Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer l'activité cytotoxique des cellules NK humaines. Cette méthode peut être utilisée pour surveiller les patients présentant une déficience fonctionnelle ou classique des cellules NK. Les principaux avantages de cette technique basée sur la cytométrie en flux sont sa sensibilité, sa reproductibilité et sa rapidité par rapport aux méthodes standard d'évaluation de la fonction des cellules NK, telles que le test de libération de chrome radioactif.

Cette méthode peut être utilisée pour tester de nouvelles thérapies ciblant les cellules NK, ainsi que pour réaliser des analyses cytométriques en flux multiparamétriques approfondies, auparavant inaccessibles, de la biologie des cellules NK. Commencez par utiliser une séparation par gradient de densité pour isoler les cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC, à partir d'échantillons de sang total selon des protocoles standard. L'utilisation de PBMC plutôt que de cellules NK purifiées est fortement avantageuse lorsqu'on travaille avec des échantillons cliniques.

Diluez les cellules isolées à une concentration de cinq fois 10 à la puissance six cellules par millilitre dans un milieu complet et recueillez immédiatement les cellules cibles K562 par centrifugation. Resuspendez cinq fois 10 à la puissance cinq cellules K562 dans 500 microlitres de milieu frais supplémenté avec 1 % de FBS. Étiquetez ensuite les cellules cibles avec 500 microlitres de solution working de CFSE et mélangez délicatement la suspension cellulaire en pipetant trois à cinq fois.

Après 10 minutes à 37 degrés Celsius à l’abri de la lumière, arrêter la réaction de marquage avec 10 millilitres de milieu complet pendant 10 minutes à l’obscurité à température ambiante. À la fin de l’incubation d’arrêt, recueillir les cellules par centrifugation et re-suspendre la palette de cellules cibles marquées dans un millilitre de milieu complet pour le comptage. Ensuite, diluer les cellules à une concentration de 1 × 10⁵ cellules par millilitre de milieu complet frais et placer les cellules cibles dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Pour un essai réussi, réduisez au minimum le stress des cellules cibles et testez les cellules effectrices dès que possible après leur prélèvement. Dans les 30 minutes suivant le marquage des cellules cibles, étiquetez une plaque de culture tissulaire à fond rond en 96 puits conformément au tableau. Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu complet dans les puits correspondant aux rapports cellules effectrices sur cellules cibles de 25:1, 12,5:1 et 6,25:1, ainsi que dans les puits contenant uniquement les cellules cibles et ceux contenant uniquement les cellules effectrices.

Ajouter 100 microlitres de cellules effectrices dans les puits de contrôle de cytotoxicité et dans les puits aux rapports cellules effectrices sur cellules cibles de 50:1 et 25:1. Puis, en commençant par le puit au rapport de 25:1 (cellules effectrices sur cellules cibles), transférer 100 microlitres de cellules vers le puit présentant la concentration suivante plus faible en rapport cellulaire pour les deux puits suivants, en sautant les puits contenant uniquement les cellules cibles, en mélangeant soigneusement entre chaque transfert cellulaire et en ajoutant les derniers 100 microlitres de cellules dans les puits contenant uniquement les cellules effectrices. Ajouter 100 microlitres de la solution de travail 2X de Tween à 0,2 pour cent dans les puits de contrôle positif de mort des cellules K562 contenant uniquement le Tween.

Ajouter 30 microlitres de la solution de travail du flacon deux dans les puits de contrôle positif de la cytotoxicité des cellules NK. Ensuite, ajouter un fois 10 à la puissance cinq cellules cibles K562 marquées par millilitre dans 100 microlitres de milieu complet dans tous les puits, sauf dans les puits contenant uniquement les cellules effectrices. Une fois toutes les cellules ensemencées, mélanger tous les puits à l’aide d’une pipette multipuits.

Centrifuger brièvement pour déposer les cellules, puis placer la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures. À la fin de l'incubation, placer la plaque sur de la glace ou sur une surface froide, et ajouter 50 microlitres de colorant pour cellules mortes fraîchement préparé dans chaque puits. Ensuite, mélanger délicatement tous les puits et analyser les cellules par cytométrie en flux.

L'analyse cytométrique de la CSFE et de la coloration des cellules mortes après quatre heures de culture à froid, comme vient de l'être démontré, révèle que les cellules présentes dans les puits contenant uniquement les cellules cibles subissent une mort cellulaire de 15 % ou moins. Aucun signal de CSFE n'est détecté dans les puits contenant uniquement les cellules effectrices si moins de cinq pourcents de mort cellulaire sont observés dans ces puits. Alors que la mort cellulaire dans les puits de lyse des cellules cibles médiée par le Tween est généralement supérieure à 85 %. Chez les patients présentant un défaut de la fonction des cellules NK, une activité de lyse réduite est observée pour la plupart, voire la totalité, des rapports testés par rapport aux individus sains, ce qui démontre que les cellules NK de ces patients présentent une diminution différentielle de la cytotoxicité corrélée à une diminution du rapport cellules effectrices sur cellules cibles.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures et demie, incluant deux heures de préparation et de mise en place, quatre heures d'incubation et 30 minutes d'acquisition. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de préparer les cellules cibles et effectrices en parallèle afin de minimiser le délai entre la préparation des cellules et le début de la co-incubation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mesurer l'activité cytotoxique des cellules NK humaines contre des cellules cibles marquées de façon fluorescente par cytométrie en flux.