utilisation comme superbes modèles pour de nombreux aspects du développement neuronal.
Outre son utilisation comme un modèle pour comprendre les mécanismes du développement normal du système nerveux, des études récentes ont démontré que les mouches peuvent aussi servir de modèles précis d’une grande variété de maladies humaines, y compris le Syndrome Fragile de X (FXS)26 , La déficience intellectuelle (ID)27,28,29,30,31, etc.32. Par exemple, pour étudier la fonction moléculaire des ZC3H14, un gène récemment lié à la déficience intellectuelle humaine, nous créé un modèle de mouche d’ID à l’aide d’un allèle nul de la mouche ZC3H14 orthologues, appelée Nab2,30. Mouches manque Nab2 ont des troubles de mémoire grave et prolongé la queue poly (a), récapitulant ce qui est observé chez des patients humains ou patient dérivé cellule lignes33,34. Ce qui est important, mouches manque Nab2 également affichent cérébrales graves défauts de morphologie dans leurs organes de champignons adultes34, semblable à ce qui est observé chez les mouches dépourvues du gène du syndrome FXS, FMR135. Ainsi, mouches peuvent servir comme un organisme modèle important d’étudier les développement normal du cerveau et les maladies qui perturbent l’il.
Enfin, l’accessibilité des méthodes à haut débit pour surveiller le comportement, associé avec la vaste gamme d’outils génétiques disponibles, faire drosophile , un organisme modèle de choix pour identifier les régions du cerveau qui contrôlent les comportements complexes, tels que apprentissage et mémoire, le sommeil, la parade nuptiale, soif et autres36,37,38,,39. Un outil particulièrement utile qui est au centre de « boîte à outils » une mouche généticien est le système de GAL4/UAS (Figure 2). Ce système40,41 utilise expression spécifique des tissus de l’activateur de la transcription Gal4 afin d’augmenter l’expression des gènes ou des transgènes en aval d’une séquence d’activant en amont (UAS). Modifications de ce système ont permis aux chercheurs de, par exemple, de contrôler avec précision l’excitabilité des neurones spécifiques42,43, overexpress ou précipitation des gènes spécifiques d’intérêt44, 45, d’analyser la dynamique en temps réel de calcium en vivo46et exprimer des gènes rapporteurs pour marquer les lignées neuronales41. La combinaison du système de GAL4/UAS avec la recombinaison mitotique a également permis la création de l’analyse de mosaïque avec un marqueur de cellule répressible (MARCM) système12,47. MARCM a été largement utilisé dans le traçage seul neurone pour identifier les composants de signalisation cellulaires requis pour le guidage axonal12,47. Bien que ces autres techniques et ont fourni un certain nombre de renseignements précieux sur les mécanismes cellulaires requis pour le fonctionnement du système nerveux, la plupart exigent que le cerveau de Drosophila tout d’abord être disséqué ; enlèvement soigneux du cerveau est tenue de conserver bon cerveau patrons morphologie et connexion entre les régions du cerveau. Le protocole suivant utilise des neurones corps et photorécepteur champignons commepopulations neuronales exemple telle qu’elle vous guide à travers la dissection et cerveaux de drosophile par immunofluorescence souillant d’adulte.

<table><tbody><tr><td>Pince à microdissection</td><td>Ted Pella</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes Sylgard</td><td>Systèmes vivants Instrumentation</td><td>DD-50-S-BLK</td><td>Disponible à partir de amazon.com</td></tr><tr><td>Fas2 Études</td><td>développementales d’anticorps Banque d’hybridomes</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>Chaoptin Études</td><td>de développement d’anticorps Banque d’hybridomes</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Aves</td><td>d’anticorps Laboratoire</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 chèvre anti-souris</td><td>anticorps secondaire ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 chèvre anti-poulet anticorps secondaire</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 chèvre anti-souris anticorps secondaire</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>20 % paraformaldéhyde</td><td>Microscope électronique Services</td><td>RT15713</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Lames</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>Na Phosphate Buffer monobasic</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Na phosphate Buffer dibasic</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>vernis à ongles</td><td>Electron Microscope Services (EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica S6D avec source</td><td></td><td></td>lumineuse LED KL300</tr><tr><td>Antenne parabolique à 9 puits (plaque d’appel)</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>nutator/rocker</td><td>Fisher</td><td>22-363-152 ou 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>Antenne parabolique 35mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Fisher</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Potential Fixation Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN Buffer</td><td></td><td></td><td>0,1M NaPhosphate, pH 7,2, 0,1 % Triton-X-100, Constituer généralement 0,5 L de tampon 0,1M NaPhosphate et aliquote 50ml à la fois au besoin Tampon</td></tr><tr><td></td><td></td><td>PLP</td><td>2 % paraformaldéhyde, 0,01M NaI04, 0,075M Lysine, 0,037M NaPO4, pH 7,2, Dissoudre 0,36 g de lysine dans 10 ml H2O + 7,5 ml 0,1 M NaH2PO4 pH 7,2 + 2,5 ml 0,1 M Na2HPO4 sur glace. Immédiatement avant l’utilisation, mélangez 15 ml de cette solution de lysine tamponnée avec 50 mg de NaIO4 (periodate de sodium) + 2 ml de paraformaldéhyde de haute qualité (EMS) à 20 % + 3 ml de</td></tr><tr>tampon <td></td><td></td><td>H2O PEM</td><td>0,1 M PIPES pH 7,0, 2 mM MgS04, 1 mM EGTA, Ce tampon peut être commodément fabriqué en tant que stock 2x et dilué avec 8 % de paraformaldéhyde (PFA) pour donner une concentration finale de 4 % de PFA</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fly Stocks disponibles chez Bloomington</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav (c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>Pilote pan-neuronal GAL4</td></tr><tr><td>w* ;;; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>Pilote GAL4 pour tous les neurones du corps champignon (OK107-GAL4 l’insertion se fait sur le 4ème chromosome)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23) ; c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>Pilote GAL4 pour les lobes alpha et bêta (sur le 2ème chromosome)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23) ; c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>Pilote GAL4 pour les lobes alpha et bêta, contient également UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w* ; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>Pilote GAL4 pour principalement les lobes gamma du corps du champignon (sur le 2e chromosome)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23) ; 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>Pilote GAL4 pour les lobes gamma du corps du champignon, contient également UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP ; FRTG13, stock Tub>Gal80/CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCM, contient le site FRT et GAL80 sur le chromosome 2e</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td><td>stock MARCM, contient hsFLP, GAL4 panneuronal et CD8-GFP sur le chromosome</td></tr><tr><td>X y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP ;; FRT82B, Baignoire>GAL80/TM3, Sb(1) ; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td><td>Crosse MARCM pour retournement du 3ème chromosome</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP ; FRT40A, Baignoire>GAL80 ; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td><td>Crosse MARCM pour le retournement du 2ème chromosome</td></tr><tr><td>w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A ; UAS-CD8-GFP/CyO ;; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td><td>Crosse MARCM pour retourner le chromosome</td></tr><tr><td>X y(1), w* ; UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFP marque la surface cellulaire (CD8 est une protéine transmembranaire)</td></tr><tr><td>y(1), w* ; FRTG13, stock UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td><td>MARCM, contient le site FRT et le CD8-GFP sur le chromosome</td></tr><tr><td>2e y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP ; Crosse MARCM Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td>, <td>contient hsFLP et CD8-GFP sur le chromosome X</td></tr><tr><td>w* ; FRTG13, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5140</td><td>Crosse MARCM, contient le site FRT et GAL80 sur le 2e chromosome</td></tr><tr><td>y(1), w* ;; FRT82B, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5135</td><td>MARCM stock, contient le site FRT et GAL80 sur le 3ème chromosome</td></tr></tbody></table>

dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte drosophila melanogaster

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Développement du système nerveux comporte une série séquentielle des événements qui se sont coordonnés par plusieurs voies de signalisation et de réseaux de régulation. Bon nombre des protéines impliqués dans ces voies sont conservés évolutionnaires entre les mammifères et les autres eucaryotes, comme la drosophile Drosophila melanogaster, suggérant que les principes d’organisation similaires existent au cours du développement de ces organismes. Ce qui est important, Drosophila a été largement utilisé pour identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires régissant les processus qui sont nécessaires chez les mammifères, y compris la neurogenèse, différenciation, guidage axonal et synaptogenèse. Les mouches ont également été utilisés avec succès pour modéliser une variété de maladies neurologiques du développement humain. Nous décrivons ici un protocole pour la microdissection étape par étape, la fixation et la localisation par immunofluorescence des protéines dans le cerveau adulte de la drosophile . Ce protocole porte sur deux populations neuronales de l’exemple, les neurones corps aux champignons et photorécepteurs rétiniens et comprend les étapes facultatives pour tracer les neurones individuels du corps aux champignons par analyse de mosaïque avec une technique de marqueur de cellules répressible (MARCM). Les données exemple de cerveaux sauvage et mutantes apparaissent ainsi qu’une brève description d’un critère de notation pour les défauts de guidage axonal. Si ce protocole met en évidence deux anticorps bien établis pour étudier la morphologie des champignons corps et les neurones photorécepteurs, autres régions du cerveau drosophile et la localisation des protéines dans d’autres régions du cerveau peut aussi être étudié en utilisant ce protocole.

Ce protocole décrit la dissection et immunostaining des adultes Drosophila melanogaster tissus du cerveau. Plus précisément, ce protocole met en évidence l’utilisation de Drosophila champignon corps et photorécepteur neurones comme des sous-ensembles neuronale exemple qui peuvent être utilisés avec précision afin de découvrir les principes généraux de nombreux aspects du développement neuronal.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

L'objectif général de ce protocole de dissection du cerveau de Drosophila est d'obtenir des cerveaux intacts à partir de mouches adultes pouvant être utilisés dans un large éventail d'applications, telles que l'immunofluorescence, la localisation de protéines marquées par la GFP et les expériences de culture ex vivo. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie du développement et des neurosciences, comme le rôle de protéines spécifiques et de voies de signalisation, ou encore l'établissement des schémas de connectivité neuronale durant le développement cérébral. Le principal avantage de cette technique est que, une fois maîtrisée, elle fournit une méthode rapide et efficace pour identifier immunologiquement des défauts morphologiques dans des régions spécifiques du cerveau adulte.Cette procédure peut être difficile à apprendre, car le retrait de l'exosquelette de la tête de la drosophile demande beaucoup de soin et de pratique. Vos mouvements doivent être lents et précis, et les bras du manipulateur doivent être bien soutenus afin de rester stables. Il est conseillé de s'entraîner d'abord sur des mouches aux yeux rouges, puis sur des mouches aux yeux blancs, avant de procéder réellement à la dissection de génotypes d'intérêt pour des expériences concrètes.Pour préparer la dissection, placez les mouches anesthésiées d'intérêt sur un bloc métallique froid ou dans une boîte de Pétri posée sur de la glace. Sinon, utilisez un tampon à mouches émettant du dioxyde de carbone. Ensuite, placez une petite quantité de PTN au centre de la boîte de dissection afin de créer une bulle de PTN.Ensuite, sous un microscope stéréo, remplir le champ de vision avec la bulle de PTN sous un éclairage uniforme. Manipuler ensuite les mouches afin qu'elles soient ventre vers le haut, et transférer l'une d'elles par l'abdomen dans le PTN. Plonger complètement l'animal dans le PTN, et réaliser toute la dissection immergée dans le PTN.À l’aide d’une deuxième paire de forceps, saisir le proboscis et tirer la tête du corps. Parfois, le proboscis sera détaché, mais la tête restera attachée au corps. Si cela se produit, saisir le bord médial d’un rétinien et appliquer une force latérale pour détacher la tête.Jetez l'abdomen et le thorax. Il est essentiel de conserver la tête dans le PTN lors de cette étape. Les connexions entre le cerveau central et la corde nerveuse ventrale ne peuvent pas être analysées clairement par cette méthode.Ensuite, saisissez le bord médial de la rétine gauche au niveau du bord du trou central dans la cuticule et tirez lentement les pinces directement l'une par rapport à l'autre afin d'éviter de déchirer le lobe optique, qui est la structure opaque recouverte de trachées blanches et filamenteuses. Lorsque la rétine se dissocie, une légère diminution de la tension sera perceptible. Afin d'éviter de déchirer le cerveau, il est essentiel de saisir le bord médial de chaque œil et de séparer très lentement les pinces.Avancer trop rapidement peut entraîner une morphologie cérébrale altérée ou des lésions du tissu cérébral. Comme illustré ici, saisissez la cuticule avec chaque paire de forceps et tirez-les très lentement dans des directions opposées. Si l'opération est effectuée correctement, la cuticule doit se détacher du tissu cérébral, laissant le cerveau intact.Des pinces très fines sont nécessaires pour cette étape. Ensuite, retirez soigneusement la cuticule environnante morceau par morceau. Lors de la suppression de la cuticule fortement attachée, il peut être utile de stabiliser le cerveau en tenant le CNG restant afin d'éviter de l'écraser.Enfin, utilisez une pipette P200 pour transférer les cerveaux disséqués dans un puits d'une plaque rempli de PTN pour la fixation et l'immunomarquage. Sous microscope, utilisez une pipette P200 pour transférer 10 à 15 cerveaux disséqués de même génotype dans un tube micro-centrifuge de 0,5 millilitre rempli de paraformaldéhyde à 4 % dilué dans du PTN. Incubez ensuite les cerveaux pendant 20 minutes avec agitation lente à température ambiante.Après la fixation, laissez les cerveaux sédimenter au fond du tube, puis retirez le fixateur. Ensuite, effectuez deux lavages rapides avec 500 microlitres de PTN par lavage. Remplacez le PTN dès que les cerveaux se sont déposés au fond du tube.Ensuite, effectuez trois lavages longs avec du PTN en agitant doucement à température ambiante. Après ces lavages, les cerveaux peuvent être conservés toute la nuit à quatre degrés Celsius dans du PTN. Après avoir éliminé le dernier lavage de PTN, incubez les cerveaux dans 0,5 millilitre de solution de blocage pendant au moins 30 minutes à température ambiante, en agitant doucement.Après avoir retiré la solution de blocage, ajoutez les anticorps primaires dilués dans la solution de blocage et incubez les cerveaux à quatre degrés Celsius pendant deux jours avec une agitation douce. Éliminez l'anticorps primaire en utilisant le protocole de lavage PTN comprenant cinq lavages. Ensuite, appliquez les anticorps secondaires.Laisser ces anticorps incuber avec les tissus pendant trois heures à température ambiante, à l’abri de la lumière et sous agitation. Après l’incubation des cerveaux dans la solution d’anticorps secondaire, appliquer le protocole de lavage PTN. Couvrir les échantillons avec du papier d’aluminium après chaque lavage, puis terminer en éliminant autant que possible le tampon.Ensuite, ajoutez 75 microlitres de milieu de montage antifade fluorescent, puis aspirez et expulsez les cerveaux et le milieu à l’intérieur de la pointe de pipette une seule fois. Le tube peut ensuite être enveloppé dans du papier d’aluminium et conservé à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours, mais idéalement, passez directement au montage. Pour monter les cerveaux, construisez une lame-pont.Placer deux lamelles de base à environ 1 centimètre d'intervalle sur une lame chargée positivement. Veiller à ce que le côté chargé positivement soit orienté vers le haut. Ensuite, fixer les lamelles sur la lame à l'aide de vernis à ongles et laisser sécher complètement le vernis avant de poursuivre.Ensuite, placez la lame sous un microscope stéréo et déposez les cerveaux et le milieu à l’aide d’une pipette dans l’espace entre les lamelles. Veillez à régler l’éclairage afin d’améliorer la visualisation des cerveaux. Puis, aspirez le milieu de montage excédentaire présent sur la lame, en prenant soin d’éviter les cerveaux.Ensuite, absorbez le milieu de montage excédentaire restant. Cela permettra de positionner les cerveaux plus précisément. Maintenant, à l’aide de pinces, orientez les cerveaux selon un motif en grille, avec leurs lobes antennaires dirigés vers le haut.Ensuite, placez une lamelle sur les cerveaux et utilisez du vernis à ongles incolore pour sceller les bords de la lamelle supérieure fixée aux lamelles de base. Maintenant, chargez la cavité centrale avec un milieu de montage frais en ajoutant des gouttes successives, en laissant le milieu pénétrer sous la lamelle par action capillaire. Une fois la cavité remplie, scellez-la complètement à l’aide de vernis à ongles incolore.La méthode décrite peut être utilisée pour visualiser presque toute structure du cerveau adulte, y compris les corps pédonculés. Cette région du cerveau est nécessaire pour l'apprentissage et la mémoire. Les corps pédonculés peuvent être facilement visualisés à l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine fasciculine 2.Cette protéine est fortement exprimée dans les lobes alpha et beta, ainsi que dans le corps elliptique situé au centre. Cette technique a permis d'identifier plusieurs processus cellulaires nécessaires à l'orientation correcte des axones des neurones du corps pédonculé. L'altération de ces processus provoque une grande variété de phénotypes mutants, tels qu'une projection inappropriée des axones à travers la région médiane du cerveau ou la disparition des lobes alpha.Ces phénotypes mutants sont souvent incomplètement pénétrants, et nécessitent donc l'examen de plusieurs cerveaux. Afin d'étudier le rôle autonome d'une protéine dans le guidage axonal, la technique de Markham peut également être utilisée pour visualiser les décisions de guidage axonal de neurones individuels mutants ou de type sauvage exprimant GFP, au sein d'un fond de type sauvage non fluorescent. La méthode décrite ici permet une visualisation fiable et reproductible de pratiquement n'importe quelle région du cerveau adulte de Drosophila.Ici, nous nous sommes concentrés sur les neurones du corps mushroom. Dans la version textuelle de ce protocole, nous avons également démontré la visualisation des lobes optiques. D'autres études ont utilisé des techniques similaires pour visualiser la pars intercerebralis, les neurones horlogers et les neurones projeteurs du lobe antennaire, entre bien d'autres.Une fois maîtrisée, chaque cerveau peut être disséqué en 3 à 5 minutes, si la procédure est correctement réalisée. Lors de l'exécution de cette manipulation, il est important de stabiliser vos bras près du microscope. Il est également essentiel d'agir lentement et de retirer les petits morceaux de cuticule un par un.Un déplacement trop rapide pourrait causer des dommages indésirables aux tissus cérébraux sous-jacents. En plus d'utiliser des cerveaux disséqués pour des expériences de microscopie basées sur l'immunofluorescence, le tissu cérébral peut également être utilisé pour d'autres expériences.

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Dissection, immunohistochimie et montage de cerveaux de drosophiles larvaires et adultes pour la visualisation du lobe optique

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Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster (Vidéo) | JoVE Journal

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