Name: Détermination de zone optique transversale musculaire des Muscles de vol Indirect adulte de Drosophila Melanogaster (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Apprenez à quantifier la surface musculaire chez Drosophila melanogaster pour étudier l'atrophie musculaire dans la dystrophie myotonique. Cette méthode par sectionnement transversal permet d'évaluer indirectement la masse musculaire.

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Les auteurs tiennent à remercier les membres du Translational Genomics Group et Kathryn J Hanson pour le feed-back et les améliorations sur ce protocole. Ce projet a été réalisé avec une subvention de recherche SAF2015-64500-R, qui comprend les fonds européens de développement régional, décerné à R.A par le Ministerio de Economia y Competitividad.

1. fixation et résine enrobage
<ol><li>Anesthésier les mouches avec du dioxyde de carbone (CO2) ou par hypothermie en utilisant un bloc de glace. Utiliser un microscope à dissection (avec faible grossissement de voir la volée entière) et des ciseaux pour enlever les pattes, ailes, tête et la partie terminale de l’abdomen pour faciliter la pénétration du fixateur. Une manipulation soigneuse des carcasses est nécessaire à cette étape afin d’éviter la déformation du thorax. Remarque : Commencez par au moins 12 mouches par génotype pour assurer un nombre suffisant d’individus correctement traitées à la fin de la procédure.</li>
	<li>Transférer les carcasses dans un tube de 1,5 mL sur glace (en plaçant un maximum de 6 personnes par tube) contenant 200 µL de la solution 1. Remarque : Les carcasses ne peuvent rester dans la solution 1 pendant plus de 20 min.<ol>
<li>Pour la solution 1, mélanger les composants dans ces proportions de volume : ¼ de paraformaldéhyde à 4 %, glutaraldéhyde de 8 % ¼, ¼ 0,2 M Na2HPO4 et ¼ M 0,2 NaH2PO4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 200 µL de la solution 2 et incuber sur glace pendant 30 min.<ol>
<li>Solution 2 : Mélanger la solution 1 et OsO4 dans une proportion de 1:1 (v/v). ATTENTION : OsO4 est extrêmement toxique. Manipuler sous une hotte avec des mesures appropriées de sécurité et d’élimination.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirer tout le liquide. Ajouter 200 µL de la solution 2 et incuber sur glace pendant 1-2 h.</li>
	<li>Enlever la solution et déshydrater les échantillons à travers une série graduée de l’éthanol comme suit : une fois à 30 %, 50 %, 70 %, 90 % et deux fois en éthanol absolu ; 5 min chacun. Ajouter 1 mL d’éthanol pour couvrir les échantillons. Remarque : Une fois que le tissu est placé dans l’éthanol à 90 %, les étapes suivantes peuvent être effectuées à la température ambiante.</li>
	<li>Incuber les échantillons deux fois dans l’oxyde de propylène pendant 10 min chaque incubation. ATTENTION : L’oxyde de propylène est toxique, utilisez-le dans une hotte de laboratoire.</li>
	<li>Remplacer l’oxyde de propylène par un mélange de 1:1 (v/v) de l’oxyde de propylène et de résine époxy et incuber à température ambiante jusqu’au lendemain. ATTENTION : La résine est extrêmement toxique à l’état liquide. La résine est disponible comme un ensemble de quatre composantes (A, B, C et D).<ol>
<li>Pour la résine époxy, ajouter dans un gobelet jetable 54 g de résine (A), 44,5 g de durcisseur (B), 2,5 g d’accélérateur (C) et 10 g de plastifiant (D). Combiner tous les composants de la résine sous une hotte. Conserver la résine en aliquotes à-20 ° C (pendant 6 mois) ou à-80 ° C (pendant plusieurs années).</li>
		<li>Pour rejeter la résine, cuis au four à 70 ° C pendant 24 h parce que la résine de synthèse n’est pas toxique. Jetez toutes les solutions précédentes du groupe de métaux lourds selon les procédures internationales appropriées, parce que des solutions peuvent contenir des traces d’OsO4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remplacez le mélange précédent avec une résine 100 % et incuber les échantillons pendant 4 h.</li>
	<li>Transférer les carcasses dans des moules en plastique contenant de la résine de nouveau (une carcasse dans chaque puits du moule). Utiliser un bâton de bois aiguisé ou une aiguille pour transférer et orienter les carcasses dans les puits et laisser la résine de polymériser pendant la nuit dans un four de Pasteur à 70 ° C. Remarque : Pour assurer une orientation appropriée des carcasses pour tailler postérieure et sectionnement, les carcasses doivent mentir sur leur côté le plus long, avec la partie antérieure de la carcasse très près du bord du puits.</li>
</ol>2. coupe et découpe des blocs
<ol><li>Retirer les blocs de résine polymérisée de moules. Utiliser des lames de rasoir pour couper la résine, une forme trapézoïdale autour de la carcasse et donner une orientation appropriée dans le microtome. Démarrer tous les carcasses de sectionnement après la suture transversale pour obtenir des résultats comparables. Remarque : La section doit être perpendiculaire à l’axe antéro-postérieur des DLMs pour couper l’échantillon correctement ( Figure 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> Figure 3 . Dorsoventral sections de thoraces adultes enrobées dans la résine de la dystrophie myotonique modèle mouches. (A), la taille de l’échantillon n’était pas correct car la figure dans la partie dorsale à droite de l’image n’était pas complètement transversale aux muscles. En conséquence, les faisceaux trois musculaires sur le côté droit supérieur semblent plus gros que ceux du côté gauche. Cette erreur se traduirait par une surestimation de la zone de muscle. (B) section d’un bloc de résine correctement ajustée. Echelle : 200 µm.
<ol><li>Couper 1,5 µm coupes épaisses avec un ultramicrotome et transférer les sections dans gouttes d’eau sur diapositives gélatinisés.<ol>
<li>Obtenir les sections du segment du mésothorax, pour tous les échantillons obtenir des résultats comparables.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez les diapositives contenant les sections sur un bloc de chauffage à 70-80 ° C jusqu'à ce que le H2O s’évapore. À ce stade, les échantillons peuvent être observés avec le contraste de4 OsO (Figure 4 a).</li>
</ol>3. souillant des sections de l’IFM
<ol><li>Couvrir les sections avec assez toluidine bleu pendant environ 30 s sur le bloc de chauffage.<ol>
<li>Solution de bleu de toluidine, dissoudre 1 % de bleu de toluidine et 1 % de borax dans H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rincer avec H2O et laisser la glisse sur une plaque chaude pour faire évaporer l’eau. Répétez la coloration avec toluidine bleu si le contraste doit être amélioré (Figure 4 b).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> Figure 4 . Dorsoventral sections de thoraces adultes enrobées dans la résine avec différents contraste salissures. Les deux panneaux de montrent des images de mouches de modèle DM1 nourries avec Abp1 comme dans la Figure 2D. (A) l’image d’une section avec le contraste de4 OsO. (B) section colorée au toluidine bleue permet meilleure visualisation des faisceaux du muscle. Echelle : 200 µm.
4. montage sections IFM
<ol><li>Sécher les lames avec le bloc de chauffage jusqu'à ce que le H2O s’évapore.</li>
	<li>Mettre 1 ou 2 gouttes de milieu de montage sur les sections et mettre sur un lamelle couvre-objet. ATTENTION : Effectuer cette étape sous une hotte car le milieu de montage est toxique.</li>
</ol>5. l’acquisition d’images et de quantification de la zone de muscle
<ol><li>Prendre les images à faible grossissement afin que l’ensemble des muscles DLM est au point. Nous utilisons normalement 10 X.<ol>
<li>Pour l’analyse statistique prendre au moins 5 images serial / mouche et analyser au moins 5 mouches chacun des groupes expérimentaux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez l’image contenant les muscles entiers (Figure 5 a). Vérifier l’axe ou l’orientation de la section et de jeter les échantillons avec orientation inappropriée, ce qui fausserait les résultats (comparer les Figures 3 a / 3 b à faire la distinction entre mal et bien orientée, respectivement).</li>
	<li>ImageJ logiciel permet de sélectionner une zone (en pixels) contenant uniquement les DLMs (Figure 5 a/5B). Comparaison entre les différents groupes expérimentaux, la zone de référence à utiliser serait toujours la mouche avec des muscles plus gros. Dans toutes les images des différents génotypes de comparer, sélectionner une zone contenant DLMs de dimensions égales à la surface de référence (Figure 5 b).</li>
	<li>Binarize les images avec la commande Image-J : Processus/binaire/Make binaire et supprimer les zones ou les pixels qui ne correspondent pas aux muscles d’intérêt (Figure 5).<ol>
<li>Dans le cas où artéfactuelles taches noires apparaissent dans les zones autres que les muscles, les supprimer avec la commande des outils de dessin et sélectionnez le symbole de la gomme à effacer.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> Figure 5 . Procédure d’analyse pour la détermination de zone musculaire d’image. (A) section transversale du modèle de la dystrophie myotonique de type 1 fly thorax avec un rectangle contenant le DLM. B zone sélectionnée avec seulement les muscles de vol indirect et l’intestin (*). Image (C) Binarized. Les zones noires correspondent aux muscles d’intérêt. L’intestin a été effacé pour une quantification précise de la zone de muscle. Echelle : 200 µm.
<ol start="5"><li>Quantifier le pourcentage de pixels correspondant au tissu musculaire (pixels noirs) sur total avec la commande : Analyse/mesure et sélectionnez l' option fraction de la région. Ce pourcentage de superficie est une estimation de la masse musculaire de DLM de chaque volée.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li>
<li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+%28DLM%29+of+Drosophila%3A+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/00atlas.htm">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li>
<li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Platin+Met+Rev%22%5BJournal%5D)">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li>
<li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1165/">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li>
<li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li>
<li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscleblind%2C+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li>
<li>García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li>
<li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184(2010).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223(2014).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Il a été démontré que les Drosophila melanogaster est un modèle utile pour étudier les maladies neuromusculaires humaines7,10,11, y compris la dystrophie myotonique, qui se caractérisent par l’apparition de atrophie musculaire. Le protocole présenté ici est un outil utile pour quantifier la dégénérescence musculaire causée par l’apparition ou la progression d’une maladie particulière à un modèle de mouche. Par exemple, ...

Le thorax de la mouche à fruit contient deux classes différentes de muscles du vol, qui sont distinctes sur le plan fonctionnel, anatomiquement et physiologiquement. Ces muscles sont : les muscles de vol indirect (IFM), qui sont composées de dorso-longitudinal (DLM) et muscles dorso-ventral (DVM) (Figure 1) et le vol synchrone contrôlent muscles1,2. Ces muscles génèrent ensemble la puissance élevée requise pour vol. La taille, la distribution et la disposition rostro-caudal du SIFM permettent une orientation facile pour coupe transversale3 (Figure 2 a). Pour cette raison, nous avons sélectionné ces muscles pour étudier une atrophie musculaire chez Drosophila melanogaster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> Figure 1. Diagramme du thorax de la drosophile montrant les muscles de vol indirect (SIFM) arrangement. (À gauche) représente une vue latérale et (à droite) représente une coupe transversale du thorax. Le SIGF se composent des muscles Dorso-longitudinal (DLM) (en rouge) et le Dorso-ventral (DVM) les muscles (en vert).
Préservation de la structure des tissus et la maîtrise de l’orientation de l’axe dorso-ventral de coupes histologiques sont essentielles pour assurer une évaluation correcte des transversale du muscle. Afin de préserver la structure du muscle, nous avons utilisé un mélange de fixation adapté de Tomlinson et al. 4 . En outre, parce que les muscles sont les tissus internes, l’imperméabilité de l’exosquelette de drosophileest un problème comme la fixation des mélanges ne peut pas pénétrer dans les tissus de cible. Pour contourner ce problème, nous avons supprimé la tête de la mouche, les jambes, les ailes et les deux derniers segments de l’abdomen pour créer des trous qui ont permis le mélange de fixation entrer. Dans le cadre du protocole de fixation que nous comprenait un traitement avec le tétroxyde d’osmium (OsO4)5, qui est largement utilisé en raison de sa capacité à fixer les graisses, y compris les triglycérides. OsO4 conserve la plupart des structures extrêmement bien, surtout au niveau cytologique et en même temps offre un contraste de l’image. Après fixation, Drosophila thoraces ont été incorporés dans la résine pour transversale semi-mince sectionnement (1,5 µm). Pour un contraste amélioré, le tissu peut être plus coloré avec toluidine bleu. Images de thoraces complets ont été prises à 10 X et zone musculaire a été quantifié par binarizing des images (de dimensions égales) et de quantifier le pourcentage de pixels correspondant au tissu musculaire (pixels noirs) sur total, avec les logiciels ImageJ.
Modification sur les mélanges de préparation et de la fixation de tissu, comme l’augmentation de la concentration de la solution4 et glutaraldéhyde OsO, a présenté dans le présent protocole, autorisée unique préservation du tissu musculaire. C’est parce que le protocole permet d’éviter la dégradation et la déformation des tissus, rendant l’analyse postérieure des échantillons plus fiables même dans des conditions très atrophiques associées à des maladies dégénératives neuromusculaires comme la dystrophie myotonique (DM). Dans sa forme la plus commune, DM de type 1, cette maladie génétique rare est provoquée par élargi CUG répétitions dans les transcriptions de la protéine kinase de la dystrophie myotonique (HEPATO). Mutant HEPATO RNA regroupe des foyers de ribonuclear forme qui séquestrent les protéines de liaison à l’ARN nucléaires comme Muscleblind (MBNL1-3 ; MUSCLEBLIND (Mbl) chez la drosophile)6. Nous avons généré un modèle drosophile de dystrophie myotonique en exprimant 250 répétitions CTG sous le promoteur de la chaîne lourde de myosine musculaire (Mhc-Gal4). Les mouches de modèle ont été incapables de voler avec un phénotype typique « qui s’est tenue vers le haut les ailes » et avaient musculaire grave atrophie dans leur SIFM (Figure 2 b). Des études antérieures effectuées dans notre laboratoire ont montré que la détermination de l’aire de muscle du SIGF est une méthode fiable pour quantifier les effets de différents modificateurs chimiques ou génétiques de l’atrophie musculaire dans ces mouches de type7. Ainsi, la surexpression de la Mbl isoforme C chez les mouches exprimant la CTG 250 se répète dans le muscle, atteint un sauvetage de la zone de muscle, comme Mbl épuisement par séquestration est le facteur déclenchant en DM1 pathogenèse8 (Figure 2). Zone de muscle a été également secouru après que alimentant le modèle DM vole avec Abp1, un hexapeptide avec anti-DM1 éprouvée activité9 (Figure 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> Figure 2. Quantification des sections dorsoventral de thoraces adultes enrobées dans la résine. Muscles de vol Indirect (A-D) de Drosophila melanogaster avec les génotypes pertinentes indiquées. (A) contrôle les mouches (yw). (B) l’expression de 250 non-codantes CTG se répète dans le muscle (UAS-CTG(250)x) a entraîné une réduction de la zone musculaire DLMs comparativement aux mouches de contrôle. (C) ce phénotype d’atrophie musculaire a été secouru par la surexpression de la Muscleblind (MblC) (SAMU-CTG (250) x SAMU-MblC) et (D) alimentant les mouches de modèle avec l’hexapeptide Abp1 (SAMU-CTG (250) x Abp1). Dans toutes les images, la face dorsale est sur le dessus. Transgènes ont été conduits à la musculaire à l’aide d’un promoteur de chaîne lourde de myosine (Mhc)-Gal4. (E) quantification du pourcentage de la surface du muscle par rapport à le mouches de contrôle a confirmé que les différences étaient significatives. L’histogramme montre moyen ± S.E.M. **p< 0,01 et * p < 0,05 (Student´s t-test). Echelle : 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
La méthode mentionnée ici sera d’intérêt pour les chercheurs en se concentrant sur le développement musculaire, entretien et vieillissement, la maladie et le dépistage des drogues car il fournit des informations fiables sur comment le tissu musculaire répond à des facteurs endogènes et externes.

<table><tbody><tr><td>Logiciel image-J</td> National <td>Institutes of Health</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>Leica UC6</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>Leica MZ6</td><td>Technique en champ clair.</td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71970</td><td>Plusieurs fournisseurs alternatifs existent.</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>World Precision World</td><td>14003</td><td>Plusieurs fournisseurs alternatifs existent.</td></tr><tr><td>Incorporation de moules</td><td>Microscopie Electronique Sciences</td><td>70900</td><td>Plusieurs fournisseurs alternatifs existent.</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>fluka (Sigma)</td><td>49624</td><td>Toxique.</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>Polyscience</td><td>0972A</td><td>Extrêmement toxique.</td></tr><tr><td>Oxyde de propylène</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82320-250ML</td><td>Extrêmement toxique.</td></tr><tr><td>résine (Durcupan)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44611-44614</td><td>Cancérogène lorsqu’elle n’est pas polymérisée.</td></tr><tr><td>Bleu toluidine</td><td>Panreac</td><td>251176</td><td>Toxique.</td></tr><tr><td>Mountant Medium (DPX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44581</td><td>Dangereux.</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Nocif.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Panreac</td><td>122507</td><td>dilution de 0,2 M.</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Panreac</td><td>121677</td><td>dilution de 0,2 M.</td></tr><tr><td>Borax</td><td>Panreac</td><td>3052</td><td>Toxique.</td></tr></tbody></table>

détermination de zone optique transversale musculaire des muscles de vol indirect adulte de drosophila melanogaster

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Masse musculaire, perdre, connu comme l’atrophie musculaire, est un phénotype commun dans des modèles de drosophile de maladies neuromusculaires. Nous avons utilisé les muscles de vol indirect (SIFM) de mouches, spécifiquement les muscles dorso-longitudinal (DLM), comme l’expérimental objet mesure le phénotype atrophique provoqué par des causes génétiques différentes. Dans ce protocole, nous décrivons comment incorporer des muscles thorax mouche pour la coupe fine semi, comment obtenir un bon contraste entre le muscle et le tissu environnant et comment traiter les images de microscope optique pour acquisition semi-automatique des données quantifiables et analyse. Nous décrivons trois applications spécifiques de l’oléoduc méthodologique. Tout d’abord, nous montrons comment la méthode peut être appliquée pour quantifier la dégénérescence musculaire dans un modèle de mouche de dystrophie myotonique ; Deuxièmement, mesure de la surface transversale de muscle peut aider à identifier les gènes qui favoriser ou empêchent l’atrophie musculaire et/ou la dégénérescence musculaire ; en troisième lieu, le présent protocole peut être appliqué pour déterminer si un composé du candidat est en mesure de modifier de façon significative un phénotype donné d’atrophique induit par une mutation pathogèneou par un déclencheur de l’environnement.

Afin de quantifier si la surexpression de MblC ou l’administration d’Abp1 avait eu aucun effet dans le phénotype atrophique du modèle mouche dystrophie myotonique, nous nous sommes concentrés sur les DLMs, qui font partie du SIFM (Figure 1). Nous avons déterminé que le modèle vole, qui expriment 250 non codantes CTG répétitions tout au long de la musculature entraînée par le promoteur de la chaîne lourde de la myosine (Mhc)-Gal4, présentaient une réd...

Nous présentons une méthode pour quantifier la zone musculaire, qui est une méthode indirecte pour déterminer la masse musculaire chez les adultes de la drosophile . Nous avons démontré que l’application de notre méthodologie en analysant le vol indirect les muscles dans un modèle drosophile de la maladie de la dystrophie myotonique.

Détermination de zone optique transversale musculaire des Muscles de vol Indirect adulte de Drosophila Melanogaster

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier la surface musculaire dans les muscles adultes de Drosophila afin de quantifier indirectement la masse musculaire et de mesurer correctement la génération ou l'atrophie musculaire. À cet effet, nous nous sommes concentrés sur les muscles dorsolongitudinaux en raison de leur taille, de leur distribution et également du faible nombre de muscles présents à cette position, ce qui facilite l'orientation pour des sections transversales. Première étape : fixation et inclusion en résine.La première étape de la procédure consiste à anesthésier les mouches au CO₂, puis, à l’aide de ciseaux et de pinces, à retirer les pattes, les ailes et la partie terminale de l’abdomen. Ensuite, transférer délicatement les carcasses, afin d’éviter toute déformation du thorax, dans un tube de un virgule cinq millilitre placé sur de la glace, en plaçant au maximum six individus par tube contenant 200 microlitres de solution un. Les carcasses ne doivent pas rester dans cette solution plus de 20 minutes.Enfin, ajoutez 200 microlitres de la solution deux et incubez sur de la glace pendant 30 minutes. Après l'incubation, retirez tout le liquide, ajoutez 200 microlitres de la solution deux, puis incubez les carcasses sur de la glace pendant une à deux heures. L'étape suivante consiste à éliminer la solution et à déshydrater les échantillons à l'aide d'une série d'éthanol progressive.Incuber les échantillons deux fois dans de l'oxyde de propylène pendant dix minutes par incubation. Ensuite, remplacer l'oxyde de propylène par un mélange de 500 microlitres de résine et 500 microlitres d'oxyde de propylène, puis incuber les échantillons à température ambiante toute la nuit. Le jour suivant, remplacer le mélange par de la résine à 100 % et incuber les échantillons pendant quatre heures.Ensuite, transférez les carcasses dans des moules en plastique contenant de la résine fraîche, en veillant à placer une carcasse dans chaque alvéole du moule. À l’aide d’un bâtonnet en bois, orientez les carcasses dans les alvéoles et laissez la résine polymériser toute la nuit dans une étuve de Pasteur à 70 degrés Celsius. Pour éliminer la résine, faites-la cuire à 70 degrés Celsius pendant 24 heures, car la résine solidifiée et cuite n’est pas toxique.Deuxièmement, élagage et sectionnement des blocs. À l'aide de lames de rasoir, éliminer la résine et former une forme trapézoïdale entourant le cadavre afin d'obtenir l'orientation appropriée dans le microtome. Vérifier au microscope que les muscles sont parfaitement orientés.Après cela, couper des sections de 1,5 µm d'épaisseur à l'aide d'un ultramicrotome, puis transférer les sections dans des gouttes d'eau sur des lames recouvertes de gélatine. Enfin, placer les lames contenant les sections sur un bloc chauffant à 70 à 80 °C jusqu'à évaporation complète de l'eau. Trois, coloration des sections de MFI.Couvrir les sections avec du bleu de méthylène toluidine pendant environ 30 secondes sur le bloc chauffant. Ensuite, rincer par plusieurs changements d'eau et laisser les lames sur une plaque tiède afin d'évaporer l'eau. Quatre, montage des sections de MFI.En prenant les lames, déposez une ou deux gouttes de milieu de montage sur les sections et posez une lame couvre-objet longue. Cinq, acquisition des images et quantification de la surface musculaire. Utilisez le logiciel ImageJ pour sélectionner une zone contenant uniquement les DLM.En prenant comme témoin les dimensions de l'image de la drosophile présentant la plus grande aire musculaire, affinez les images et supprimez les zones, ou pixels, qui ne correspondent pas aux muscles d'intérêt. Quantifiez le pourcentage de pixels correspondant au tissu musculaire par rapport au total à l'aide de la commande analyser, mesurer, puis sélectionnez l'option fraction de surface. Ce pourcentage de surface constitue une estimation de la masse musculaire des muscles dorsolongitudinaux (DLM) de chaque drosophile.Résultats représentatifs. Nous avons déterminé que les mouches modèles, qui expriment 250 répétitions non codantes CTG dans l'ensemble de la musculature, contrôlées par le promoteur de la chaîne lourde de la myosine, MhC Gal quatre, présentaient une réduction de 50 pour cent de la surface musculaire par rapport aux mouches témoins. En revanche, la coexpression de muscle blind C et des répétitions CTG étendues avec le même activateur supprimait fortement ce phénotype, et la surface musculaire en coupe transversale atteignait 70 pour cent de celle des mouches témoins.L'administration du hexapeptide Abp1 dans le milieu nutritif a de manière similaire supprimé le phénotype atrophique, et les mouches modèles ayant absorbé le composé présentaient environ 60 pour cent de la surface musculaire normale, au lieu de 50 pour cent, valeur typique des mouches DF1. Conclusions. Le protocole présenté ici constitue un outil utile pour quantifier la dégénérescence musculaire provoquée par l'apparition ou la progression d'une maladie particulière dans un modèle de mouche. Enfin, cette méthode est également optimisée pour détecter de faibles différences de surface musculaire, ou même pour quantifier la surface de différentes structures telles que les néphrocytes.Merci d'avoir regardé.

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