Médicament à base de cytométrie en flux système de contrôle pour l’Identification de petites molécules qui favorisent la différenciation cellulaire des cellules souches de glioblastome

L'objectif général de cette procédure est de cribler des bibliothèques de petites molécules afin d'identifier des agents capables de favoriser la différenciation astrogliale des cellules souches de glioblastome. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches cancéreuses, telles que les voies de signalisation nécessaires au maintien des cellules souches de glioblastome dans un état indifférencié. Une exécution correcte de cette technique permet l'identification simple de petites molécules induisant la différenciation des cellules souches de glioblastome.

Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie du glioblastome chez les patients atteints du syndrome d'Ehlers-Danlos, car la réduction du pourcentage de cellules souches du glioblastome pourrait diminuer le risque de récidive. Cette méthode peut également être appliquée pour induire la différenciation vers d'autres lignées cellulaires en utilisant d'autres constructions rapporteuses. Notre étude est la première à établir une approche à haut débit permettant de cribler des agents capables d'induire la différenciation des cellules souches du gliome.

Travailler avec des particules de lentivirus dans des cellules cancéreuses provenant de patients peut être extrêmement dangereux. Par conséquent, il convient toujours de suivre les procédures standard de manipulation des agents pathogènes transmissibles par le sang. Pour commencer, ensemencez un million de cellules souches de glioblastome ou CSC dans deux millilitres de milieu de croissance complet pour cellules souches neuronales dans une plaque de six puits.

Ensuite, transduisez les cellules avec le rétrovirus lentiviral rapporteur à une multiplicité d'infection égale à cinq. Ajoutez deux microlitres de polybrene au mélange cellules et virus afin d'obtenir une concentration finale de huit microgrammes par millilitre, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant la nuit. Après l'incubation, remplacez le milieu de croissance pour éliminer le virus non lié.

Et centrifuger les cellules à 360 ×g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirer soigneusement le milieu et replater les cellules dans une plaque à six puits. Puis poursuivre l'incubation des cellules pendant 24 heures.

Récupérez 0,5 millilitre du volume total de la culture. Faites précipiter les cellules par centrifugation à 360 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Resuspendez les cellules dans 0,5 millilitre de milieu frais de croissance des cellules souches neurales.

Remettre la plaque dans l'incubateur pour permettre une expansion d'au moins 72 heures. Ajouter 200 microlitres de réactif de dissociation et incuber pendant cinq minutes dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius. Dissocier les cellules en pipetant doucement vers le haut et vers le bas.

Ajouter 800 microlitres de HBSS aux cellules dissociées afin de garantir une adhérence ou une agrégation cellulaire minimale. Ensuite, transférer 200 microlitres de chaque suspension cellulaire dans des puits d'une plaque multipuits 96. Déterminer le pourcentage de cellules exprimant la protéine fluorescente verte par cytométrie en flux.

Enregistrez au moins 10 000 cellules viables lors de chaque acquisition. Dans toutes les analyses par cytométrie en flux, utilisez des cellules parentales non transduites ou des cellules transduites avec un vecteur non fluorescent pour établir la fluorescence de base. Pour sélectionner et amplifier des sous-clones individuels, semez les cellules à une densité de 0,7 cellule par puits dans 100 microlitres de milieu de cellules souches neurales dans une plaque de 96 puits.

Conserver ces clones en culture pendant 11 jours. Rechercher les neurosphères dont le diamètre est supérieur à 100 microns. Nous avons précédemment établi cette taille seuil afin de déterminer rétrospectivement si la neurosphère provenait d'une cellule souche de glioblastome autorépliquante.

Cette taille limite peut nécessiter une optimisation lorsqu'on travaille avec différents modèles cellulaires de glioblastome. Observer les cellules au microscope à fluorescence équipé d'un filtre FITC et repérer les puits contenant une seule neurosphère dans laquelle environ 1 % à 5 % des cellules sont positives pour la GFP. Après marquage, amplifier individuellement chaque clone jusqu'à ce qu'un nombre suffisant de cellules soit disponible pour une analyse par cytométrie en flux.

En supposant que les clones rapporteurs contiennent de 1 % à 5 % de cellules positives pour la GFP, récolter 0,5 millilitre de chaque clone ainsi qu'une quantité égale de cellules contrôles non transduites afin de déterminer le pourcentage exact de cellules positives pour la GFP. Après avoir centrifugé les cellules à 360 ×g pendant cinq minutes à température ambiante, aspirer le surnageant. Ajouter 200 microlitres de réactif de dissociation à chaque culot et incuber les tubes dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius.

Après l'incubation, triturez les cellules environ 20 à 30 fois pour obtenir une suspension monocellulaire. Ajoutez ensuite 800 microlitres de HBSS afin de minimiser l'attachement ou l'agrégation des cellules. Transférez maintenant 200 microlitres de chaque suspension cellulaire dans des puits d'une plaque multipuits 96.

Enfin, réalisez la cytométrie en flux en enregistrant au moins 10 000 cellules viables pour chaque acquisition. Pour évaluer la capacité clonogénique, préparez des suspensions monocellulaires de sous-clones rapporteurs de différenciation en pipetant les cellules environ 20 à 30 fois. Ensuite, semez ces cellules dans 100 microlitres de milieu de croissance complet pour cellules souches neurales à une densité d'environ cinq à 500 cellules par puits dans des plaques multipuits 96.

Conserver ces cellules en culture pendant neuf à onze jours. Rechercher des neurosphères au microscope optique. Une puits contenant au moins une neurosphère unique et de grande taille est considéré comme positif.

En considérant les cellules parentales non transduites et les cellules transduites par un lentivirus exprimant la GFP comme témoins, saisissez dans l'interface en ligne ELDA le nombre total de puits analysés et le nombre de cellules positives. Pour commencer le criblage, ensemencez 5000 cellules dans 99 microlitres de milieu de croissance complet pour cellules souches neurales dans une plaque de 96 puits. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal à 12 canaux, traitez les cellules avec une concentration finale de deux micromolaire de composés de la bibliothèque dilués ou avec le témoin DMSO.

Incuber les cellules pendant 72 heures. Ajouter ensuite 150 microlitres de réactif de dissociation cellulaire à l’aide d’un pipeteur à 12 canaux dans chaque puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, triturer doucement les cellules de chaque puits environ 20 à 30 fois à l’aide d’un pipeteur à 12 canaux jusqu’à l’obtention d’une suspension monocellulaire.

Effectuez maintenant la cytométrie en flux et déterminez le pourcentage de cellules exprimant le rapporteur GFAP:GFP. Déterminez d'abord la taille cellulaire et la viabilité à partir des diffusions avant et latérale, puis sélectionnez la population de cellules viables. Ensuite, identifiez les cellules positives pour la GFP au sein de la population de cellules viables.

Une augmentation du pourcentage de cellules GFP-positives de trois écarts types par rapport aux témoins est considérée comme un résultat positif, ce qui peut être ajusté selon les préférences de l'utilisateur en matière de sévérité. Des images représentatives de sous-clones de cellules souches gliales de méningiome HSR-GBM1 exprimant des niveaux faibles et élevés de GFAP:GFP sont présentées. Les sous-clones positifs pour l'expression de GFAP:GFP ont été sélectionnés par cytométrie en flux à partir de la lignée de neurosphères dérivée de patient.

Ici, un faible rapport GFAP:GFP indique que moins de 5 % des cellules du clone sont positives pour la GFP, tandis qu'un fort rapport GFAP:GFP indique que plus de 75 % des cellules du clone sont positives pour la GFP. Ces résultats montrent que la capacité d'auto-renouvellement in vitro des sous-clones à faible expression de GFAP est supérieure à celle de leurs homologues à forte expression de GFAP, comme déterminé par l'ELDA. Par conséquent, les sous-clones GH sont plus différenciés que les sous-clones GL.

Enfin, des bibliothèques de médicaments ont été criblées afin d'identifier des agents capables d'induire une différenciation astrogliale dans les cellules souches gliales (GSC). Douze médicaments ont été trouvés pour augmenter significativement le pourcentage de cellules exprimant le rapporteur GFAP:GFP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques semaines si elle est effectuée correctement.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que le test alamarBlue, le test de clonogénicité en milieu semi-solide ou l'injection de xénogreffes sous-cutanée ou intracrânienne peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'effet de médicaments sélectifs sur la prolifération cellulaire et la clonogénicité in vitro, ainsi que sur la tumorigénicité in vivo. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'identifier des composés capables d'induire une différenciation astrogliale dans les cellules souches de glioblastome.