Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

L’objectif global de ce protocole de dissection cérébrale de la drosophile est d’obtenir des cerveaux intacts de mouches adultes qui peuvent être utilisés dans un large éventail d’applications, telles que l’immunofluorescence, la localisation de protéines marquées à la GFP et les expériences de culture ex-vivo. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie du développement et des neurosciences, telles que les rôles de protéines spécifiques et de voies de signalisation et l’établissement de modèles de connectivité neuronale au cours du développement du cerveau. Le principal avantage de cette technique est qu’une fois maîtrisée, elle fournit une méthode rapide et efficace pour identifier immunologiquement les défauts morphologiques dans des régions spécifiques du cerveau adulte.

Cette procédure peut être difficile à apprendre, car le retrait de l’exosquelette de la tête de mouche peut demander beaucoup de soin et de pratique. Vos mouvements doivent être lents et délibérés, et les bras du dissecteur doivent être bien soutenus afin de rester stables. C’est une bonne idée de s’entraîner sur des mouches aux yeux rouges, puis sur des mouches aux yeux blancs avant de disséquer les génotypes d’intérêt pour des expériences réelles.

Pour vous préparer à la dissection, placez les mouches anesthésiées d’intérêt sur un tampon métallique froid ou dans une boîte de Pétri posée sur de la glace. Vous pouvez également utiliser un coussinet anti-mouches qui émet du dioxyde de carbone. Ensuite, placez une petite quantité de PTN au centre de la boîte de dissection pour créer une bulle de PTN.

Ensuite, sous un stéréomicroscope, remplissez le champ de vision avec la bulle PTN sous un éclairage uniforme. Maintenant, manipulez les mouches pour qu’elles soient sur le ventre et transférez-en une par l’abdomen dans le PTN. Immergez complètement l’animal dans le PTN et effectuez toute la dissection immergée dans le PTN.

À l’aide d’une deuxième paire de pinces, saisissez la trompe et retirez la tête du corps. De temps en temps, la trompe sera retirée, mais la tête restera attachée au corps. Si cela se produit, saisissez le bord médial d’une rétine et appliquez une force latérale pour retirer la tête.

Jetez l’abdomen et le thorax. Il est essentiel de garder la tête dans le PTN pendant cette étape. Les connexions du cerveau central à VNC ne peuvent clairement pas être analysées à l’aide de cette méthode.

Ensuite, saisissez le bord médial de la rétine gauche au bord du trou central de la cuticule et écartez lentement les pinces directement les unes des autres pour éviter la déchirure du lobe optique, qui est la structure opaque recouverte d’une trachée blanche et filandreuse. Au fur et à mesure que la rétine se dissocie, il y aura une légère diminution de la tension. Afin d’éviter que le cerveau ne se déchire, il est extrêmement important de saisir le bord médial de chaque œil et d’écarter très lentement la pince.

Se déplacer trop rapidement peut entraîner une modification de la morphologie du cerveau ou des dommages aux tissus cérébraux. Comme indiqué ici, saisissez la cuticule avec chaque paire de pinces et tirez-les très lentement dans des directions opposées. Si cela est fait correctement, la cuticule devrait se séparer du tissu cérébral, laissant le cerveau intact.

Des pinces très tranchantes sont nécessaires pour cette étape. Ensuite, retirez soigneusement la cuticule environnante morceau par morceau. Tout en enlevant la cuticule obstinément attachée, il peut aider à sécuriser le cerveau en saisissant le VNC restant pour éviter d’écraser le cerveau.

Enfin, à l’aide d’une pipette P200, transférez les cerveaux disséqués dans un puits d’une plaque remplie de PTN pour la fixation et l’immunomarquage. Au microscope, à l’aide d’une pipette P200, transférez 10 à 15 cerveaux disséqués du même génotype dans un tube à micro-centrifuger de 0,5 millilitre rempli de 4 % de paraformaldéhyde dilué dans du PTN. Ensuite, incubez les cerveaux pendant 20 minutes avec un balancement lent à température ambiante.

Après la fixation, laissez le cerveau se déposer au fond du tube, puis retirez le fixateur. Ensuite, effectuez deux lavages rapides avec 500 microlitres de PTN par lavage. Remplacez le PTN dès que le cerveau s’installe dans le tube.

Ensuite, effectuez trois longs lavages avec PTN en utilisant une agitation douce à température ambiante. Après ces lavages, les cerveaux peuvent être stockés pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans le PTN. Après avoir retiré le dernier lavage PTN, incubez les cerveaux dans 0,5 millilitre de solution bloquante pendant au moins 30 minutes à température ambiante et en agitant doucement.

Après avoir retiré la solution de blocage, ajoutez les anticorps primaires dilués dans la solution de blocage et incubez les cerveaux à quatre degrés Celsius pendant deux jours avec une agitation douce. Retirez l’anticorps primaire à l’aide du régiment de lavage PTN à cinq lavages. Et ensuite, appliquez les anticorps secondaires.

Laissez ces anticorps incuber avec les tissus pendant trois heures à température ambiante tout en étant à l’abri de la lumière par balancement. Après avoir incubé les cerveaux dans la solution d’anticorps secondaire, appliquez le régiment de lavage PTN. Recouvrez les échantillons de papier d’aluminium après chaque lavage et terminez en retirant autant de tampon que possible.

Ensuite, ajoutez 75 microlitres de support de montage fluorescent anti-décoloration, et faites entrer et sortir le cerveau et le milieu de la pointe de la pipette une seule fois. Le tube peut ensuite être enveloppé dans une feuille d’aluminium et stocké à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours, mais idéalement, procéder directement au montage. Pour monter les cerveaux, construisez un toboggan de pont.

Placez deux capots de couverture de base à environ 1 centimètre l’un de l’autre sur une glissière chargée positivement. Assurez-vous que le côté chargé positivement est face vers le haut. Ensuite, collez les lamelles sur la lame avec du vernis à ongles et laissez le vernis sécher complètement avant de continuer.

Ensuite, placez la lame sous un microscope stéréoscopique et pipetez les cerveaux et le milieu dans l’espace entre les lamelles. Assurez-vous d’ajuster l’éclairage pour améliorer la visualisation du cerveau. Ensuite, aspirez le support de montage supplémentaire de la diapositive, en faisant attention d’éviter les cerveaux.

Ensuite, évacuez l’excédent de support de montage. Cela permettra de positionner plus précisément les cerveaux. Maintenant, à l’aide de pinces, orientez les cerveaux en grille, avec leurs lobes antennaires vers le haut.

Ensuite, placez un feuillet sur la cervelle et utilisez du vernis à ongles pour sceller les bords du couvercle supérieur qui sont fixés aux feuillets de couverture de base. Maintenant, chargez la cavité centrale avec un nouveau support de montage dans le sens de la goutte, ce qui permet au support d’être aspiré sous la glissière de recouvrement par capillarité. Lorsque la cavité est remplie, scellez-la complètement à l’aide de vernis à ongles transparent.

La méthode décrite peut être utilisée pour visualiser presque toutes les structures du cerveau adulte, y compris les corps de champignons. Cette région du cerveau est nécessaire à l’apprentissage et à la mémoire. Les corps des champignons peuvent être facilement visualisés à l’aide d’anticorps qui reconnaissent la protéine fasciculine 2.

Cette protéine est fortement exprimée dans les lobes alpha et bêta, ainsi que dans le corps ellipsoïde situé au centre. Cette technique a permis d’identifier plusieurs processus cellulaires nécessaires au bon guidage axonal des neurones du corps du champignon. La perturbation de ces processus provoque un large éventail de phénotypes mutants, tels qu’une projection axonale inappropriée dans la région médiane du cerveau et des lobes alpha manquants.

Ces phénotypes mutants sont souvent incomplètement pénétrants et nécessitent donc l’examen de plusieurs cerveaux. Afin d’examiner le rôle autonome d’une protéine dans la recherche de trajectoire axonale, la technique de Markham peut également être utilisée pour visualiser les décisions de guidage axonal de neurones mutants ou de type sauvage positifs à la GFP positive dans un fond de type sauvage non fluorescent. La méthode décrite ici permet de visualiser de manière fiable et reproductible pratiquement une région du cerveau de la drosophile adulte.

Ici, nous nous sommes concentrés sur les neurones du corps du champignon. Dans la version texte de ce protocole, nous avons également démontré la visualisation des lobes optiques. D’autres études ont utilisé des techniques similaires pour visualiser la pars intercerebralis, les neurones de l’horloge et les neurones de projection du lobe antennaire, parmi beaucoup d’autres.

Une fois maîtrisé, chaque cerveau peut être disséqué en 3 à 5 minutes, si cela est bien réalisé. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de stabiliser vos bras près du microscope. Il est également important de se déplacer lentement et de retirer les petits morceaux de cuticule un à la fois.

Se déplacer trop rapidement pourrait causer des dommages indésirables aux tissus cérébraux sous-jacents. En plus d’utiliser des cerveaux disséqués pour des expériences de microscopie basée sur l’immunofluorescence, le tissu cérébral peut également être utilisé pour des expériences supplémentaires.