Analyse précise, haut débit de la croissance bactérienne

L'objectif général de cette expérience est d'analyser précisément la croissance bactérienne de manière haut débit. Grâce à cette procédure, plusieurs milieux ou différentes souches peuvent être testés simultanément. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie des systèmes et de la microbiologie, telles que : quels sont les facteurs déterminants de la croissance cellulaire ?

Les principaux avantages de cette technique résident dans sa capacité à permettre aux chercheurs d'évaluer précisément des paramètres globaux tels que la vitesse maximale de croissance et la densité maximale de population dans les courbes de croissance de cellules bactériennes. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la croissance d’E. coli, elle peut également être appliquée à d'autres micro-organismes, comme dans le cas du test de croissance et du criblage de bactéries environnementales.

Pour commencer, placez cinq tubes en verre stérilisés munis de bouchons en caoutchouc de silicone, des pipettes et les souches cibles sur un banc propre. Exposez l'ouverture du tube en verre à la flamme d'un bec Bunsen avant d'ouvrir le bouchon en caoutchouc de silicone. Exposez le bouchon en caoutchouc de silicone à la flamme après ouverture du tube, puis replacez légèrement le bouchon sur le tube en verre.

Ensuite, utilisez la pipette électronique et la pipette sérologique jetable pour ajouter cinq millilitres de M63 à l'un des tubes en verre et 4,5 millilitres de M63 aux quatre autres tubes. Utilisez une pointe p200 pour prélever une colonie et l'ensemencer dans le tube en verre contenant cinq millilitres de M63. Vortexez le tube pour obtenir une suspension.

Ensuite, diluez la solution 10 fois en transférant 0,5 millilitre de cette solution dans l'un des quatre tubes contenant 4,5 millilitres de M63. Répétez ce processus pour les tubes restants. Après avoir stérilisé les bords des tubes en verre et les bouchons en caoutchouc de silicone, fermez les tubes avec les bouchons.

Ensuite, placer les cinq tubes dans un incubateur agitateur préalablement chauffé à 37 °C et agiter à 200 tr/min. Incuber la culture toute la nuit ou pendant 10 à 30 heures. Après l'incubation, ajouter 1 000 µL de M63 dans une cuvette jetable à l’aide d’une pipette P1000.

Placer la cuvette jetable dans un spectrophotomètre. Démarrer le programme à une longueur d'onde fixe de 600 nanomètres et mesurer le blanc. Transférer les cinq tubes en verre de l'incubateur agitateur vers le banc propre.

Jetez le M63 de la cuvette jetable et ajoutez 1 000 microlitres de culture dans la même cuvette jetable à l’aide du p1000. Ensuite, mesurez la turbidité optique de la culture cellulaire. Puis, ajoutez 250 microlitres de solution de glycérol stérilisée à 60 % et 750 microlitres de la culture cellulaire sélectionnée dans un microtube de 1,5 millilitre et mélangez par pipetage.

Placer les neuf microtubes restants dans le porte-microtubes et distribuer 100 microlitres du mélange préparé dans chaque tube. Conserver les stocks dans l'ultracongélateur à -80 degrés Celsius. Pour configurer le lecteur de microplaques, ouvrez d'abord le logiciel, ouvrez les protocoles dans le gestionnaire de tâches et sélectionnez créer un nouveau.

Ensuite, sélectionnez le protocole standard. Ouvrez la procédure et ajustez les paramètres. Ouvrez le réglage de la température et sélectionnez, incubateur allumé.

Ensuite, régler la température à 37 degrés Celsius et le gradient à zéro degré Celsius. Vérifier le préchauffage avant de passer à l'étape suivante. Démarrer la cinétique et définir la durée d'exécution sur 24 ou 48 minutes, puis régler l'intervalle à 30 minutes ou une heure.

Ouvrir l’agitation et régler le mode d’agitation sur linéaire. Activer l’agitation continue et régler la fréquence à 567 tr/min. Ensuite, ouvrir la lecture, sélectionner l’absorbance, le point final/kinétique et les monochromateurs.

Réglez la longueur d'onde à 600. Enfin, cliquez sur valider pour confirmer que la procédure est correcte. Puis cliquez sur enregistrer pour la sauvegarder en tant que nouveau programme utilisable ultérieurement.

Pour l'enregistrement en temps réel de la croissance, ajouter environ 25 millilitres de M63 à un réservoir de réactif stérilisé. Ensuite, ajouter 900 microlitres de M63 dans les microtubes en prévision de la réalisation de dilutions sérielles. Puis, ajouter 900 microlitres de M63 au stock de glycérol décongelé et vortexer.

Transférez 100 microlitres de la dilution au dixième dans un autre microtube contenant 900 microlitres de M63 et vortexez. Répétez cette étape jusqu'à l'obtention du nombre souhaité de dilutions. Remplissez ensuite les puits situés aux bords d'une microplaque stérilisée de 96 puits à fond plat avec 200 microlitres de M63, à l'aide d'une pipette à huit canaux.

Chargez 200 microlitres de chaque échantillon dilué dans les puits de la microplaque selon le tableau de référence. Pour éviter les couches de distribution dues au chauffage et à l'efficacité de semis, n'utilisez jamais les puits situés sur les bords de la microplaque pour vos échantillons et chargez le même échantillon dans plusieurs puits situés à des emplacements variés sur la microplaque. Placez la microplaque 96 puits sur le lecteur de plaques.

Ouvrez la lecture maintenant et le gestionnaire de tâches, puis sélectionnez le programme. Cliquez sur OK pour commencer la mesure. Enfin, enregistrez l'acquisition sous un nouveau fichier expérimental pour l'analyse des données.

Voici un exemple de tableau de référence établi avant la réalisation de l'expérience. Un pictogramme de plaque de 96 puits a été dessiné sous forme d'un tableau de huit par douze afin d'indiquer les positions des échantillons de culture inoculés sur la plaque de 96 puits. La vitesse de croissance est calculée en appliquant l'équation à toutes les paires de valeurs consécutives de OD600.

La moyenne et l'écart type de cinq taux de croissance consécutifs ont été calculés afin d'estimer le taux de croissance maximal. Les taux de croissance d'un total de 60 cultures cellulaires sont indiqués par la carte thermique affichée. Une dégradation du blanc au rouge indique des taux de croissance allant du plus faible au plus élevé.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques minutes si elle est effectuée correctement et dans l'ordre. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer et charger des échantillons dans la microplaque afin d'effectuer des mesures très précises de la croissance bactérienne de manière haut débit. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'établir un tableau de référence avant de mener l'expérience afin d'éviter les cultures cellulaires de faible densité et de s'assurer que les cellules commencent à croître dans les 24 heures.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que l'automatisation des manipulations expérimentales et l'analyse computationnelle peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme quels sont les facteurs déterminants de la propagation des populations et de leurs dynamiques. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la biologie des systèmes et de la microbiologie, afin d'explorer les principes fondamentaux de la croissance cellulaire et d'optimiser les compositions des milieux de culture.