Médicament à base de cytométrie en flux système de contrôle pour l’Identification de petites molécules qui favorisent la différenciation cellulaire des cellules souches de glioblastome

L’objectif global de cette procédure est de cribler des banques de petites molécules pour des agents qui favorisent la différenciation astrogliale dans les cellules souches du glioblastome. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches cancéreuses, telles que les voies de signalisation nécessaires au maintien des cellules souches du glioblastome à l’état indifférencié. La bonne exécution de cette technique permet d’identifier facilement les petites molécules qui favorisent la différenciation des cellules souches du glioblastome.

L’implication de cette technique s’étend au traitement du glioblastome d’Ehlers-Danlos, car la réduction du pourcentage de cellules souches du glioblastome peut diminuer la probabilité de récidive. Cette méthode peut également être appliquée à la définition de la différenciation dans d’autres lignées cellulaires à l’aide d’autres constructions rapporteures. Notre rapport est le premier à établir une approche à haut débit pour dépister les agents qui forcent les cellules souches du gliome à se différencier.

Travailler avec des particules de lentivirus dans des cellules cancéreuses dérivées de patients peut être extrêmement dangereux. Par conséquent, la procédure standard pour travailler avec des agents pathogènes transmissibles par le sang doit toujours être suivie. Pour commencer, ensemencez un million de cellules souches de glioblastome ou GSC dans deux millilitres de milieu de croissance complet de cellules souches neurales dans une plaque à six puits.

Ensuite, transduisez les cellules avec le lentivirus rapporteur à une multiplicité d’infection égale à cinq. Au mélange de cellules et de virus, ajoutez deux microlitres de polybrène de sorte que la concentration finale soit de huit microgrammes par millilitre, et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant la nuit. Après l’incubation, remplacez le milieu de croissance pour éliminer le virus non lié.

Et centrifuger les cellules à 360 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez soigneusement le milieu et les cellules de la plaque dans une plaque à six puits. Et continuez à incuber les cellules pendant 24 heures.

Récoltez 0,5 millilitre du volume total de la culture. Cellules à granulés par centrifugation à 360 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Remettre les cellules en suspension dans 0,5 millilitre de milieu de croissance de cellules souches neurales fraîches.

Remettez la plaque dans l’incubateur pour permettre l’expansion pendant au moins 72 heures. Ajoutez 200 microlitres de réactif de dissociation et incubez pendant cinq minutes dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius. Dissociez les cellules en les faisant doucement monter et descendre.

Aux cellules dissociées, ajoutez 800 microlitres de HBSS pour assurer une fixation ou une agrégation minimale des cellules. Ensuite, transférez 200 microlitres de chaque suspension cellulaire dans les puits d’une plaque à 96 plusieurs puits. Déterminez le pourcentage de cellules exprimant la protéine fluorescente verte par cytométrie en flux.

Enregistrez au moins 10 000 cellules viables dans chaque acquisition. Dans toutes les analyses cytométriques en flux, utilisez des cellules parentales non transduites ou des cellules non fluorescentes transduites par vecteur pour établir la fluorescence de base. Pour sélectionner et développer des sous-clones individuels, il faut ensemencer des cellules à une densité de 0,7 cellule par puits dans 100 microlitres de milieu de cellules souches neurales dans une plaque de 96 puits.

Maintenez ces clones en culture pendant 11 jours. Recherchez des neurosphères d’un diamètre supérieur à 100 microns. Nous avons précédemment établi cette taille seuil pour déterminer rétrospectivement si la neuorsphère a été créée par une cellule souche de glioblastome auto-renouvelée.

Cette taille limite peut nécessiter une optimisation lorsque l’on travaille avec différents modèles de cellules de glioblastome. Observez les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un filtre FITC et marquez les puits contenant une seule neurosphère dans laquelle environ 1 à 5 % des cellules sont positives à la GFP. Après le marquage, développez les clones individuels jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de cellules soit disponible pour l’analyse par cytométrie en flux.

En supposant que les clones rapporteurs contiennent de 1 à 5 % de cellules GFP positives, récoltez 0,5 millilitre de chaque clone ainsi qu’une quantité égale de cellules témoins non transduites pour déterminer le pourcentage exact de cellules GFP positives. Après avoir granulé les cellules à 360 fois G pendant cinq minutes à température ambiante, aspirez le surnageant. Ajoutez 200 microlitres de réactif de dissociation à chaque pastille et incubez les tubes dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, triturez les cellules environ 20 à 30 fois pour obtenir une suspension unicellulaire. Ajoutez ensuite 800 microlitres de HBSS pour assurer une fixation ou une agrégation minimale des cellules. Transférez maintenant 200 microlitres de chaque suspension cellulaire dans les puits d’une plaque à 96 puits.

Enfin, effectuez une cytométrie en flux, en enregistrant au moins 10 000 cellules viables dans chaque acquisition. Pour évaluer la capacité clonogénique, préparez des suspensions unicellulaires de sous-clones rapporteurs de différenciation en triturant les cellules environ 20 à 30 fois. Ensuite, plaquez ces cellules dans 100 microlitres de milieu de croissance complet de cellules souches neurales à une densité d’environ cinq à 500 cellules par puits dans des plaques multipuits de 96 boîtes.

Maintenez ces cellules en culture pendant neuf à 11 jours. Recherchez les neurosphères au microscope optique. Un puits contenant au moins une seule grande neurosphère est considéré comme positif.

En considérant les cellules parentales non transduites et les cellules lentivirus positives à la GFP comme données de contrôle, le nombre total de puits analysés et le nombre de cellules positives sur l’interface en ligne ELDA. Pour commencer le criblage, plaquez 5000 cellules dans 99 microlitres de milieu de croissance complet de cellules souches neurales dans une plaque de 96 puits. Ensuite, avec une pipette à 12 canaux, traitez les cellules avec une concentration finale de deux micromolaires de composés de bibliothèque dilués ou avec le contrôle DMSO.

Incuber les cellules pendant 72 heures. Ajoutez maintenant 150 microlitres de réactif de dissociation cellulaire à l’aide d’une pipette à 12 canaux dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, triturez doucement les cellules de chaque puits environ 20 à 30 fois à l’aide d’une pipette à 12 canaux jusqu’à ce qu’une suspension de cellule unique soit obtenue.

Effectuez maintenant une cytométrie en flux et déterminez le pourcentage de cellules exprimant le rapporteur GFAP :GFP. Déterminez d’abord la taille et la viabilité des cellules à partir des diffusions avant et latérale, puis identifiez la population de cellules viables. Déterminez ensuite les cellules GFP positives au sein de la population cellulaire viable.

Une augmentation du pourcentage de cellules GFP positives de trois écarts-types par rapport aux témoins est considérée comme un résultat positif qui peut être ajusté pour tenir compte de la préférence de l’utilisateur en matière de rigueur. Des images représentatives de sous-clones de HSR-GBM1 GSC exprimant des niveaux faibles et élevés de GFAP :GFP sont présentées. Les sous-clones positifs pour l’expression GFAP :GFP ont été sélectionnés par cytométrie en flux pour la lignée neurosphérique dérivée du patient.

Ici, une GFAP :GFP faible indique que moins de 5 % des cellules du clone sont GFP positives, tandis qu’une GFAP :GFP élevée indique que plus de 75 % des cellules du clone sont GFP positives. Ces résultats montrent que la capacité d’auto-renouvellement in vitro des sous-clones à faible GFAP est supérieure à celle de leurs homologues à faible GFAP, comme déterminé par ELDA. Par conséquent, les sous-clones GH sont plus différenciés que les sous-clones GL.

Enfin, les bibliothèques de médicaments ont été passées au crible afin d’identifier les agents capables d’induire la différenciation astrogliale dans les CSG. 12 médicaments ont montré une augmentation significative du pourcentage de cellules exprimant le rapporteur GFAP :GFP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques semaines si elle est bien exécutée.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le dosage alamarBlue, le dosage clonogénique en milieu semi-solide, l’injection de flanc ou de xénographie intracrânienne peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’effet des médicaments sélectifs sur la prolifération cellulaire et la clonogénicité in vitro et la tumorigénicité in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les composés capables d’induire la différenciation astrogliale dans les cellules souches du glioblastome.