Name: Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Découvrez un test de cytotoxicité par cytométrie de flux pour évaluer l'activité des cellules NK humaines contre des cellules cibles K562 marquées au CFSE. Cette méthode sensible remplace les tests radioactifs classiques.

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Nous tenons à remercier Jill Narciso, UCLA immunogénétique Center, pour son aide avec la préparation du manuscrit.

Les échantillons ont été collectés conformément aux directives éthiques établies par le programme de protection de la recherche humaine de l’UCLA et approuvées par l’IRB.
1. Préparation des réactifs
REMARQUE : Sauf indication contraire, tous les réactifs doivent être laissés s’équilibrer à température ambiante avant d’être utilisés. Tous les réactifs doivent rester stériles.
<ol>
	<li>Préparez une solution de travail 2x de Tween-20 (c’est-à-dire 0,2 %) en ajoutant 10 μL de solution de Tween-20 à 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium à l’aide d’une pipette p20.
	<ol>
		<li>Compte tenu de la viscosité élevée du Tween-20, prenez les mesures suivantes pour assurer la précision : collectez lentement pour éviter la formation de bulles, n’immergez pas toute la pointe pour éviter qu’elle ne soit entraînée, et pipetez de haut en bas plusieurs fois dans du PBS pour laver tout le Tween-20 de la pointe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ajouter 2 μL de solution mère d’IL-2 (2,1E6 UI/mL) à 198 μL de milieu complet (c.-à-d. dilution 1:100), qui est une IPR avec 1 % de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS), puis passer à une dilution supplémentaire de 1:100 en ajoutant 2 μL de solution intermédiaire d’IL-2 à 198 μL de milieu complet pour préparer une solution de travail 7x (210 UI/mL).</li>
	<li>Ajouter 2 μL de solution mère CFSE (5 mM) à 500 μL de milieu ordinaire (RPMI). Vortex, tournez vers le bas pour enlever les gouttes du bouchon, puis procédez à une dilution supplémentaire de 1:20 en ajoutant 50 μL de la solution intermédiaire CFSE à 950 μL de RPMI ordinaire pour obtenir une solution de travail 2x de 1 μM. Bien vortex et conserver à l’abri de la lumière.</li>
</ol>
2. Isolement des PBMC en tant que cellules effectrices
REMARQUE : Ce test a été validé pour une utilisation efficace avec des PBMC totaux provenant de témoins sains. Cependant, il est recommandé de vérifier la teneur en cellules NK avec chaque préparation de PBMC (Figure 1). De plus, le volume de sang total à prélever est basé sur la fréquence des cellules NK dans le sang total périphérique, ce qui peut varier d’une personne à l’autre, en particulier entre les donneurs sains et les patients.
<ol>
	<li>Prélever un minimum de 4 ml de sang total humain dans des tubes de prélèvement de sang hépariné de sodium ou de lithium. Conserver les échantillons de sang à température ambiante au moment du prélèvement et les utiliser dans les 30 heures suivant le prélèvement.</li>
	<li>Diluer le sang total avec 4 ml de PBS (c’est-à-dire un volume égal de PBS par rapport au sang total).</li>
	<li>Ajouter 4 mL de solution à gradient de densité (voir le tableau des matériaux) dans un tube conique de 15 mL. Superposez soigneusement du sang total dilué sur la solution de gradient de densité en inclinant le tube.</li>
	<li>Centrifugeuse à 650 x g pendant 24 min avec le frein desserré.</li>
	<li>Prélevez soigneusement la couche de cellules mononucléaires, c’est-à-dire la fine couche blanche sous la couche supérieure de plasma et de plaquettes, dans un nouveau tube conique de 15 ml. Porter le volume à 15 mL avec du PBS.</li>
	<li>Centrifugeuse à 450 x g pendant 10 min avec le frein serré. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 0,5 mL de milieu complet.</li>
	<li>Utilisez un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre pour compter les cellules et ajustez la concentration de PBMC à 5x106 cellules/mL avec un milieu complet.</li>
	<li>Vérifiez le contenu des cellules NK par cytométrie en flux (voir étape 4).</li>
	<li>Commencer le test dans les 30 minutes. Conserver les cellules à température ambiante jusqu’à 10 minutes, ou les placer dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.</li>
</ol>
3. Isolement des cellules NK en tant que cellules effectrices
REMARQUE : Cette partie du protocole est une alternative à l’utilisation de PBMC totaux comme cellules effectrices. Le rendement typique de 4 ml de sang total provenant d’un individu en bonne santé est d’environ 4 x 105 cellules NK, soit environ 5 à 15 % des PBMC, bien que cette fréquence varie entre les donneurs 21. Il est recommandé d’effectuer un contrôle de pureté après l’isolement.
<ol>
	<li>Prélever un minimum de 4 ml de sang total humain dans des tubes de prélèvement de sang hépariné de sodium ou de lithium. Prélever 50 μL de sang total à colorer comme échantillon de pré-enrichissement.</li>
	<li>Ajouter le cocktail d’enrichissement à des échantillons de sang à 50 μL/mL (voir tableau des matières). Bien mélanger et incuber 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter un volume égal de PBS + 2 % FBS pour diluer l’échantillon et bien mélanger.</li>
	<li>Ajouter 4 mL de solution à gradient de densité dans un tube conique de 15 mL. Superposez soigneusement l’échantillon dilué sur le milieu à gradient de densité.</li>
	<li>Centrifugeuse à 1 200 x g pendant 10 min avec le frein desserré.</li>
	<li>Prélevez soigneusement la couche de cellules enrichies dans un nouveau tube conique de 15 ml. Lavez les cellules en portant le volume à 50 mL avec PBS + 2 % FBS.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g pendant 10 min. Jeter le surnageant et répéter le lavage.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 0,5 mL de milieu complet.</li>
	<li>À l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre, comptez les cellules et ajustez la concentration à 5x105 cellules/mL. Prélever 50 μL de suspension cellulaire purifiée à colorer en tant qu’échantillon post-enrichissement.</li>
	<li>Conservez les cellules à température ambiante jusqu’à 10 minutes ou placez-les dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.</li>
</ol>
4. Immunophénotypage pour l’évaluation du contenu des cellules NK
<ol>
	<li>À l’aide de 50 μL de PBMC isolés au total, de sang total pré-enrichissement ou de cellules NK purifiées, colorer avec un anticorps conjugué au fluorochrome anti-CD56 comme marqueur de cellules NK. Des marqueurs pour d’autres types et lignées cellulaires (c.-à-d. lymphocytes T CD3+, lymphocytes B CD19+) peuvent également être inclus pour évaluer l’origine de la contamination, le cas échéant.</li>
	<li>Incuber pendant 20 min à 4 °C, et laver en ajoutant 2 mL de PBS + 2 % FBS.</li>
	<li>Centrifugeuse à 450 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Pour les cellules PBMC ou NK, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 μL de PBS + 2 % FBS.</li>
	<li>Pour les échantillons de sang total, effectuez la lyse des globules rouges (GR) :
	<ol>
		<li>Après centrifugation, aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans 2 mL de tampon de lyse des globules rouges (31,75 g de chlorure d’ammonium + 4,16 g de Tris base + 6,65 g d’EDTA, dissous dans 5000 mL d’eau désionisée).</li>
		<li>Incuber 10 min à température ambiante.</li>
		<li>Répéter deux lavages, aspirer le surnageant et remettre en suspension l’échantillon lysé dans 100 μL de PBS + 2 % FBS. 
		REMARQUE : La lyse des globules rouges peut également être effectuée avant la coloration.</li>
		<li>Procéder à l’analyse par cytométrie en flux.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Décongélation, culture et récolte des cellules cibles K562
<ol>
	<li>Placez 10 mL de milieu complet dans un tube conique de 15 mL et laissez-les réchauffer dans un bain-marie à 37 °C. Pour la décongélation et la culture des cellules K562, utilisez uniquement un milieu préchauffé à 37 °C pour toutes les étapes.</li>
	<li>Placez un flacon de cellules K562 congelées dans le bain-marie à 37 °C jusqu’à ce que la majeure partie soit décongelée.</li>
	<li>Transférez les cellules K562 semi-décongelées dans le milieu complet, préchauffé à 37 °C, dans le tube conique de 15 ml. Lavez l’intérieur du flacon cryogénique à l’aide d’un média préchauffé et ajoutez le nettoyant dans le tube de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugeuse à 140 x g pendant 7 min avec le frein serré. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu complet.</li>
	<li>Déterminer une quantité appropriée de suspension cellulaire pour compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre.</li>
	<li>Ajuster la concentration à 1x10 5-2x105 cellules/mL et cultiver dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C pendant au moins 2 jours avant utilisation. Maintenir la culture à cette plage de densité pendant 3 mois au plus, puis décongeler une nouvelle aliquote. Ne jamais dépasser une concentration cellulaire de 1x106 cellules/mL en culture.</li>
	<li>Pour l’utilisation dans le dosage, bien mélanger la culture cellulaire K562 avec une pipette sérologique de 10 mL et prélever une aliquote pour compter et évaluer la viabilité cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre et de la coloration au bleu trypan.
	<ol>
		<li>Si la viabilité est inférieure à 85 %, procédez aux étapes suivantes d’élimination des cellules mortes.
		<ol>
			<li>Ajouter 15 mL de solution à gradient de densité dans des tubes coniques de 50 mL, au besoin. Prélevez toutes les cellules de la culture et superposez lentement la suspension cellulaire sur la solution à gradient de densité en inclinant le tube.</li>
			<li>Centrifugeuse à 650 x g pendant 24 min avec frein désactivé. Recueillir soigneusement la couche de cellules vivantes dans un nouveau tube conique de 15 ml. Porter le volume à 50 mL avec du PBS.</li>
			<li>Centrifugeuse à 450 x g pendant 10 min avec le frein serré. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu complet. Comptez les cellules et vérifiez leur viabilité (comme au point 5.7).</li>
			<li>Cultiver dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C pendant au moins 2 jours avant utilisation.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prélever 5x105 cellules cibles K562 et centrifuger à 140 x g pendant 7 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL dans un milieu contenant 1 % de FBS.</li>
</ol>
6. Marquage des cellules cibles K562
REMARQUE : Assurez-vous que les cellules K562 sont bien remises en suspension avant d’ajouter la solution de travail CFSE.
<ol>
	<li>Pipeter 500 μL de la solution de travail CFSE sur les 500 μL de cellules K562 pour une concentration finale de 0,5 μM. À l’aide de la même pointe de 1000-1250 μL, mélanger immédiatement en pipetant doucement de haut en bas 3 à 5 fois.</li>
	<li>Incuber au bain-marie à 37 °C ou dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 10 min dans l’obscurité. 
	REMARQUE : Étant donné que le temps de latence d’équilibrage de la température est plus long dans l’incubateur que dans le bain-marie, il peut être nécessaire d’ajuster le temps d’incubation, surtout pour les volumes > 1 ml.</li>
	<li>Tremper la réaction d’étiquetage avec 10 mL de milieu complet pendant 10 min à l’obscurité à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger les cellules K562 marquées à 140 x g pendant 7 min. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans 1 mL de milieu complet.</li>
	<li>Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre et portez la concentration à 1x105 cellules/mL dans un milieu complet.</li>
	<li>Placez les cellules dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi. Les cellules peuvent être conservées à température ambiante jusqu’à 10 min, ou dans un incubateur deCO2 humidifié à 37 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi. Ne pas réfrigérer.</li>
</ol>
7. Placage
REMARQUE : Si les cellules NK sont limitatives, la concentration des cellules K562 et NK peut être réduite de moitié, de sorte que la moitié des cellules sont enrobées dans le test. Le test donne des résultats comparables avec la moitié du nombre de cellules (tant que les rapports sont maintenus cohérents).
<ol>
	<li>Si vous utilisez des PBMC totaux, étiqueter une plaque de 96 puits, à fond en U, traitée par culture tissulaire pour les conditions suivantes par puits : (1) Effecteur (E) : Cible (T) = 50 : 1 + IL-2 - témoin positif pour la cytotoxicité des cellules NK ; (2) E : T = 50 : 1 ; (3) E : T = 25 : 1 ; (4) E : T = 12,5 : 1 ; (5) E : T = 6,25 : 1 ; (6) T - cellules cibles uniquement - contrôle négatif pour la mort de K562 ; (7) E - cellules effectrices uniquement ; (8) T + Tween - Contrôle positif pour la mort de K562</li>
	<li>Si vous utilisez des cellules NK purifiées, étiquetez une plaque de culture tissulaire à fond en U à 96 puits pour les conditions suivantes par puits : (1) Effecteur (E) : Cible (T) = 5 : 1 + IL-2 - contrôle positif pour la cytotoxicité des cellules NK ; (2) E : T = 5 : 1 ; (3) E : T = 2,5 : 1 ; (4) E : T = 1,25 : 1 ; (5) E : T = 0,625 : 1 ; (6) T - cellules cibles uniquement - contrôle négatif pour la mort de K562 ; (7) E - cellules effectrices uniquement ; (8) T + Tween - témoin positif pour la mort de K562</li>
	<li>Ajouter 100 μL de support complet aux conditions 3, 4, 5, 6, 7. Pour cette étape et toutes les suivantes, (recommandé) utilisez une pipette multicanaux.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de cellules effectrices (PBMC à 5x106 cellules/mL ou cellules NK purifiées à 5x105 cellules/mL) aux conditions 1, 2, 3. Ajouter des cellules effectrices pour les conditions 4 à 7 par dilution en série. Ne changez pas les pointes d’une condition à l’autre.
	<ol>
		<li>Mélanger l’état 3, prélever 100 μL et transférer à l’état 4.</li>
		<li>Mélanger l’état 4, prélever 100 μL et transférer à l’état 5.</li>
		<li>Mélanger l’état 5, prélever 100 μL et transférer à l’état 7 ; La condition 6 n’a pas de cellules effectrices.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ajouter 100 μL de solution de travail préparée 2x 0,2 % Tween à l’état 8 (concentration finale : 0,1 % Tween-20) ; l’état 8 n’a pas de cellules effectrices.</li>
	<li>Ajouter 30 μL de solution de travail d’IL-2 à l’état 1. L’IL-2 doit être ajoutée à la suspension de cellules effectrices avant l’ajout de la suspension de cellules cibles (concentration finale : 27 UI/mL).</li>
	<li>Ajouter 100 μL de cellules cibles (cellules K562 marquées à 1x105 cellules/mL) aux conditions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8. La condition 7 n’a pas de cellules cibles.</li>
	<li>Mélangez tous les puits à l’aide d’une pipette multicanaux et centrifugez la plaque à 120 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Incuber dans un incubateur de CO2 humidifié à 37 °C pendant 4 h. À la fin de l’incubation, placez la plaque sur de la glace et procédez à la coloration de viabilité dans les 30 min.</li>
</ol>
8. Coloration pour la viabilité et l’acquisition
<ol>
	<li>Préparez la coloration des cellules mortes (voir tableau des matériaux) en ajoutant 3 μL de la solution mère 5 μM à 600 μL de PBS.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de colorant à cellules mortes dilué dans chaque puits pour un volume final de 250 μL et une concentration finale de 0,005 μM. Bien mélanger avec une pipette multicanaux.</li>
	<li>Procéder à l’analyse par cytométrie en flux. À l’aide d’un cytomètre en flux, collectez au moins 1 000 événements dans la porte de la cellule cible (Figure 2) pour des résultats statistiquement significatifs.</li>
</ol>

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<li>Rezvani, K., Rouce, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Application+of+Natural+Killer+Cell+Immunotherapy+for+the+Treatment+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer.</a> Front Immunol. 6, 578(2015).</li>
<li>Angelo, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+NK+cell+phenotyping+and+variability+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults.</a> Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).</li>
<li>Zons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+europium+and+chromium+release+assays%3A+cytotoxicity+in+healthy+individuals+and+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).</li>
<li>Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+sex%2C+menstrual+cycle%2C+and+oral+contraceptives+on+the+number+and+activity+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells.</a> Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).</li>
<li>Laue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+NK+cell+function+in+obese+healthy+humans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Obes%22%5BJournal%5D)">Altered NK cell function in obese healthy humans.</a> BMC Obes. 2, 1(2015).</li>
<li>Hazeldine, J., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+ageing+on+natural+killer+cell+function+and+potential+consequences+for+health+in+older+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults.</a> Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt financier.

La méthode décrite ici offre une alternative simple et rentable pour le test de libération traditionnel 51Cr pour évaluer l’activité cytotoxique des cellules NK. Cette méthode est sensible, reproductible et moins de temps que les méthodes standards précédents, comme l’arc et peut être utilisée à la fois clinique et les applications de recherche.
Alors que le test fonctionne avec les PBMC total et enrichi les cellules NK, la possibilité d’utiliser des PBMC sans avoir besoin de purifi...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56191/a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk">A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity</a>. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">
to:
<img alt="Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56191/a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk">A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity</a>. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Cellules tueuses naturelles de (NK) sont un sous-ensemble sophistiqué des lymphocytes humains d’innée critique impliqués dans l’élimination des cellules infectées virally, cellules transformées et autres menaces pathogènes 1,2. Granules lytiques de cellules NK maison cytotoxiques protéines, comme la perforine et granzymes. Lors de leur activation, les cellules NK forment une interaction complexe avec leurs cibles appelées synapse immunologique, auquel cas ces molécules cytotoxiques sont localement libérés, ce qui entraîne la lyse des cellules cibles directes et l’apoptose, ainsi que de la libération de cytokines et de chimiokines et finalement dans l’induction d’un inflammatoire état 1,3,4.
Activation des cellules NK implique une chaîne complexe de l’activation et inhibitrices interactions entre NK cellules récepteurs et ligands exprimés à la surface des cellules cibles, formant un système étroitement réglementé. Un des mécanismes plus étudiés de l’activation des cellules NK est le « soi manquant ». En effet, absence de détection de classe sur que j’ai major complexe d’histocompatibilité (CMH) ou human leucocyte antigen (HLA) molécules, infectés ou transformé la cytotoxicité des cellules NK cellules déclencheurs. Tumeur et les cellules infectées par le virus en général régulent ces antigènes pour échapper l’immunité cellulaire T, devenant ainsi le principal NK cellules cibles 1,3,4.
Évaluation de la fonction des cellules NK principalement dans la catégorie dégranulation ou la cytotoxicité des essais. Cependant, les essais de dégranulation, telles que la détection de cytométrie en flux du marqueur dégranulation associée à CD107a, ne sont qu’indicatifs d’activation des cellules NK et non de leur fonction ultime, la mort directe de cible les cellules 5,6,7,8. Par conséquent, cette limitation a attiré enquêteurs aux analyses de cytotoxicité comme une alternative plus éloquent et plus directe.
La longue date « gold standard » pour évaluer l’activité cytotoxique à médiation cellulaire des cellules T et NK est le test de libération chrome (ARC). L’arc implique radiologiquement marquage de cellules cibles avec 51Cr et incuber conjointement avec les cellules effectrices. Ce dosage est ancré dans le principe que la lyse cellulaire entraîne la libération de protéinique 51Cr dans le surnageant, qui peut être mesuré en comptant les gamma. Ce test, bien qu’efficace, est problématique pour plusieurs raisons : des coûts élevés de matière, manipulation et élimination des radioactifs 51Cr, libération spontanée de 51Cr et normalisation difficile - ce qui en fait tout à fait irréaliste 9,10.
Un certain nombre d’essais non radioactif, impliquant le marquage fluorescent, la libération de l’enzyme et même bioluminescence, ont depuis été développé comme solution de rechange à l’arc 11,12,13,14. Nous décrivons ici une méthode axée sur la cytométrie de flux pour la mesure des NK cellule cytotoxique sur les cellules K562 cible qui est simple, sensible et reproductible. Les cellules K562 sont une cellule humaine érythroleucémiques line avec une expression réduite des molécules HLA de classe I et expression accrue des ligands pour des récepteurs NK activatrices, ce qui les rend particulièrement sensibles à la cytotoxicité à médiation cellulaire NK 15. Dans cet essai, cellules K562 sont préalablement étiquetées avec carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) et co cultivées à divers rapports avec deux cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) ou purifiée de cellules NK 1. CFSE est un colorant fluorescent stable, protéine liant qui permet à la discrimination des cellules cibles de l’effecteur NK cellules 16,17. Après l’incubation Co, une tache d’acide nucléique, spécifiquement imprégnant la membrane des cellules mortes, est utilisée pour identifier les cellules de cible tuée (voir table des matières). Les échantillons sont ensuite acquis sur un cytomètre en flux pour déterminer le pourcentage de morts (c.-à-d., tache +) CFSE + cellules cibles.
Ce dosage peut servir d’un dépistage systématique pour monogéniques défauts affectant le compartiment de cellules NK, dont il existe environ 30 défauts connus provoquant le déficit de cellules NK soit fonctionnelle ou classique, et familiale hémophagocytique primaire ou secondaire. Il est également utile d’examiner l’activité des cellules NK chez les patients souffrant d’infections virales herpès récurrent, sévère, d’évaluer la reconstitution immunitaire après greffe de cellules hématopoïétiques ou post immunomodulatrices thérapie 18,19,20et pour une foule d’applications de la recherche fondamentale.

<table><tbody><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (1x, sans Ca2+ et Mg2+)</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Média</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>Solution mère à 10 000 U/mL</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>Lyophilisé à partir d’un 0,2 &mu ; solution filtrée dans de l’acétonitrile et du TFA avec BSA comme protéine porteuse. Reconstituer avec 500 ul à 100 &mu ; g/mL dans de l’acide acétique stérile 100 mM contenant au moins 0,1 % d’albumine sérique bovine (2,1 x 10E6 UI/ml)</td></tr><tr><td>K562 Cellules</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>Lignée cellulaire cancéreuse&nbsp ;</td></tr><tr><td>Fioles de culture cellulaire T-75</td><td>Corning</td><td>431464</td><td></td></tr><tr><td>CFSE kit de prolifération cellulaire</td><td>Life Technologies (CellTrace)</td><td>C34554</td><td>Reconstituer un flacon I avec 18 ul DMSO pour préparer une solution mère de 5 mM. Ne pas congeler/décongeler.</td></tr><tr><td>Sytox Red</td><td>Life Technologies</td><td>S34859</td> La <td>solution mère est fournie à 5 &mu ; M dans 1 mL de DMSO. La solution de DMSO peut être soumise à plusieurs cycles de congélation-décongélation sans dégradation du réactif.</td></tr><tr><td>Tubes de prélèvement sanguin d’héparine de sodium/lithium</td><td>BD</td><td>02-687-95</td><td></td></tr><tr><td>Plaque en U à 96 puits</td><td>Corning</td><td>CLS3897</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polystyrène à fond rond (5mL)</td><td>BD Falcon</td><td>14959-5</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube conique en polypropylène</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tube conique en polypropylène</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de réactifs</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’enrichissement des cellules NK humaines</td><td>StemCell Technologies (RosetteSep)</td><td>15065</td><td></td></tr></tbody></table>

un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules nk humaine

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Au sein du système immunitaire inné, lymphocytes effecteurs natural killer (NK) cellules jouent un rôle essentiel dans la défense de l’hôte contre les cellules anormales, éliminant notamment tumoraux et virale des cellules infectées. Environ 30 anomalies monogéniques connus, ainsi qu’une foule d’autres pathologies, causent soit fonctionnelle ou classique carence cellulaire NK, se manifestant dans réduite ou absente une activité cytotoxique. Historiquement, la cytotoxicité a été étudiée avec les méthodes radioactives, qui sont encombrants, coûteux et potentiellement dangereux. Cet article décrit une méthode d’axée sur la cytométrie de flux rationalisé, cliniquement applicables afin de quantifier l’activité cytotoxique des cellules NK. Dans ce test, les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) ou des préparations de cellules NK purifiées sont conjointement incubées à différentes proportions avec une lignée de cellules tumorales de cible qui sont sensibles à la cytotoxicité des cellules NK (NKCC). Les cellules cibles sont préalablement étiquetées avec un colorant fluorescent pour permettre leur discrimination des cellules effectrices (cellules NK). Après la période d’incubation, les cellules cibles tués sont identifiés par une tache d’acide nucléique, qui imprègne spécifiquement les cellules mortes. Cette méthode se prête à la fois diagnostique et des applications de recherche et, grâce aux capacités multiparamétriques de la cytométrie en flux, a l’avantage supplémentaire de permettre éventuellement une analyse plus approfondie du phénotype des cellules NK et la fonction.

Avant de configurer le dosage, il est fortement recommandé que la teneur en cellules NK s’évaluer selon la population de l’effecteur de choix. La figure 1 montre une coloration typique de CD56 avant (bleu clair) et après (rouge) enrichissement de cellules NK. Les cellules NK représentent jusqu'à 15 % de PBMC et doivent être au moins 80 % de pur après enrichissement.
Cytométrie en ce test consiste à ...

Une méthode axée sur la cytométrie de flux pour déterminer quantitativement l’activité cytotoxique des humains les cellules tueuses naturelles est montrée ici.

Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer l'activité cytotoxique des cellules NK humaines. Cette méthode peut être utilisée pour surveiller les patients présentant une déficience fonctionnelle ou classique des cellules NK. Les principaux avantages de cette technique basée sur la cytométrie en flux sont sa sensibilité, sa reproductibilité et sa rapidité par rapport aux méthodes standard d'évaluation de la fonction des cellules NK, telles que le test de libération de chrome radioactif.Cette méthode peut être utilisée pour tester de nouvelles thérapies ciblant les cellules NK, ainsi que pour réaliser des analyses cytométriques en flux multiparamétriques approfondies, auparavant inaccessibles, de la biologie des cellules NK. Commencez par utiliser une séparation par gradient de densité pour isoler les cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC, à partir d'échantillons de sang total selon des protocoles standard. L'utilisation de PBMC plutôt que de cellules NK purifiées est fortement avantageuse lorsqu'on travaille avec des échantillons cliniques.Diluez les cellules isolées à une concentration de cinq fois 10 à la puissance six cellules par millilitre dans un milieu complet et recueillez immédiatement les cellules cibles K562 par centrifugation. Resuspendez cinq fois 10 à la puissance cinq cellules K562 dans 500 microlitres de milieu frais supplémenté avec 1 % de FBS. Étiquetez ensuite les cellules cibles avec 500 microlitres de solution working de CFSE et mélangez délicatement la suspension cellulaire en pipetant trois à cinq fois.Après 10 minutes à 37 degrés Celsius à l’abri de la lumière, arrêter la réaction de marquage avec 10 millilitres de milieu complet pendant 10 minutes à l’obscurité à température ambiante. À la fin de l’incubation d’arrêt, recueillir les cellules par centrifugation et re-suspendre la palette de cellules cibles marquées dans un millilitre de milieu complet pour le comptage. Ensuite, diluer les cellules à une concentration de 1 × 10⁵ cellules par millilitre de milieu complet frais et placer les cellules cibles dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Pour un essai réussi, réduisez au minimum le stress des cellules cibles et testez les cellules effectrices dès que possible après leur prélèvement. Dans les 30 minutes suivant le marquage des cellules cibles, étiquetez une plaque de culture tissulaire à fond rond en 96 puits conformément au tableau. Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu complet dans les puits correspondant aux rapports cellules effectrices sur cellules cibles de 25:1, 12,5:1 et 6,25:1, ainsi que dans les puits contenant uniquement les cellules cibles et ceux contenant uniquement les cellules effectrices.Ajouter 100 microlitres de cellules effectrices dans les puits de contrôle de cytotoxicité et dans les puits aux rapports cellules effectrices sur cellules cibles de 50:1 et 25:1. Puis, en commençant par le puit au rapport de 25:1 (cellules effectrices sur cellules cibles), transférer 100 microlitres de cellules vers le puit présentant la concentration suivante plus faible en rapport cellulaire pour les deux puits suivants, en sautant les puits contenant uniquement les cellules cibles, en mélangeant soigneusement entre chaque transfert cellulaire et en ajoutant les derniers 100 microlitres de cellules dans les puits contenant uniquement les cellules effectrices. Ajouter 100 microlitres de la solution de travail 2X de Tween à 0,2 pour cent dans les puits de contrôle positif de mort des cellules K562 contenant uniquement le Tween.Ajouter 30 microlitres de la solution de travail du flacon deux dans les puits de contrôle positif de la cytotoxicité des cellules NK. Ensuite, ajouter un fois 10 à la puissance cinq cellules cibles K562 marquées par millilitre dans 100 microlitres de milieu complet dans tous les puits, sauf dans les puits contenant uniquement les cellules effectrices. Une fois toutes les cellules ensemencées, mélanger tous les puits à l’aide d’une pipette multipuits.Centrifuger brièvement pour déposer les cellules, puis placer la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures. À la fin de l'incubation, placer la plaque sur de la glace ou sur une surface froide, et ajouter 50 microlitres de colorant pour cellules mortes fraîchement préparé dans chaque puits. Ensuite, mélanger délicatement tous les puits et analyser les cellules par cytométrie en flux.L'analyse cytométrique de la CSFE et de la coloration des cellules mortes après quatre heures de culture à froid, comme vient de l'être démontré, révèle que les cellules présentes dans les puits contenant uniquement les cellules cibles subissent une mort cellulaire de 15 % ou moins. Aucun signal de CSFE n'est détecté dans les puits contenant uniquement les cellules effectrices si moins de cinq pourcents de mort cellulaire sont observés dans ces puits. Alors que la mort cellulaire dans les puits de lyse des cellules cibles médiée par le Tween est généralement supérieure à 85 %. Chez les patients présentant un défaut de la fonction des cellules NK, une activité de lyse réduite est observée pour la plupart, voire la totalité, des rapports testés par rapport aux individus sains, ce qui démontre que les cellules NK de ces patients présentent une diminution différentielle de la cytotoxicité corrélée à une diminution du rapport cellules effectrices sur cellules cibles.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures et demie, incluant deux heures de préparation et de mise en place, quatre heures d'incubation et 30 minutes d'acquisition. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de préparer les cellules cibles et effectrices en parallèle afin de minimiser le délai entre la préparation des cellules et le début de la co-incubation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mesurer l'activité cytotoxique des cellules NK humaines contre des cellules cibles marquées de façon fluorescente par cytométrie en flux.

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