Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

L’objectif global de cette procédure est d’étudier les profils de liaison de différentes modifications d’histones, en utilisant des échantillons embryonnaires de faible abondance afin d’améliorer l’annotation fonctionnelle des génomes des vertébrés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que : quels sont les principaux amplificateurs et gènes définissant l’identité d’un tissu embryonnaire particulier. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle nécessite une quantité limitée de matériel particulier et qu’elle peut également être utilisée pour une analyse locale spécifique et à l’échelle du génome.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la régulation de la transcription ou l’hétérogénéité cellulaire avec les tissus embryonnaires, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les échantillons brevetés. Pour obtenir le stade HH19, embryons de poulet pour cette expérience, incubez des œufs de poule Leghorn blancs fertiles en orientation horizontale à 37 degrés Celsius et 80 % d’humidité pendant trois jours. Pour commencer à isoler les embryons de HH19, rendez-les accessibles en extrayant trois millilitres d’albumine avec une seringue de 10 millimètres pour abaisser le blastoderme.

Afin d’enlever les membranes embryonnaires supplémentaires, utilisez des ciseaux fins pour faire une petite ouverture dans l’œil. Ajouter un millilitre de solution anti-verrouillage. À l’aide d’une aiguille pliée, ajoutez 0,5 millilitre d’encre noire de Chine.

Utilisez des ciseaux chirurgicaux fins et des pinces pour couper la membrane embryonnaire supplémentaire qui entoure l’embryon. Ensuite, transférez l’embryon à l’aide d’une cuillère perforée dans une boîte de Pétri de 4,5 centimètres contenant 20 millilitres de solution PBS. En travaillant sur de la glace sous un stéréomicroscope, utilisez des ciseaux fins et des pinces pour disséquer et jeter l’amnios et les parties restantes de la membrane embryonnaire supplémentaire.

Ensuite, coupez le neurotube rachidien transverse ou le segment SNT au niveau brachial de l’embryon. Étendre la dissection caudale dans la région thoracique pour isoler le SNT. Pour finir, utilisez une pince pour retirer les tissus qui entourent latéralement et ventralement le SNT.

Après avoir isolé les SNT, plongez chaque segment dans une boîte de Pétri de 3,5 centimètres contenant de la trypsine chaude à 37 degrés Celsius. Lorsque le relâchement des tissus non neurologiques autour de la SNT est visible au stéréomicroscope, transférez les échantillons dans du PBS 1x froid. Pour arrêter la trypsinisation, transférez les échantillons dans une nouvelle boîte avec du DMEM froid contenant 10 % de FBS.

À l’aide d’une pince, vous pouvez retirer manuellement les tissus mésenchymateux et ectodermiques restants de la SNT. Transférez cette section SNT propre dans un tube de 1,5 millilitre et congelez-la dans de l’azote liquide. Ensuite, homogénéisez le tissu selon le protocole textuel.

Ajouter 13,5 microlitres de formaldéhyde à 37 % et incuber à température ambiante sur un rotateur pendant 15 minutes. Pour tremper le formaldéhyde, ajoutez 25 microlitres de glycine 2,5 molaires dans le tube et incubez à température ambiante sur un rotateur pendant 10 minutes. Centrifugez le tube, puis lavez la pastille selon le protocole texte.

Après réticulation, remettre la pastille en suspension dans 300 microlitres de tampon de lyse froid et complet par pipetage. Incuber les échantillons à quatre degrés Celsius sur une plate-forme à bascule pendant 10 minutes. Ensuite, sonicez les échantillons à quatre degrés Celsius.

Après la sonication, centrifugez les échantillons à 16 000 x G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférez le surnageant ou le lysat dans un tube frais de 1,5 millilitre et jetez la pastille de débris cellulaires. Diluez le lysat selon le protocole textuel.

Ensuite, conservez une petite aliquote de chaque échantillon comme contrôle d’entrée et congelez à 20 degrés Celsius. Incuber les échantillons restants qui seront soumis à la précipitation de la chromatine ou à la puce avec les anticorps appropriés selon le protocole de texte. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de chromatine liée aux anticorps aux billes magnétiques préalablement lavées.

Retournez les tubes pour mélanger les échantillons. Pour lier les anticorps aux billes, placez les tubes sur un rotateur de tube et tournez-les verticalement à quatre degrés Celsius pendant au moins quatre heures. Pour laver les billes liées à la chromatine, ajoutez un millilitre de tampon de lavage RIPA glacé dans le tube maintenu sur de la glace et mélangez en inversant ou en effleurant le tube.

Après avoir placé le tube dans le support magnétique à température ambiante, attendez que les billes se déposent sur le côté. Videz le liquide clair et répétez ce lavage trois fois de plus. Après avoir ajouté un millilitre de chlorure de sodium TE 50 millimolaire dans le tube, transférez les billes liées à la chromatine dans cette solution dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millimètre.

Placez le tube dans le support magnétique et lorsque les billes se sont déposées, versez le liquide. Ensuite, centrifugez les billes à 900 x G à quatre degrés Celsius pendant trois minutes dans une centrifugeuse pré-refroidie. Une fois les billes installées dans le support magnétique, retirez tous les TE restants à l’aide d’une pointe de chargement de gel.

En travaillant à température ambiante, ajoutez 210 microlitres de tampon d’élution aux billes et remettez-les en suspension en effleurant. Incuber le tube dans un bloc de chaleur préchauffé à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes, tout en secouant. Après l’incubation, centrifugez les tubes avec les billes à 16 000 x G à température ambiante, pendant une minute.

Une fois que les billes se sont déposées dans le support magnétique, transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation. Décongelez l’échantillon de contrôle d’entrée précédemment congelé de 20 degrés Celsius à température ambiante. Ajoutez 90 microlitres de tampon d’élution à l’échantillon et mélangez en tourbillonnant brièvement.

Pour inverser les réticulations, incubez la puce et contrôlez les échantillons à 65 degrés Celsius pendant la nuit. En travaillant à température ambiante, ajoutez un volume de tampon TE par tube et retournez pour mélanger. Pour digérer l’ARN, ajoutez l’ARNase A aux échantillons de contrôle et de puce jusqu’à une concentration finale de 0,2 milligramme par millilitre et retournez les tubes pour mélanger.

Incuber les tubes dans un bloc de chaleur préchauffé à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Pour digérer la protéine en vue de la purification ultérieure de l’ADN, ajoutez de la protéase K à une concentration finale de 0,2 milligramme par millilitre dans les tubes et retournez les tubes pour mélanger. Incuber les tubes dans un bloc de chaleur préchauffé à 55 degrés Celsius pendant deux heures.

Extrayez et purifiez l’ADN en fonction des matériaux supplémentaires. Cet ADN peut maintenant être utilisé pour la PCR quantitative et la préparation de banques de recherche de puces. L’efficacité de la sonication essentielle à la réussite d’une puce est confirmée par l’électrophorèse sur gel d’agarose des échantillons de contrôle d’entrée.

Dans cet exemple, en utilisant des sections de tube neural rachidien de poulet ou de SNT, 11 cycles de sonication ont été utilisés pour obtenir une taille de fragment optimale allant de 200 à 500 paires de bases. L’ADN pucé a été analysé par PCR quantitative pour mesurer les niveaux d’enrichissement des marques d’histones activatrices et répressives autour des régions promotrices des gènes actifs et inactifs dans le SNT du poulet. Cela montre qu’il est possible d’évaluer la qualité de la puce en ne quantifiant que quelques faces basses sans perdre beaucoup d’ADN pour une analyse plus approfondie.

Après la préparation séquentielle des banques de recherche de puces, un criquet représentatif est montré pour les données de recherche de puces de triméthylation H3K27 et de triméthylation H3K4 générées dans le SNT de poulet. Des profils de recherche de puces similaires ont également été générés avec succès dans différents tissus embryonnaires de poulet, tels que les proéminences maxillaires et les embryons de stade HH3. Cela démontre que le protocole CHIP peut être utilisé ici pour générer des profils épigénomiques à partir de quantités limitées de divers tissus embryonnaires.

En utilisant ce protocole pour générer les profils de modification des histones dans un tissu embryonnaire, il est important de se rappeler que les signaux proviendront de tous les différents types de cellules présents dans un tel tissu. En suivant ce protocole et en utilisant davantage de matériel biologique de départ, il devrait être possible d’étudier les profils de liaison d’autres protéines impliquées dans la régulation transcriptionnelle, telles que les facteurs de transcription, les co-activateurs ou les sous-unités de l’ARN polymérase 2. Une fois établis, ces protocoles permettront aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement ou de la génétique médicale d’améliorer l’altération fonctionnelle des génomes des vertébrés et d’obtenir des informations importantes sur les bases moléculaires de la myogenèse, de l’évolution et des maladies humaines.