Application de MultiColor FlpOut Technique pour étudier les Morphologies de cellule unique de haute résolution et Interactions cellulaires des cellules gliales chez la drosophile

L’objectif global de cette technique est de visualiser les morphologies unicellulaires dans des tissus anatomiques complexes, simplifiant ainsi l’étude de l’interaction cellulaire chez la drosophile. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les morphologies complexes et les interactions cellulaires à l’aide de la mouche des fruits. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être adaptée à l’étude des morphologies unicellulaires dans n’importe quel tissu et à n’importe quel stade de développement.

La démonstration de la procédure sera assurée par Anja Kieser, technicienne dans notre laboratoire. La technique MCFO modifie la technique standard FlpOut comme suit. Une recombinaison FLP à choc thermique et différents rapporteurs restent sous le contrôle de l’UAS, cependant, chaque rapporteur a une épine dorsale commune d’un superfolder GFP myristoylé, dans lequel des copies d’une étiquette d’épitope ont été insérées.

Les protéines non fluorescentes qui en résultent sont appelées GFP de monstre spaghetti et sont identifiées par des anticorps. Selon le nombre d’excisions, une combinaison différente d’épitopes est exprimée. Parce que le promoteur HSP est légèrement actif à 25 degrés Celsius, il est mis en place à des croix à 18 degrés Celsius où il est vraiment inactif.

Ensuite, attendez environ 20 jours pour obtenir la génération F1. Triez les femelles et les mâles F1 dans des flacons séparés. Pour les choquer thermiquement, transférez-les d’abord dans des flacons d’aliments frais lorsqu’ils ont trois à quatre jours.

Les jeunes mouches peuvent être trop délicates pour être choquées par la chaleur. Ensuite, transférez les flacons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Immergez-les profondément pour assurer un choc thermique homogène.

Pour un marquage clairsemé des cellules gliales, commencez par cinq à huit minutes de choc thermique, puis optimisez. Le temps optimal de choc thermique marquera peu les cellules cibles et sa relation dépend du pilote GAL4 spécifique utilisé. Après le choc thermique, posez les flacons horizontalement sur le banc pendant quelques minutes pour les refroidir.

Maintenant, commencez à maintenir les mouches à 25 degrés Celsius dans les mêmes flacons. Après deux jours, l’expression du rapporteur sera optimale et les mouches pourront être disséquées. En préparation, mettez trois puits de dépression profonde sur la glace.

Remplissez un puits avec de l’éthanol à 70 %, un avec du PBS et un avec un milieu de culture cellulaire S2. Ensuite, chargez un plat de dissection de trois centimètres tapissé de silicone noir avec du S2 froid. Effectuez toutes les dissections en S2 pour garder les tissus en bonne santé. Maintenant, anesthésiez les mouches avec du dioxyde de carbone.

Ensuite, à l’aide d’une pince ou d’une plume, mettez les mouches dans de l’éthanol froid à 70 % pendant environ 30 secondes, puis du PBS froid pendant environ 30 secondes, puis transférez-les dans du S2 froid. Ainsi, lavez toutes les mouches à disséquer. Jusqu’à 10 mouches d’un génotype suffisent généralement. Maintenant, dans les 30 minutes, disséquez tous les cerveaux.

Tout d’abord, détachez la tête du reste du corps et jetez le corps. Gardez la tête maintenue avec la main gauche pendant toute la dissection ou il sera très difficile de la reprendre. Ensuite, retirez un œil en saisissant le tissu juste en dessous de la rétine.

Retirez ensuite l’autre œil et exposez ainsi le cerveau et les tissus environnants. Ensuite, retirez tout le tissu trachéal et la cuticule restante autour du cerveau, jusqu’à ce que le tissu cérébral semble propre. Tout le tissu trachéal doit être retiré pour des résultats de coloration optimaux.

C’est tout ce qui est nécessaire pour préparer le cerveau à la fixation. Procédez à la dissection de tous les cerveaux, tout en gardant les cerveaux disséqués dans du froid S2. Essayez d’avoir jusqu’à 10 cerveaux préparés par tube de microcentrifugation pour une coloration optimale. Transférez les cerveaux isolés à l’aide d’une pointe de pipette P10 dans un tube de microcentrifugation de 200 microlitres avec une solution fixatrice.

Ne manipulez jamais le cerveau à l’aide de pinces. Incuber les tissus à l’abri de la lumière. Évitez d’aspirer le cerveau pendant les transferts de solution.

Pour retirer le fixateur, utilisez trois lavages ou plus de 15 minutes avec une solution de lavage. Bloquez ensuite les tissus avec une solution bloquante pendant 30 minutes ou plus. Ensuite, remplacez la solution bloquante par des anticorps primaires dilués dans une solution de lavage et incubez les cerveaux pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Pour éliminer les anticorps primaires, utilisez trois lavages d’une heure dans une solution de lavage. Ensuite, ajoutez des anticorps conjugués aux fluorophores secondaires dans une solution de lavage et incubez les cerveaux pendant la nuit à quatre degrés Celsius ou pendant quatre heures à température ambiante. Pour éliminer complètement les anticorps non liés, utilisez trois lavages d’une heure dans une solution de lavage suivis d’un lavage plus long avec du PBS.

Ensuite, montez les cerveaux. Préparez deux lamelles à l’aide d’une entretoise d’imagination. Dans l’entretoise et sur la lamelle supplémentaire, appliquez 10 microlitres de support de montage avec un agent anti-décoloration.

Ensuite, à l’aide d’une pipette P10, transférez les cerveaux dans la lamelle, en les déposant à côté du milieu avec un peu de PBS. Ne laissez pas le tissu se dessécher. Maintenant, déplacez soigneusement les cerveaux dans le milieu de montage à l’aide de la pipette et enfin déplacez-les vers le milieu dans l’entretoise et disposez-les avec une pince.

Ensuite, retirez la doublure adhésive sur les entretoises et fixez une lamelle. Fixez la lamelle avec une légère pression à l’aide d’une pince et procédez immédiatement à l’imagerie ou stockez les lames à moins 20 degrés Celsius pour une analyse ultérieure. En utilisant les méthodes décrites, trois rapporteurs différents marqués à la membrane sont maintenus silencieux par des terminateurs transcriptionnels flanqués de sites FRT.

Lorsque les animaux ont été choqués thermiquement, la recombinase FLP a été exprimée et a éliminé au hasard les terminateurs, conduisant à l’expression de différentes combinaisons de rapporteurs. Dans l’ensemble, les différentes combinaisons de rapporteurs fournissent sept couleurs différentes, de sorte que plusieurs morphologies de cellules uniques peuvent être visualisées et étudiées individuellement. Différents temps de choc thermique ont été testés avec EG-GAL4 et ALG-GAL4.

Le marquage de la cellule unique a été analysé dans la région du lobe antennaire du cerveau. Le pilote EG-GAL4 s’exprime dans les cellules gliales engainantes qui sont toutes engainées à la surface du lobe antennaire. En comparaison, les cellules gliales de type astrocytaire ciblées par l’ALG-GAL4 couvraient principalement des zones non chevauchantes du lobe antennaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étiqueter des cellules individuelles en solution. Afin de comprendre leurs relations complexes et anatomiques à l’aide de la drosophile et, en principe et dans un organisme modèle, dans lequel le système binaire GAL4 UIS peut être appliqué. Lorsque vous tentez cette procédure pour la première fois, il est important de se rappeler d’abord d’optimiser le temps de choc thermique et de suivre autant que possible les étapes uniques du protocole de coloration afin d’obtenir les meilleurs résultats.