Induction de paralysie et de lésion du système visuel chez la souris par le particulier de cellules T pour Neuromyélite optique autoantigènes Aquaporin-4

Les objectifs généraux de ce protocole sont d'induire une maladie auto-immune du système nerveux central ou SNC par transfert adoptif de lymphocytes T spécifiques de l'aquaporine 4, et de surveiller les effets résultants sur le SNC et le système visuel dynamique. Cette méthode aidera à répondre à des questions clés concernant le rôle des lymphocytes T spécifiques de l'aquaporine 4, couramment appelée AQP4, dans la neuromyélite optique ainsi que dans d'autres troubles inflammatoires du système visuel. Le principal avantage de la tomographie par cohérence optique est la possibilité de réaliser un suivi longitudinal des lésions rétiniennes de manière non invasive.

La procédure sera démontrée par Sharon Sagan, adjointe de recherche dans mon laboratoire, ainsi que par Andreas Cruz Harans, chercheur postdoctoral dans le laboratoire de RE Green. Commencez par fixer un robinet en nylon à trois voies doté de deux raccords mâles Luer lock à une seringue en verre Luer lock sans piston. Positionnez le levier du robinet vers la seringue pour fermer le robinet, puis placez la seringue avec l'extrémité ouverte dirigée vers le haut.

Après vortexage, ajouter un volume équivalent de peptide et de solution d'adjuvant de Freund complet à la seringue, puis réinsérer le piston en verre dans la seringue. En maintenant le piston en place, retourner la seringue de manière à ce que le robinet soit orienté vers le haut, puis basculer le levier vers la connexion femelle inutilisée. Appuyer délicatement sur le piston pour éliminer l'excès d'air de la seringue.

La solution remplira le deuxième raccord mâle Luer lock du robinet. Ensuite, fixez une deuxième seringue en verre avec le piston complètement inséré dans le deuxième raccord mâle Luer lock. Pour former une émulsion, appuyez alternativement sur les pistons afin de faire passer la solution d'une seringue à l'autre pendant environ deux minutes, puis refroidissez la solution pendant environ 10 minutes, jusqu'à ce qu'une modification visible de la viscosité de la solution apparaisse.

Lorsqu'une émulsion blanche très rigide se forme, transférez toute la solution dans une des seringues et remplacez la seringue vide par une nouvelle seringue Luer lock d'un millimètre. Remplissez la nouvelle seringue avec l'émulsion. Retirez la seringue du robinet, puis fixez une aiguille de calibre 25.

Pour tester la consistance de l'émulsion par la méthode de l'eau, expulser une goutte d'émulsion dans un petit récipient contenant de l'eau. Si l'émulsion ne se disperse pas, elle convient pour l'injection. Ensuite, injecter chaque souris donneuse AQP4 de type knock-out une seule fois par voie sous-cutanée, de chaque côté de l'abdomen inférieur et de chaque côté de la paroi thoracique, en médial du creux axillaire.

10 à 12 jours après l'immunisation, pratiquez une incision médiane dans la peau depuis l'aine jusqu'au cou, puis le long de chaque membre du premier souris. Écartez la peau du péritoine et fixez-la fermement sur la planche. Ensuite, prélèvez les ganglions lymphatiques inguinaux et axillaires, et placez les tissus dans un tamis cellulaire placé dans une boîte de Pétri contenant du milieu complet.

Une fois tous les ganglions lymphatiques collectés, placer le tamis cellulaire sur un tube conique de 50 millilitres contenant du milieu complet frais placé sur de la glace, puis utiliser l'extrémité plate du piston d'une seringue stérile de cinq millilitres pour faire passer les cellules des ganglions lymphatiques à travers la maille du filtre. Rincer la maille avec 20 à 30 millilitres de milieu complet afin de faciliter la récupération cellulaire, puis effectuer deux lavages par centrifugation. Après la deuxième centrifugation, resuspendre le culot dans du milieu pour lymphocytes T afin de procéder au comptage.

Ajouter aux cellules les concentrations appropriées d'antigène, d'interleukine murine recombinante 23 et d'IL-6 murine recombinante, puis ajouter deux millilitres de cellules par puits de ce mélange polarisant Th17 dans chaque puits d'une plaque de 12 puits. Placer ensuite la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant 72 heures. Le troisième jour de polarisation, triturer les cultures de chaque puits plusieurs fois pour détacher les cellules polarisées, puis les rassembler dans un tube conique de 50 millilitres sur de la glace pour les compter.

Après deux lavages dans le PBS, diluez les cellules à une concentration de un fois dix puissance huit cellules par millilitre dans le PBS, et mélangez délicatement la suspension cellulaire par rotation. Dans l'heure suivant leur prélèvement, transférez les cellules dans une seringue d'un millilitre, puis administrez 200 microlitres de cellules à chaque animal receveur par voie intraveineuse via la veine de la queue. Ensuite, injectez immédiatement à chaque souris, puis deux jours plus tard, 200 nanogrammes de toxine de B pertussis dilués dans 200 microlitres de PBS par voie intrapéritonéale.

Pour l'imagerie rétinienne in vivo des animaux receveurs par tomographie par cohérence optique, dilater les pupilles cinq minutes avant l'imagerie à l’aide d’une goutte de tropicamide à 1 % par œil, et allumer le tapis chauffant. Placer la souris sur le cylindre d’imagerie, puis rediriger le flux d’anesthésie en conséquence. Protéger les yeux avec de l’hydroxypropylméthylcellulose à 0,3 % afin de les maintenir humides et d’assurer une continuité de réfraction, puis placer une lentille de contact sur mesure sur l’œil à examiner.

Guidé par l'image du fond d'œil en infrarouge, dirigez le laser vers l'œil recouvert de la lentille en veillant à ce que le faisceau soit centré sur la tête du nerf optique. Effectuez 25 balayages en mode haute résolution et rasterisez les images à partir de 30 A-balayages moyennés. Après l'imagerie des deux yeux, remplacez la lentille de contact par un gel ophtalmique et placez la souris dans une cage de récupération chauffée.

Pour analyser les images acquises à l’aide du logiciel d’imagerie modulaire destiné à la segmentation automatisée, corrigez d’abord manuellement les segments correspondant à la membrane limitante interne et à la couche plexiforme interne afin de représenter les limites des couches rétiniennes internes. Vérifiez ensuite que les couches des fibres nerveuses rétiniennes et des cellules ganglionnaires se situent bien à l’intérieur des limites de la couche rétinienne interne, et qu’elles ne se chevauchent pas. Une immunisation sous-cutanée par des peptides AQP4 contenant des épitopes T pathogènes induit de fortes réponses prolifératives des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques drainants de souris AQP4 déficientes, par comparaison aux réponses des lymphocytes T de type sauvage.

Les analyses cytométriques en flux de l'expression individuelle des V bêta démontrent que les lymphocytes T spécifiques des peptides d'AQP4 contenant des épitopes T pathogènes utilisent des répertoires uniques de TCR et présentent une hyperprolifération sélective, indiquant que les réponses des lymphocytes T pathogènes à ces déterminants sont normalement régulées par la sélection négative thymique. Environ six à neuf jours après l'injection de lymphocytes T polarisés, presque tous les souris receveuses ont développé des signes cliniques de maladie auto-immune du SNC, notamment une queue molle et une paralysie des membres postérieurs. Les lymphocytes T spécifiques de l'AQP4 polarisés en Th17 induisent une maladie clinique plus sévère que les lymphocytes T spécifiques de l'AQP4 polarisés en Th1.

Par exemple, cette souris a développé une paralysie complète des membres postérieurs après l'administration de cellules T spécifiques du peptide AQP4 polarisées en Th17. La maladie clinique induite par les cellules T Th17 spécifiques du peptide AQP4 est également associée à une infiltration de cellules mononucléées dans le parenchyme et les méninges du SNC, ainsi qu'à une inflammation du nerf optique, confirmée par un gonflement et un épaississement accru de la couche interne de la rétine, qui revient à la normale lorsque les souris se remettent de la maladie. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment induire et surveiller une auto-immunité ciblant AQP4, ce qui permettra des études supplémentaires pour comprendre le rôle des cellules T dans la neuromyélite optique.