Name: Induction de paralysie et de lésion du système visuel chez la souris par le particulier de cellules T pour Neuromyélite optique autoantigènes Aquaporin-4 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Découvrez comment induire une maladie auto-immune du SNC par transfert de cellules T spécifiques de l'aquaporine-4 chez la souris et surveiller les lésions rétiniennes par tomographie en cohérence optique.

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Soutien a été fourni aux S.S.Z. par le National Institute of Health (AI073737 RO1 et RO1 NS092835-01), National Multiple Sclerosis Society (4768 RG, RG 5179 et RG 5180), Fondation Maisin et Guthy Jackson Charitable Foundation.

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Sagan S.A., A. Cruz-Herranz, C.M. Spencer, P.P. Ho, L. Steinman, A.J. Green et R.A. Sobel ne rapportent aucune divulgation. S.S. Zamvil est rédacteur en chef adjoint de neurologie, neuro-immunologie et neuro-inflammation et est un membre du Conseil consultatif de la société internationale de neuro-immunologie. Il a siégé au Comité de rédaction du Journal of Clinical Investigation, The Journal of Immunology et The Journal of Neurological Scienceset a été membre fondateur du Comité d’étude des instituts nationaux de la subvention neuro-immunologie clinique de la santé (NIH) et les tumeurs de cerveau (CNBT) étude de section et la société nationale de sclérose en plaques (SMN). Il a servi comme consultant et a reçu des honoraires de Biogen-Idec-EMD Serono, Genzyme, Novartis, Roche/Genentech et Teva Pharmaceuticals, Inc. et a servi ou siège données sécurité surveillance conseils pour Lilly, BioMS, Teva et Opexa Therapeutics. Actuellement, Dr Zamvil bénéficie du soutien de subvention de recherche du NIH, SMN, la Fondation de Maisin, Biogen et Celgene.

AQP4 a été identifié comme la principale cible de NMO IgG en 20053. Ensuite, on a reconnu qu’il serait important d’établir un modèle animal AQP4 ciblée de l’auto-immunité CNS. Un tel modèle pourrait être utile d’étudier comment les cellules T spécifiques AQP4 et B participent à l’élaboration de l’auto-immunité CNS et pour tester la thérapeutique candidat NMO. Bien que l’identification des épitopes chez les souris de type sauvage a été signalée en 201013, lymphocytes T répondant à ces épitopes des lymphocytes de T AQP4-spécifiques ne cause pas de maladie clinique ou histologique14,17. L’incapacité de générer un modèle d’auto-immunité CNS basée sur la réactivité immunitaire à AQP4 est resté une énigme jusqu’en 2015 quand Jones, et al. 25 a découvert que donneur AQP4 p135-153-amorcé des cellules de T de AQP4- / - souris étaient susceptibles de provoquer des signes cliniques et histologiques de l’auto-immunité CNS dans souris WT. D’intérêt, AQP4 p135-153 est prédit pour lier le CMH II (I-A,b) avec une affinité élevée17. Qu’un seul autre AQP4 séquence d’acides aminés, 201-220, est censée pour lier I-Ab avec une affinité élevée similaire. En effet, nous avons observé que AQP4 p135-153 et p201-220 fois provoquer la prolifération robuste en AQP4- / -, mais pas de WT, souris. Ici, nous avons montré comment on peut isoler et développez encephalitogenic AQP4 Th17 NKT p135-153 - et p201-220-réactif de AQP4- / - souris. Lorsque transférés dans les destinataires souris WT, cellules Th17 réactifs AQP4 donneur induit par paralysie, qui était accompagnée par des infiltrats de cellules mononucléées dans la moelle épinière et du nerf optique. Lésion du système visuel afférente est bien connue chez les patients séropositifs AQP4 NMOSD26. Ici, nous avons observé que le nerf optique inflammation induite par les cellules AQP4-réactive et Th17 MOG-réactive était distincte. Tandis que les cellules Th17 AQP4 spécifique induite perineuritis optique, cellules Th17 MOG spécifique induite par névrite optique sévère. Nous avons également décrit les techniques utilisées pour surveiller le nerf optique inflammation induite par les cellules T MOG spécifiques et des AQP4 spécifiques par série OCT. Autres chercheurs devraient maintenant être en mesure d’appliquer les protocoles décrits ici pour faire avancer leurs propres études axées sur les mécanismes pathogéniques de l’ATCA.
On peut facilement éviter trois écueils potentiels dans notre protocole. Premier transfert adoptif de ATCA requiert l’utilisation des cellules T spécifiques AQP4 de AQP4- / - souris de donateurs. Plus précisément, cellules donneuses WT AQP4 p135-153-specific T n’a pas causé ATCA dans destinataires souris WT. Deuxièmement, il est important d’effectuer une « analyse de l’eau » avec une goutte de l’émulsion de peptide/CFA avant la vaccination des AQP4- / - souris (protocole étape 1.5). L’émulsion doit se disperse pas dans l’eau lorsqu’il est adapté pour injection s.c.. Si l’émulsion se disperse, on doit mélanger l’émulsion une fois de plus, refroidir à nouveau et répéter l’analyse de l’eau. Enfin, activés CNS cellules T spécifiques de l’antigène induisent l’auto-immunité CNS plus efficacement que les cellules T de repos. On devrait inspecter visuellement ces cultures en microscopie avant leur récolte les cellules de T de donateurs pour transfert adoptif. Cellules à division rapide peuvent former des grappes, qui sont facilement identifiables. Aussi, lorsque les cultures contiennent de nombreux lymphocytes T activés, les médias peuvent transition du rose à l’orange ou même au jaune, en raison de la diminution du pH. On peut aussi évaluer activation de cellules de ganglion AQP4-amorcé T du donneur pour la prolifération par l’incorporation de 3H-thymidine, tel que décrit à l’étape 3 de protocole.
Notre découverte que les deux épitopes pathogènes AQP4 T (1) devraient lier MHC II avec une haute affinité et (2) susciter les réponses prolifératives puissantes dans AQP4- / -, mais pas de WT, souris suggèrent que les cellules T ciblant ces déterminants sont normalement contrôlée par une sélection négative thymique17. Les répertoires TCR utilisés pour la reconnaissance des AQP4 p135-153 et p201-220 AQP4- / - souris sont unique (Figure 2), qui est également compatible avec délétion clonale médiée par les cellules épithéliales thymiques médullaires. Autres mécanismes tolérogène peuvent normalement empêcher les réponses immunitaires à AQP4. À la suite de notre rapport initial17, un autre groupe a également démontré que AQP4 p201-220 contienne un encephalitogenic déterminant de lymphocytes T27. Quelle souris α/β (TCRα- / -) de lymphocytes T-déficientes ont été reconstitués avec AQP4- / - CD4+ T cellules, il a été possible d’obtenir une réponse des lymphocytes T encephalitogenic AQP4 spécifiques, mais pas une réponse humorale AQP4 spécifiques, ce qui implique que, dans Des souris WT AQP4 des lymphocytes B réponses, semblables aux lymphocytes T spécifiques AQP4, font l’objet de sélection négative. En effet, perte des axones de la moelle épinière et les CGR, qui n’a pas observé chez des souris WT avec ATCA induite par les cellules T spécifiques AQP4 seuls, peut exiger la participation de pathogènes anticorps AQP4 spécifiques. Il est clair que les modèles murins d’auto-immunité CNS AQP4 ciblées continuera d’évoluer comme nous l’apprend davantage quant aux mécanismes tolérogène contrôler normalement l’immunité AQP4 spécifique des lymphocytes T et les lymphocytes B.
Autres modèles de l’auto-immunité CNS AQP4 ciblées sont également étant développés6,16,28,29,30. Chacun d’eux peut offrent des avantages pour l’étude des aspects particuliers qui se rapportent à la pathogenèse NMO. Cellules T AQP4-spécifiques ont été identifiés dans WT rats6,16,29. Ces cellules T spécifiques AQP4 a provoqué des modifications histologiques de l’auto-immunité CNS mais, semblables aux observations chez des souris, cellules T spécifiques AQP4 WT rat ne provoquent pas des signes de la maladie clinique. Par conséquent, les mécanismes de tolérance limitant les cellules T et cellules B AQP4 spécifique des réponses immunitaires chez les souris WT ne fonctionnent également chez les rats. Malgré tout, il ne faut pas sous-estimer la puissance à l’aide de modèles murins pour l’étude des mécanismes impliqués dans la pathogenèse de la maladie. La richesse des knock out, transgénique et souris journaliste peut être avantageuse. Il faut aussi reconnaître que plusieurs découvertes fondamentales dans l’auto-immunité ont été faites à l’aide de modèles de souris EAE. Par exemple, démonstration, cette cellule T clones spécifiques pour un self-antigène peut médier maladie auto-immune31,32, identification du rôle des lymphocytes T costimulation en auto-immunité33 et la découverte de la voie de développement pour Th17 différenciation34 première description à l’aide de modèles de souris EAE. En utilisant le modèle de souris de l’ATCA que nous avons élaborée, un a maintenant les moyens d’étudier le développement et la réglementation des pathogènes spécifiques AQP4 immunitaire réponses in vivo, qui devrait fournir des renseignements importants associés à la pathogenèse NMO.

Neuromyélite optique (NMO) est une système nerveux central (SNC) inflammatoire démyélinisante chronique maladie auto-immune qui provoque des épisodes récurrents de paralysie et perte visuelle conduisant à une déficience neurologique permanente1. NMO est actuellement considérée comme essentiellement une maladie auto-immune humorale2 car elle est associée à des anticorps (Igs) ciblant aquaporin-4 (AQP4), un canal d’eau exprimé abondamment les astrocytes3,4. Toutefois, l’inflammation du SNC est une condition préalable à l’entrée de la CNS de Ig AQP45,6. Ainsi, il n’a pas été possible d’établir un modèle de NMO par transfert d’Ig anti-AQP4 seul. Les conclusions que (1) pathogènes spécifiques AQP4 Igs chez les patients NMO sont IgG11,2, une Ig dépendant des lymphocytes T, lymphocytes T de la sous-classe7 (2) sont identifiés dans NMO lésions8,,9 (3) NMO est associée avec certains gènes du CMH II (p. ex. HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10et (4) pro-inflammatoires DR AQP4-réactif-Th17 restreint cellules sont développées du NMO patients11,12 tous indiquent que les cellules T spécifiques AQP4 ont un rôle clé dans la pathogenèse NMO. Ainsi, il est important de développer des modèles animaux pour déterminer comment les lymphocytes T spécifiques AQP4 pourraient contribuer à NMO pathogenèse.
Il y a plusieurs années plusieurs épitopes de AQP4 T ont été identifiés dans le type sauvage (WT) souris13,rats et14 15. Alors qu’il a été observé que les cellules T AQP4-réactive pouvaient induire opticospinal inflammation chez naïve des rats destinataire15,16, des signes cliniques de maladie du SNC n’ont pas observés. De même, directement l’immunisation des souris WT avec peptides contenant des épitopes de cellules AQP4 T14,17, ou transfert de cellules pro-inflammatoires T ciblant ces déterminants17, n’a pas causé de signes cliniques ou histologiques preuve de l’auto-immunité CNS.
Récemment, il a été observé que l’immunisation de souris C57BL/6 AQP4-déficientes (AQP4- / -) avec AQP4 peptide (p) 135-153 ou p201-220, deux déterminants prédites pour lier le CMH II (I-A,b) avec une affinité élevée18, a suscité de fortes CD4 + Des lymphocytes T réponses17. En revanche, ces deux peptides obtenue seulement modestes réponses prolifératives chez les souris WT. En outre, le répertoire de récepteur (TCR) de lymphocytes T utilisé pour la reconnaissance de ces déterminants par les cellules de T de AQP4- / - souris était unique. Collectivement, ces résultats indiquent que reconnaissance des lymphocytes T de AQP4 est régulée par une sélection négative du thymus. AQP4 p135-153 ou p201-220-spécifique des cellules Th17 de souris de donateurs- / - AQP4 induite par paralysie dans presque 100 % des bénéficiaires souris naïves WT ; Ceci a été associé d’opticospinal des infiltrats de lymphocytes T, les lymphocytes B et les monocytes. Tomographie par cohérence de série opticospinal (OCT) démontrée du système visuel dynamique. Souris avec auto-immunité induite par des lymphocytes T de CNS AQP4 ciblées (ATCA) extraite de paralysie et de lésion du système visuel. Contrairement aux EAE induite par la myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG) spécifique du p35-55 cellules T, qui a conduit à la maladie clinique persistante, ATCA induite par les cellules T seuls n’était pas associée à une perte axonale ou réduction des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR). Nos résultats ont clairement démontré qu’il existe de multiples déterminants de cellules T AQP4 pathogènes. Ce nouveau modèle de ATCA est utile pour l’étude des mécanismes qui contrôlent le développement des cellules T spécifiques AQP4 pathogènes, apprendre comment ces cellules induisent inflammation du SNC et comment ils peuvent coopérer avec cellules spécifiques AQP4 B et anticorps pour promouvoir la pathogenèse NMO .
Dans le présent rapport, nous décrivons les protocoles utilisés pour induire et évaluer l’ATCA induite par des lymphocytes T. Nous commençons par les techniques utilisées pour la vaccination, de la culture de cellules de T et de polarisation Th17 pour générer des cellules T spécifiques AQP4 pathogènes, analyse en cytométrie en flux pour confirmer la polarisation et transfert adoptif de ces cellules T. Nous décrivons ensuite les méthodes utilisées pour évaluer la maladie clinique et histologique et l’utilisation de série OCT pour surveiller la lésion du système visuel chez les bénéficiaires.

<table><tbody><tr><td>M. tuberculosis H37Ra</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>Dessicated, killed M. tuberculosis</td></tr><tr><td>Incomplete Adjuvant de Freund</td><td>BD Difco</td><td>263910</td><td></td></tr><tr><td>AQP4 peptide p135-153</td><td>Genemed</td><td>Séquence</td><td>peptidique de synthèse personnalisée : LVTPPSVVGGLGVTMVHGN</td></tr><tr><td>peptide AQP4 p201-220</td><td>Genemed</td><td>Séquence peptidique de synthèse personnalisée : HLFAINYTGASMNPARSFGP</td><td></td></tr><tr><td>PEPTIDE MOG p35-55</td><td>Genemed / Auspep</td><td>Synthèse personnalisée</td><td>Séquence peptidique : MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td></tr><tr><td>3-way Stopcock</td><td>Kimble</td><td>420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovin Serum (caractérisé)</td><td>GE Soins de santé Sciences de la vie</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>souris recombinante IL-23</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>1887-ML</td><td></td></tr><tr><td>Souris Recombinante IL-6</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante IL-12</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>419-ML</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine [Methyl-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET027</td><td></td></tr><tr><td>Tapis filtrants en fibre de verre</td><td>PerkinElmer</td><td>1450-421</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris</td><td>eBioscience (Affymetrix)</td><td>[divers]</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris TCR V&beta ; Panel de dépistage</td><td>BD Biosciences</td><td>557004</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Teinture à cellules mortes fixable</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>[divers]</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (16 %)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Kit de solutions de fixation/perméabilisation avec GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Iomomycine (sel de calcium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Toxine coqueluche de B. pertussis</td><td>List Biological Laboratories</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>10 % Formalin</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique à débit variable</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td></td></tr><tr><td>Coussinets de biopsie en mousse, rectangulaires</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>Isothésie (isoflurane, USP)</td><td>Henry Schein Santé animale</td><td>050033</td><td>NDC : 11695-0500-2</td></tr><tr><td>Solution ophtalmique de tropicamide, USP (1 %)</td><td>Akorn</td><td></td><td>NDC : 17478-102-12</td></tr><tr><td>Plateforme d’imagerie diagnostique Spectralis</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

induction de paralysie et de lésion du système visuel chez la souris par le particulier de cellules t pour neuromyélite optique autoantigènes aquaporin-4

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

S’il est reconnu que l’aquaporine-4 (AQP4)-des anticorps et des cellules T spécifiques participent à la pathogenèse de la Neuromyélite optique (NMO), une maladie démyélinisante auto-immune humaines du système nerveux central (CNS), la création d’un modèle AQP4 ciblées à la fois les manifestations cliniques et histologiques de l’auto-immunité CNS s’est avérée difficile. Immunisation des souris de type sauvage (WT) avec des peptides AQP4 a provoqué la prolifération des cellules T, bien que ces cellules T pourraient transférer pas la maladie pour les bénéficiaires souris naïves. Récemment, deux nouveaux épitopes T AQP4, peptide (p) 135-153 et p201-220, ont été identifiés lors de l’étude des réponses immunitaires à AQP4 chez les souris déficientes en AQP4 (AQP4- / -), suggérant la réactivité des lymphocytes T de ces épitopes est normalement contrôlée par thymique sélection négative. AQP4- / - Th17 polarisé des lymphocytes T sensibilisés p135-153 ou p201-220 induit une paralysie destinataires souris WT, qui était associé à prédominance méningées inflammation de la moelle épinière et les nerfs optiques. Nerfs optiques environnantes de l’inflammation et l’implication des couches rétiniennes internes (IRL) sont manifestent par des changements dans la tomographie à cohérence optique série (OCT). Ici, nous illustrons les approches utilisées pour créer ce nouveau modèle in vivo de l’auto-immunité CNS AQP4 ciblées (ATCA), qui peut maintenant être employée pour étudier les mécanismes qui permettent le développement de cellules T spécifiques AQP4 pathogènes et comment ils peuvent coopérer avec B cellules dans la pathogenèse NMO.

Dans ce protocole, nous avons utilisé les cellules donneuses T de C57BL/6 AQP4- / - souris. Vaccination sous-cutanée de ces souris avec AQP4 p135-153 ou p201-220, qui contiennent des épitopes T pathogènes, a suscité de fort proliférative lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques de drainage (Figure 1), alors que ces deux peptides induit beaucoup plus faible des lymphocytes T prolifération de souris WT. En comparaison, la vaccination par AQP4 p91-110, contenant un non pathogène AQP4 T cellule déterminant13ou MOG p35-55, un peptide de la myéline qui active les cellules T qui causent l’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE)22,23 ,24, induite par le même ordre de grandeur de la prolifération des cellules T dans AQP4- / - et souris WT. Analyse de l’utilisation de TCR par coloration de cytométrie de flux pour de Vβ individuels ou familles Vβ, a démontré que p135-153 et p201-220-T lymphocytes spécifiques de AQP4- / - souris utilisées unique répertoire TCR. Hyper-prolifération sélective de AQP4 p135-153 et p201-220 en AQP4- / - souris, ainsi que l’utilisation unique de la TCR (Figure 2), a indiqué que lymphocytes T pathogènes à ces déterminants est normalement réglé par négatif du thymus sélection, soulignant l’importance pour l’utilisation de cellules de donneur T AQP4- / - dans le présent protocole.
Avant transfert adoptif pour l’induction de l’ATCA, a cultivé des cellules de ganglion lymphatique de souris AQP4 peptide in vitro dans des conditions polarisation Th17 ou Th1 pendant trois jours. La mesure de la polarisation du donneur CD4+ T cellules a été confirmé par cytokine intracellulaire (ICS) de coloration et mesurée par cytométrie en flux (Figure 3). Les bénéficiaires souris naïves ont injecté par voie intraveineuse avec cellules de T de 2 x 107 donneur AQP4 peptide spécifique. Après environ six jours, presque 100 % des souris bénéficiaires a développé des signes cliniques d’une maladie auto-immune CNS, y compris la paralysie de queue et le membre postérieur molle (Figure 4). Polarisation Th17 de cellules T spécifiques AQP4 induit une maladie clinique plus sévère que les cellules de polarisation Th1 spécifiques AQP4 T. Une souris représentative qui a reçu AQP4-peptide-specific Th17 et développé la paralysie complète des membres postérieurs (paraplégie) est sur la vidéo 1. Contrairement aux souris qui développent EAE après administration des cellules Th17 MOG spécifiques, souris destinataires extraite des cliniques de la maladie induite par les cellules Th17 AQP4 spécifiques. En ce qui concerne les EAE induite par des cellules Th17 de MOG spécifique du p35-55, cliniques de la maladie induite par AQP4 p135-153-spécifiques ou cellules Th17 p201-220-spécifiques a été associée à l’infiltration de cellules mononucléées dans le parenchyme de la CNS et des méninges (Figure 5). Les lésions sont plus abondantes dans les méninges que dans le parenchyme d’auto-immunité CNS induite par les cellules Th17 AQP4 spécifiques.
MOG spécifiques Th17 cellules deux inflammation induite nerf optique, qui se caractérise par la présence de cellules mononucléaires et implication du nerf optique a été démontrée par une évaluation histologique et de serial OCT. AQP4 spécifiques. Alors que les cellules Th17 AQP4 spécifique a provoqué perineuritis optique, cellules Th17 MOG spécifique induite par névrite optique grave (Figure 5). À l’aide de série OCT, inflammation du nerf optique était évidente par le gonflement et augmente l’épaisseur de la couche rétinienne interne (IRL) pour les cliniques de la maladie induite par la AQP4 spécifiques ou des cellules Th17 MOG spécifique (Figure 6). D’auto-immunité induite par le AQP4 Th17 CNS, épaisseur IRL revient à la base comme souris extraite des cliniques de la maladie. En revanche, la persistance de l’EAE induite par le MOG spécifiques Th17 a correspondu avec l’IRL éclaircie et, comme nous avons démontré précédemment17, a été associée à la perte des cellules ganglionnaires rétiniennes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig1.jpg"> 
Figure 1 : AQP4 p135-153 et p201-220 induire la prolifération des cellules de T robuste en AQP4- / - souris, mais pas les souris WT. Souris ont été immunisées s.c. avec les peptides indiquées en CFA. Onze jours plus tard, les ganglions lymphatiques ont été enlevés et puis cultivés soit aucun antigène, ou avec le peptide utilisés pour l’immunisation. La prolifération a été mesurée par l’incorporation de 3H-thymidine (moyenne ± SEM, représentant de 5 expériences). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig2.jpg"> 
Figure 2 : Les cellules T AQP4 spécifiques des AQP4- / - souris utilisent unique répertoire TCR. AQP4- / - et souris WT ont été immunisés avec les peptides indiquées. Onze jours plus tard, les ganglions lymphatiques ont été enlevés et cultivées avec peptides utilisés pour l’immunisation. Les cellules ont été récoltées. Utilisation de TCR Vβ a été analysée par cytométrie en flux (moyenne ± SEM, n = 5). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig3.jpg"> 
Figure 3 : Pro-inflammatoires polarisation des cellules donneuses spécifiques AQP4 T. Onze jours après la vaccination avec AQP4 p135-153 ou p201-220, cellules de ganglion lymphatique ont été récoltés et mis en culture avec le peptide utilisé pour l’immunisation dans des conditions non polarisant, conditions polarisation Th1 ou Th17. Polarisation Th17 ou Th1 a été examinée par l’ICS et écoulement cytometry pour IL-17 ou IFN-γ, respectivement. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig4.jpg"> 
Figure 4 : Cellules de polarisation Th17 spécifiques AQP4 T induisent paralysie chez les bénéficiaires souris WT. Les bénéficiaires souris WT provenant de 2 x 107 donneur AQP4 polarisation Th17 p135-153 ou lymphocytes T spécifiques à p201-220 AQP4- / - souris. Polarisation Th17 de cellules T spécifiques MOG a servi de témoin positif. Résultats sont représentatifs des 8 expériences (n = 5/groupe). * p &#60; 0,05, ** p &#60; 0,01, *** p &#60; 0,001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig5.jpg"> 
Figure 5 : Cellules Th17 spécifiques AQP4 induisent opticospinal l’inflammation chez les souris WT. Souris destinataires a reçu 2 x 107 AQP4 Th17 p135-153 - ou p201-220-amorcé Th17 cellules donneuses de AQP4- / - souris ou des cellules Th17 MOG p35-55-spécifiques et ont été sacrifiés à 10 jours plus tard. Tissus de la moelle épinière et nerf optique ont été préparés et colorés avec H &#38; E/BF pour évaluer des preuves de l’inflammation et la démyélinisation, respectivement. Résultats sont représentatifs des 5 souris/groupe. Echelle = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig5large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig6.jpg"> 
Figure 6 : Nerf optique inflammation induite par les cellules Th17 AQP4 spécifiques peut être surveillée par longitudinale rétinienne Oct Les bénéficiaires souris WT a reçu 2 x 107 donneur AQP4 polarisation Th17 p201-220-spécifiques ou cellules de T MOG p35-55-spécifiques au jour 0. Ils ont été examinés par OCT au jour 0 (avant l’administration de lymphocytes T) et puis les jours 4, 7, 8, 9 10, 11, 14 et 21. Épaisseur de l’IRL a été mesurée (moyenne ± SEM). Les statistiques indiquent une comparaison avec le contrôle de naïve. Résultats sont représentatifs des 3 expériences (5 souris/groupe). * p &#60; 0,05, ** p &#60; 0,01, *** p &#60; 0,001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons ici un protocole pour provoquer l’inflammation de paralysie et opticospinal de transfert de l’aquaporin-4 (AQP4)-des cellules T spécifiques de AQP4- / - souris dans des souris WT. En outre, nous démontrons comment utiliser tomographie par cohérence optique série pour surveiller le dysfonctionnement du système visuel.

Induction de paralysie et de lésion du système visuel chez la souris par le particulier de cellules T pour Neuromyélite optique autoantigènes Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Les objectifs généraux de ce protocole sont d'induire une maladie auto-immune du système nerveux central ou SNC par transfert adoptif de lymphocytes T spécifiques de l'aquaporine 4, et de surveiller les effets résultants sur le SNC et le système visuel dynamique. Cette méthode aidera à répondre à des questions clés concernant le rôle des lymphocytes T spécifiques de l'aquaporine 4, couramment appelée AQP4, dans la neuromyélite optique ainsi que dans d'autres troubles inflammatoires du système visuel. Le principal avantage de la tomographie par cohérence optique est la possibilité de réaliser un suivi longitudinal des lésions rétiniennes de manière non invasive.La procédure sera démontrée par Sharon Sagan, adjointe de recherche dans mon laboratoire, ainsi que par Andreas Cruz Harans, chercheur postdoctoral dans le laboratoire de RE Green. Commencez par fixer un robinet en nylon à trois voies doté de deux raccords mâles Luer lock à une seringue en verre Luer lock sans piston. Positionnez le levier du robinet vers la seringue pour fermer le robinet, puis placez la seringue avec l'extrémité ouverte dirigée vers le haut.Après vortexage, ajouter un volume équivalent de peptide et de solution d'adjuvant de Freund complet à la seringue, puis réinsérer le piston en verre dans la seringue. En maintenant le piston en place, retourner la seringue de manière à ce que le robinet soit orienté vers le haut, puis basculer le levier vers la connexion femelle inutilisée. Appuyer délicatement sur le piston pour éliminer l'excès d'air de la seringue.La solution remplira le deuxième raccord mâle Luer lock du robinet. Ensuite, fixez une deuxième seringue en verre avec le piston complètement inséré dans le deuxième raccord mâle Luer lock. Pour former une émulsion, appuyez alternativement sur les pistons afin de faire passer la solution d'une seringue à l'autre pendant environ deux minutes, puis refroidissez la solution pendant environ 10 minutes, jusqu'à ce qu'une modification visible de la viscosité de la solution apparaisse.Lorsqu'une émulsion blanche très rigide se forme, transférez toute la solution dans une des seringues et remplacez la seringue vide par une nouvelle seringue Luer lock d'un millimètre. Remplissez la nouvelle seringue avec l'émulsion. Retirez la seringue du robinet, puis fixez une aiguille de calibre 25.Pour tester la consistance de l'émulsion par la méthode de l'eau, expulser une goutte d'émulsion dans un petit récipient contenant de l'eau. Si l'émulsion ne se disperse pas, elle convient pour l'injection. Ensuite, injecter chaque souris donneuse AQP4 de type knock-out une seule fois par voie sous-cutanée, de chaque côté de l'abdomen inférieur et de chaque côté de la paroi thoracique, en médial du creux axillaire.10 à 12 jours après l'immunisation, pratiquez une incision médiane dans la peau depuis l'aine jusqu'au cou, puis le long de chaque membre du premier souris. Écartez la peau du péritoine et fixez-la fermement sur la planche. Ensuite, prélèvez les ganglions lymphatiques inguinaux et axillaires, et placez les tissus dans un tamis cellulaire placé dans une boîte de Pétri contenant du milieu complet.Une fois tous les ganglions lymphatiques collectés, placer le tamis cellulaire sur un tube conique de 50 millilitres contenant du milieu complet frais placé sur de la glace, puis utiliser l'extrémité plate du piston d'une seringue stérile de cinq millilitres pour faire passer les cellules des ganglions lymphatiques à travers la maille du filtre. Rincer la maille avec 20 à 30 millilitres de milieu complet afin de faciliter la récupération cellulaire, puis effectuer deux lavages par centrifugation. Après la deuxième centrifugation, resuspendre le culot dans du milieu pour lymphocytes T afin de procéder au comptage.Ajouter aux cellules les concentrations appropriées d'antigène, d'interleukine murine recombinante 23 et d'IL-6 murine recombinante, puis ajouter deux millilitres de cellules par puits de ce mélange polarisant Th17 dans chaque puits d'une plaque de 12 puits. Placer ensuite la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant 72 heures. Le troisième jour de polarisation, triturer les cultures de chaque puits plusieurs fois pour détacher les cellules polarisées, puis les rassembler dans un tube conique de 50 millilitres sur de la glace pour les compter.Après deux lavages dans le PBS, diluez les cellules à une concentration de un fois dix puissance huit cellules par millilitre dans le PBS, et mélangez délicatement la suspension cellulaire par rotation. Dans l'heure suivant leur prélèvement, transférez les cellules dans une seringue d'un millilitre, puis administrez 200 microlitres de cellules à chaque animal receveur par voie intraveineuse via la veine de la queue. Ensuite, injectez immédiatement à chaque souris, puis deux jours plus tard, 200 nanogrammes de toxine de B pertussis dilués dans 200 microlitres de PBS par voie intrapéritonéale.Pour l'imagerie rétinienne in vivo des animaux receveurs par tomographie par cohérence optique, dilater les pupilles cinq minutes avant l'imagerie à l’aide d’une goutte de tropicamide à 1 % par œil, et allumer le tapis chauffant. Placer la souris sur le cylindre d’imagerie, puis rediriger le flux d’anesthésie en conséquence. Protéger les yeux avec de l’hydroxypropylméthylcellulose à 0,3 % afin de les maintenir humides et d’assurer une continuité de réfraction, puis placer une lentille de contact sur mesure sur l’œil à examiner.Guidé par l'image du fond d'œil en infrarouge, dirigez le laser vers l'œil recouvert de la lentille en veillant à ce que le faisceau soit centré sur la tête du nerf optique. Effectuez 25 balayages en mode haute résolution et rasterisez les images à partir de 30 A-balayages moyennés. Après l'imagerie des deux yeux, remplacez la lentille de contact par un gel ophtalmique et placez la souris dans une cage de récupération chauffée.Pour analyser les images acquises à l’aide du logiciel d’imagerie modulaire destiné à la segmentation automatisée, corrigez d’abord manuellement les segments correspondant à la membrane limitante interne et à la couche plexiforme interne afin de représenter les limites des couches rétiniennes internes. Vérifiez ensuite que les couches des fibres nerveuses rétiniennes et des cellules ganglionnaires se situent bien à l’intérieur des limites de la couche rétinienne interne, et qu’elles ne se chevauchent pas. Une immunisation sous-cutanée par des peptides AQP4 contenant des épitopes T pathogènes induit de fortes réponses prolifératives des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques drainants de souris AQP4 déficientes, par comparaison aux réponses des lymphocytes T de type sauvage.Les analyses cytométriques en flux de l'expression individuelle des V bêta démontrent que les lymphocytes T spécifiques des peptides d'AQP4 contenant des épitopes T pathogènes utilisent des répertoires uniques de TCR et présentent une hyperprolifération sélective, indiquant que les réponses des lymphocytes T pathogènes à ces déterminants sont normalement régulées par la sélection négative thymique. Environ six à neuf jours après l'injection de lymphocytes T polarisés, presque tous les souris receveuses ont développé des signes cliniques de maladie auto-immune du SNC, notamment une queue molle et une paralysie des membres postérieurs. Les lymphocytes T spécifiques de l'AQP4 polarisés en Th17 induisent une maladie clinique plus sévère que les lymphocytes T spécifiques de l'AQP4 polarisés en Th1.Par exemple, cette souris a développé une paralysie complète des membres postérieurs après l'administration de cellules T spécifiques du peptide AQP4 polarisées en Th17. La maladie clinique induite par les cellules T Th17 spécifiques du peptide AQP4 est également associée à une infiltration de cellules mononucléées dans le parenchyme et les méninges du SNC, ainsi qu'à une inflammation du nerf optique, confirmée par un gonflement et un épaississement accru de la couche interne de la rétine, qui revient à la normale lorsque les souris se remettent de la maladie. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment induire et surveiller une auto-immunité ciblant AQP4, ce qui permettra des études supplémentaires pour comprendre le rôle des cellules T dans la neuromyélite optique.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

La vidéo démontre l’induction d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin en injectant une combinaison de glycoprotéines oligodendrocytaires de myéline et de Mycobacterium tuberculosis inactivé. Le modèle permet aux chercheurs d’étudier les mécanismes de la maladie et de tester des interventions thérapeutiques.

Induction d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin

Cette vidéo montre la méthode d’induction expérimentale de l’encéphalomyélite auto-immune (EAE) en injectant des peptides dérivés de la myéline avec un adjuvant pour activer les lymphocytes T autoréactifs, qui migrent vers le cerveau. La toxine coquelucheuse est administrée pour augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, permettant à ces lymphocytes T et à d’autres cellules immunitaires de pénétrer dans le cerveau. Ces cellules immunitaires provoquent une démyélinisation,...

Génération d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin

Dans cette vidéo, un modèle murin de sclérose en plaques est établi à l’aide d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). On injecte à la souris une émulsion contenant un peptide neuronal et un adjuvant, déclenchant une réponse immunitaire qui active les lymphocytes T autoréactifs. Ceci est suivi d’une injection de toxine coquelucheuse (PTX) pour augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, permettant aux lymphocytes T autoréactifs d’infiltrer le cerveau. Cette...

Cette vidéo montre la procédure d’induction de la paralysie par transfert de cellules Th17 activées ciblant l’aquaporine-4 dans un modèle murin. Dans le système nerveux central, les cellules Th17 activées interagissent avec les astrocytes exprimant l’aquaporine-4, déclenchant une réponse immunitaire qui conduit à la paralysie de la queue et des membres chez la souris.

Induction d’une paralysie dans un modèle murin par transfert de cellules Th17 spécifiques de l’aquaporine-4

Cette vidéo illustre le processus d’évaluation de la dysfonction motrice dans un modèle murin par l’administration de toxine coqueluche et d’un inoculum contenant des peptides et des adjuvants imitant la myéline, suivie de tests sur tapis roulant pour évaluer la fonction motrice et évaluer les lésions nerveuses résultantes dues à l’activation immunitaire et à la démyélinisation.

Évaluation de la fonction motrice dans un modèle expérimental de neurite auto-immune chez la souris

Nous décrivons une méthode d’implantation et de maintien de fenêtres en verre sur les moelles épinières exposées de souris adultes pour l’étude expérimentale de l’encéphalomyélite auto-immune. Ces fenêtres fournissent un accès optique chronique à la moelle épinière pour surveiller la dynamique cellulaire au niveau subcellulaire chez les animaux vivants à l’aide de la microscopie à deux photons.

Implantation de fenêtres de moelle épinière en verre chez des souris adultes atteintes d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Ce manuscrit décrit les méthodes d’induction et de notation du modèle expérimental d’encéphalomyélite auto-immune (EAE), ainsi que l’évaluation de la distribution des cellules immunitaires et des niveaux de cytokines à ARNm dans les ganglions lymphatiques, la rate, le sang et la moelle épinière à l’aide de la cytométrie en flux et de la PCR quantitative, respectivement, à diverses phases de la maladie.

Induction of Experimental encéphalomyélite allergique chez la souris et l&#39;évaluation de la distribution des maladies dépendant des cellules immunitaires dans divers tissus

Ce rapport présente une approche simple pour provoquer avec succès l’expérimental névrite auto-immune (EAN) à l’aide de la protéine de la myéline zéro (P0)180-199 peptide en combinaison avec adjuvant complet de Freund et la toxine coquelucheuse. Nous présentons un modèle sophistiqué capable d’évaluer avec précision l’ampleur des déficits fonctionnels et neuropathologie qui se produisent dans cette EAN.

Une approche Simple pour induire une névrite auto-immune expérimentale chez la souris C57BL/6 pour les évaluations fonctionnelles et neuropathologiques

Essai sur les cellules est une méthode largement utilisée pour détecter les immunoglobulines de sérum anti-aquaporin-4 G. Cette méthode pourrait être appliquée au diagnostic clinique et les recherches scientifiques de neuromyélite optique spectre troubles.

Détection d’immunoglobuline Anti-aquaporin-4 G de sérum humain par Cell-based Assay

Le présent protocole décrit l’induction d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin utilisant la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline et la surveillance du processus de la maladie à l’aide d’un système de notation clinique. Les symptômes expérimentaux liés à l’encéphalomyélite auto-immune sont analysés à l’aide d’une micro-tomodensitométrie du fémur de souris et d’un test en plein champ pour évaluer le processus de la maladie de manière exhaustive.

Induction et divers indicateurs d’évaluation de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal de la sclérose en plaques (SEP), qui partage avec la maladie humaine une réponse auto-immune humorale robuste. Ici, nous rapportons un protocole ELISA simple et flexible pour quantifier les auto-anticorps dans le sérum de souris immunisées contre l’EAE.

Quantification des anticorps autoréactifs chez la souris lors d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Découvrez comment induire une maladie auto-immune du SNC par transfert de cellules T spécifiques de l'aquaporine-4 chez la souris et surveiller les lésions rétiniennes par tomographie en cohérence optique.

Induction de paralysie et de lésion du système visuel chez la souris par le particulier de cellules T pour Neuromyélite optique autoantigènes Aquaporin-4 (Vidéo) | JoVE Journal

Induction de paralysie et de lésion du système visuel chez la souris par le particulier de cellules T pour Neuromyélite optique autoantigènes Aquaporin-4

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