Name: Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Apprenez le protocole ChIP-seq pour échantillons embryonnaires de faible abondance chez le poulet. Cette méthode permet d'analyser les profils de modifications histoniques et d'améliorer l'annotation fonctionnelle des génomes vertébrés.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs remercient Jan Appel pour son excellente assistance technique lors de la mise en place du présent protocole. Travail dans le laboratoire de Rada-Iglesias est pris en charge par CMMC intra-muros financement, subventions de recherche du DFG (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 et TE 1007/3-1), le chercheur avancé UoC groupe Grant et l’octroi de CECAD.

<ol><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin.+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of human epigenomes.</a> Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Benayoun, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+breadth+is+linked+to+cell+identity+and+transcriptional+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency.</a> Cell. 158 (3), 673-688 (2014).</li>
<li>Rehimi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics-Based+Identification+of+Major+Cell+Identity+Regulators+within+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations.</a> Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).</li>
<li>Ho, J. W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+metazoan+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of metazoan chromatin organization.</a> Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).</li>
<li>Calo, E., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+enhancer+chromatin%3A+what%2C+how%2C+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?</a> Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).</li>
<li>Spitz, F., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors%3A+from+enhancer+binding+to+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas tout intérêt financier concurrentes doivent être divulgués.

Épigénomique profilage de modification d’histone à l’aide de ChIP-seq peut être utilisé pour améliorer l’annotation fonctionnelle des génomes de vertébrés dans différents contextes cellulaire4,5,18. Ces profils épigénomique peuvent être utilisés, entre autres, d’identifier les éléments d’enhancer, pour définir l’État réglementaire des activateurs (c'est-à-dire actif, apprêtée, ou sur le point) et de définir des régulate...

Modifications post-traductionnelles des histones sont directement impliquées dans divers processus dépendants de chromatine, y compris la transcription, de réplication et de réparation de l’ADN pour1,2,3. En outre, les modifications d’histone différents montrent positifs (par exemple, H3K4me3 et H3K27ac) ou négatif (par exemple, H3K9me3 et H3K27me3) corrélations avec l’expression du gène et peuvent être définis de façon large comme marque d’histone activant ou répressive, respectivement2,3. Par conséquent, cartes de modification globale histone, également appelées cartes épigénomique, sont apparus comme des outils puissants et universels d’annoter fonctionnellement des génomes de vertébrés4,5. Par exemple, les séquences régulatrices distales comme exhausteurs peuvent être identifiés basé sur des signatures spécifiques de chromatine (p. ex., active exhausteurs : H3K4me1 et H3K27ac), qui les distinguent des régions promotrices proximal (par exemple, promoteurs actifs : H3K4me3)6,7,8. En revanche, gènes avec fonctions réglementaires d’identité cellulaire majeur se trouvent généralement avec les domaines de la chromatine large marquées avec H3K4me3 ou H3K27me3, suivant l’État transcriptionnellement actif ou inactif des gènes sous-jacent, respectivement9 ,,10. De même, l’expression des gènes d’identité cellulaire majeure semble être fréquemment contrôlée par de multiples et dans l’espace en cluster exhausteurs (c.-à-d., les exhausteurs de Super), qui peuvent être identifiés comme grands domaines marqués H3K27ac11.
Actuellement, modification des histones cartes sont générées en utilisant la technologie ChIP-seq, qui, par rapport aux approches précédentes telles que ChIP-chip (puce couplée à des puces à ADN), offre une résolution plus élevée, moins d’artefacts, moins de bruit, la couverture supérieure et inférieure frais12. Néanmoins, la génération de cartes épigénomique utilisant la technologie ChIP-seq a ses limites inhérentes, surtout associés à la capacité de réaliser avec succès la puce dans les échantillons d’intérêt. Protocoles de puce traditionnels généralement requis des millions de cellules, qui limite l’applicabilité de cette méthode pour cellulaire in vitro des lignes ou des cellules qui peut facilement être isolés en vivo (par exemple, les cellules sanguines). Dans ces dernières années, un certain nombre de mis à jour le protocoles de puce compatibles avec un nombre faible de cellules ont été décrits13,14,15,16. Toutefois, ces protocoles sont spécifiquement conçus pour être couplé avec la nouvelle génération séquençage (c.-à-d., ChIP-seq), et ils utilisent généralement ad hoc bibliothèque préparation méthodes13,14, 15 , 16.
Ici, nous avons décrit un protocole de puce qui peut être utilisé pour étudier les profils de modification d’histone en utilisant le nombre de cellules faible à intermédiaire (5 x 104 - 5 x 105 cellules) locus soit sélectionné (c'est-à-dire, ChIP-qPCR) ou dans le monde (par exemple, ChIP-seq) (Figure 1). Lorsqu’il est couplé à la technologie ChIP-seq, notre protocole de puce peut être utilisé ainsi que les méthodes de préparation de bibliothèque standard, ce qui le rend largement accessible à de nombreux laboratoires10. Ce protocole a été utilisé pour étudier plusieurs marques d’histone (par exemple, H3K4me3, H3K27me3 et H3K27ac) dans les tissus embryonnaires de poulet différentes (par exemple, la colonne vertébrale du tube neural (SNT), fronto proéminences et épiblaste). Cependant, nous pensons qu’il devrait être largement applicable à d’autres organismes qui échantillons biologique et/ou cliniquement pertinentes peuvent être obtenus seulement en faibles quantités.

<table><tbody><tr><td><Réactif fort></fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA en poudre</td><td>Carl Roth</td><td>3737.3</td><td></td></tr><tr><td>Tampon salin phosphate (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 8.0</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-désoxycholate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-24</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Applichem</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Carl Roth</td><td>3739.2</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>Protéine G/billes magnétiques</td><td>Invitrogen</td><td>1004D</td><td></td></tr><tr><td>37 % Formaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Peqlab</td><td>12-RA-03</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46.35 E</td><td></td></tr><tr><td>Na-butyrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>SLB2659V</tr><tr><td>Inhibiteur de protéinase</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>SYBRgreen Mix</td><td>biozym</td><td>617004</td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb échelle</td><td>Thermofisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma Alrich</td><td>03756-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % trypsine-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Éthoxylate d’octylphénol (Triton X 100)</td><td>Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&acute ; s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>Embouts de chargement de gel Multiflex</td><td>A.Hartenstein</td><td>GS21</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Plaques</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>384 puits</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,000 &micro ; L Embouts filtrants</td><td>Sarstedt</td><td>70,762,211</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &micro ; L Pointes filtrantes</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>2 - 200 &micro ; L Filtres</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,211</td><td></td></tr><tr><td>0.5 - 10 & micro ; L Embouts filtrants</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3 anticorps</td><td>Active Motif</td><td>39155</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac</td><td>anticorps Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3 anticorps</td><td>Active Motif</td><td>39159</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me2 anticorps</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>End Repair Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Perles paramagnétiques</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de suspension</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>A-Tailing Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Ligation</td> Mix <td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur d’ARN Indexes Illumina</td><td></td><td>RS-122-2101</td><td></td></tr><tr><td>Stop Ligation Buffer</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Amorce PCR Cocktail</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mélange PCR amélioré</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN génomique</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’élution</td><td>Agilent</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Kit</td> <td>de quantification de bibliothèqueKapa Biosystems</td><td>KK4835 &ndash ; 07960204001</td><td></td></tr><tr><td>Œufs de blanc de poule</td><td>fertile LSL Rhein Main</td><td>KN : 15968</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille (Neoject)</td><td>A.Hartenstein</td><td>10001</td><td></td></tr><tr><td>Seringue (Ecoject 10 mL)</td><td>Dispomed witt oHG</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Hermle</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>ITABIS</td><td>MKR13</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Active Motive</td><td>EpiShear sonde sonicator</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Diagenode</td><td>Bioruptor Plus</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>Volume variable (5 &ndash ; 1 000 &mu ; L) pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Sigma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Support magnétique</td><td>Thermo Fisher</td><td>DynaMag-2 12321D</td><td></td></tr><tr><td>Cône de table</td><td>Heathrow Scientific</td><td>Sprout</td><td></td></tr><tr><td>Mixer</td><td>LMS</td><td>VTX 3000L</td><td></td></tr><tr><td>Cycler PCR en temps réel</td><td>Roche</td><td>Light Cycler ; N° de série 5662</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Gene Amp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Système de contrôle de la qualité de l’ADN et de l’ARN</td><td>Agilent</td><td>Agilent 4200 TapeStation</td> System <td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>5-Inox-H</td><td></td></tr><tr><td>Cuillère perforée</td><td>World precision instruments</td><td>501997</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une technique largement utilisée pour cartographier la localisation des histones modifiées post-traductionnellement, variants d’histones, facteurs de transcription ou des enzymes modifiant la chromatine à un locus donné ou sur une échelle de tout le génome. La combinaison de tests de puce avec génération de séquençage (c.-à-d., ChIP-Seq) est une approche puissante pour découvrir dans le monde des réseaux de régulation génique et améliorer l’annotation fonctionnelle des génomes, en particulier des séquences régulatrices non codantes. Puce protocoles nécessitent généralement de grandes quantités de matériel cellulaire, ce qui annule l’applicabilité de cette méthode à une enquête sur les types de cellules rares ou des biopsies tissulaires petit. Afin de rendre l’analyse de puce compatible avec la quantité de matières biologiques qui en général peuvent être obtenus in vivo au cours de l’embryogenèse précoce de vertébrés, les auteurs décrivent ici un protocole simplifié de puce dans lequel le nombre d’étapes nécessaires pour terminer le test ont été réduits pour minimiser la perte de l’échantillon. Ce protocole ChIP a été utilisé avec succès pour enquêter sur des modifications d’histone différentes dans différents poulet embryonnaire et les tissus de souris adulte moyen faible pour un nombre moyen de cellules (5 x 104 - 5 x 105 cellules). Surtout, ce protocole est compatible avec la technologie ChIP-seq, à l’aide de méthodes de préparation de la bibliothèque standard, fournissant ainsi l’épigénomique global cartes dans les tissus embryonnaires très pertinents.

Pour illustrer la performance de notre protocole de puce, nous avons effectué des ChIP-seq expériences utilisant des sections SNT mise en commun des embryons de poulet CM19, maxillaires proéminences de HH22 poulet embryons et les embryons de poulet stade-HH3 pour enquêter sur les profils de liaison de modifications d’histone différents (c.-à-d., H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 et H3K27me3). Une fois la puce ADN ont été obtenues, l’efficacité de la sonication a été évaluée par électroph...

Nous décrivons ici une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et le protocole de préparation de bibliothèque de ChIP-seq pour générer des profils épigénomique global d’échantillons embryonnaires de poulet de faible abondance.

Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

L’objectif global de cette procédure est d’étudier les profils de liaison de différentes modifications d’histones, en utilisant des échantillons embryonnaires de faible abondance afin d’améliorer l’annotation fonctionnelle des génomes des vertébrés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que : quels sont les principaux amplificateurs et gènes définissant l’identité d’un tissu embryonnaire particulier. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle nécessite une quantité limitée de matériel particulier et qu’elle peut également être utilisée pour une analyse locale spécifique et à l’échelle du génome.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la régulation de la transcription ou l’hétérogénéité cellulaire avec les tissus embryonnaires, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les échantillons brevetés. Pour obtenir le stade HH19, embryons de poulet pour cette expérience, incubez des œufs de poule Leghorn blancs fertiles en orientation horizontale à 37 degrés Celsius et 80 % d’humidité pendant trois jours. Pour commencer à isoler les embryons de HH19, rendez-les

chromatin-immunoprecipitation-chip-protocol-for-low-abundance

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

La différenciation de l'ESC coïncide avec un type de cellule des changements spécifiques dans la structure et la composition de la chromatine. La détection de ces changements fournit de précieuses indications sur les mécanismes qui définissent stemcellness et la différenciation cellulaire. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) représente une méthode utile pour disséquer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la différenciation des cellules souches.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

Nous démontrons une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) méthode pour identifier les interactions de facteurs au tissu-spécifique des gènes pendant ou après l'apparition de tissu-spécifique l'expression des gènes dans les tissus embryonnaires de souris. Ce protocole devrait être largement applicable pour l'étude de l'activation de gènes spécifiques de tissus comme il se produit pendant le développement embryonnaire normal.

Assay immunoprécipitation de la chromatine des gènes spécifiques de tissus en utilisant des embryons de souris en début de

Nous décrivons une méthode robuste pour immunoprécipitation de la chromatine en utilisant des cellules T primaires. La méthode est fondée sur des approches standard, mais utilise un ensemble spécifique de conditions et de réactifs qui améliorent l'efficacité pour une quantité limitée de cellules. Surtout, une description détaillée de la phase d'analyse des données est présentée.

Immunoprécipitation de la chromatine efficace en utilisant des quantités limitées de biomasse

La combinaison de l'immunoprécipitation de la chromatine et le séquençage ultra-haut débit (chip-seq) permet d'identifier et de cartographier les interactions protéine-ADN dans une lignée de tissu ou de cellule donné. Décrit est de savoir comment générer un modèle de puce de haute qualité pour le séquençage ultérieur, en utilisant l'expérience avec le facteur de transcription TCF7L2 comme un exemple.

Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l&#39;ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

La question de savoir comment les organismes de réglementation et des états de la chromatine chromatine affecte le génome in vivo est essentielle à notre compréhension de la façon dont les premières décisions du destin cellulaire sont faites dans l'embryon en développement. ChIP-Seq-la méthode la plus populaire pour étudier les caractéristiques de la chromatine au niveau-est globale définie ici pour les embryons de xénope.

Snapshot échelle du génome des régulateurs de la chromatine et les États dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryons par Chip-Seq

Un règlement de réglage fin de la transcription des gènes à la base embryonnaire décision du destin cellulaire. Nous décrivons ici des analyses d'immunoprécipitation de chromatine utilisées pour étudier la régulation épigénétique de la différenciation cardiaque des cellules souches et le développement cardiaque d'embryons de souris.

Régulation épigénétique de Cardiac Différenciation des cellules et tissus souches embryonnaires

Nous présentons une méthode efficace et reproductible pour isoler et de la culture des cellules progénitrices neurales de tissus du cerveau embryonnaire et postnatale pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de l’histone 3 lysine 79 MBD (H3K79me2) - une marque d’histone agrave la domaine globulaire de l’histone 3.

Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD

Ici, nous décrivons des méthodes pour effectuer des ChIP-Seq et cartes de CAIRP-Seq, y compris la préparation de la bibliothèque pour l’ordonnancement de nouvelle génération, pour générer l’épigénomique global et l’ARN associée à la chromatine dans les cellules ES.

CAIRP-Seq et ChIP-Seq : méthodes pour identifier les ARN associée à la chromatine et Interactions protéine-ADN dans les cellules souches embryonnaires

Nous décrivons ici un protocole pour l’immunoprécipitation de la chromatine efficace (ChIP) suivi par séquençage haut-débit (ChIP-seq) du tissu adipeux brun (TAB) isolé à partir d’une souris. Ce protocole est convenable pour les cartographie des modifications d’histone et enquêter sur tout le génome de localisation des protéines non histones d’intérêt in vivo.

Immunoprécipitation de la chromatine du murin tissu adipeux brun

L'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) est un outil puissant pour comprendre les mécanismes moléculaires de la régulation génique. Cependant, la méthode implique des difficultés dans l'obtention de la fragmentation de chromatine reproductible par tonte mécanique. Ici, nous fournissons un protocole amélioré pour un jeu d'enfant en utilisant la digestion enzymatique.

Chromatin Immunoprecipitation Assay Utilisation de nucléases micrococciques dans les cellules de mammifères

Ce protocole se concentre sur la préparation de la chromatine à partir de tissus congelés et convient à l’immunoprécipitation de la chromatine par réticulation (X-ChIP) suivie d’une analyse PCR quantitative (X-ChIP-qPCR) ou d’approches de séquençage de nouvelle génération (X-ChIP-seq).

Extraction de chromatine à partir de tissu hépatique chimérique congelé pour l’analyse de l’immunoprécipitation de la chromatine

Apprenez le protocole ChIP-seq pour échantillons embryonnaires de faible abondance chez le poulet. Cette méthode permet d'analyser les profils de modifications histoniques et d'améliorer l'annotation fonctionnelle des génomes vertébrés.

Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

Explorer plus de vidéos