Name: Préparation de cultures souris Dissocié neurones corticaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 2 s
Description: Découvrez la préparation de cultures neuronales corticales dissociées chez la souris pour la neurophysiologie et l'imagerie calcique. Cette méthode permet d'étudier le développement neuronal et les mutations génétiques létals postnatales.

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Les préparatifs avant le jour de la culture: <ul><li> Préparer une solution stérile de dissection (DS). </li><li> Préparer NBM/B27 (Mediom Neurobasal avec B27 suppléments). </li><li> Autoclave ddH 2 O et stériliser coversilps verre, si nécessaire. </li><li> Manteau plats de culture de tissu ou de lamelles de verre avec de la poly-D-lysine. </li></ul> Poly-D-Lysine Coating: Préparer la veille de culture dans des conditions stériles. <ul><li> Aliquote de dégel du PDL 10X et le placer sur la glace. </li><li> Ajouter 9 ml stériles ultra-eau filtrée à 1 ml de PDL et bien mélanger (1X). </li><li> Surfaces Manteau avec 1X PDL nuit à température ambiante comme suit: <ul><li> verre de lamelles (Bellco Glass, Inc Cat # 1943-00012.): 75 pl / lamelle OU </li><li> 24 plaques de culture ainsi: 300 pl / puits OU </li><li> Boîte de culture 35mm: 1ml/dish </li></ul></li><li> Rincer à l&#39;eau stérile 5X (utilisation de pipettes Pasteur stériles à aspirer le liquide). </li><li> Retirer de l&#39;eau jusqu&#39;à la surface est complètement sèche. </li></ul> Procédure de culture (réalisée en hotte à flux laminaire dans des conditions stériles) <ol><li> Découpez bloc de gélose et le coller sur le bloc de support de l&#39;Vibraslicer microtome (Campden Instruments Ltd) en utilisant la super glue. </li><li> Lors de l&#39;utilisation tardive stade embryonnaire (E17-18) des fœtus de souris, d&#39;un barrage euthanasier, retirer l&#39;utérus et libre fœtus individu de sac embryonnaire. Fœtus Placer dans une boîte de Petri stérile et continuer comme décrit ci-dessous. </li><li> Fœtus de souris décapiter ou chiot (directives approuvées par votre suivi de protection des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation). </li><li> Enlever la peau et le crâne et le cerveau placer sur le disque de papier filtre Whatman dans un plat de Pétri 60mm rempli DS froid. </li><li> Coupez le cervelet en utilisant une lame de rasoir stérile. </li><li> Ramassez le cerveau à l&#39;aide d&#39;une spatule et égoutter l&#39;excès de liquide sur du papier filtre, puis transférer le cerveau de bloquer le soutien Vibraslicer et le cerveau de la colle en place (côté caudale et la partie ventrale face agar). </li><li> Remplir la chambre froide avec la DS. Réglez le sélecteur de vitesse à 8-9. </li><li> Couper 200-400 um sections, à partir de bulbe olfactif. Une fois que la lame de la Vibraslicer pénètre dans le cortex, commencer à couper 600μm coupes coronales. Un cerveau de souris E17-18 donne typiquement 3-4 tranches utilisable, alors un cerveau de souris P0 rendements 4-5 tranches utilisables. </li><li> Transfert des tranches de cerveau à 35 mm boîte de Petri étiquetés DS 2 en utilisant de fond inverse de l&#39;ONU-branchée verre de 10 ml Pasteur pipette. </li><li> Disséquer le cortex et enlever les méninges en utilisant des aiguilles de verre tiré à partir des tubes capillaires. </li><li> Couper écorces corticale en petits morceaux, 0,5-1 mm de longueur. </li><li> ES Filtrer à travers filtre de 0,2 um attachée à une seringue de 5 cc dans un plat de Pétri de 35 mm. </li><li> Transférer les morceaux de tissu cortical boîte de Pétri contenant ES filtré. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li></ol> Dans l&#39;intervalle: <ol><li> Nettoyer le capot, et les outils Vibraslicer dissection. </li><li> Ajouter 5 ml de NBM/B27 chaud dans un plat de Pétri de 60 mm. </li></ol> Après 30 min. incubation: <ol><li> Transfert des tissus à 10 ml DS. Laisser reposer pendant 1 min. </li><li> Transfert des tissus au premier tube de tourbillons Salut et laisser reposer pendant 2-3 min. </li><li> Transfert à Salut secondes. Répéter comme ci-dessus. </li><li> Transfert d&#39;abord Li. Répéter comme ci-dessus. </li><li> Transfert à la seconde Li. Répéter comme ci-dessus. </li><li> Transfert à des tiers Li. Répéter comme ci-dessus. </li><li> Transfert des tissus à l&#39;antenne de 60 mm avec les médias. </li></ol> Sous le microscope de dissection: <ol><li> Nettoyer les débris tissulaires et triturer chaque pièce en douceur en passant par une pipette de verre tiré (utilisation décroissante diamètres d&#39;alésage) pour assouplir les tissus. </li><li> Transfert suspension cellulaire à 15 ml tube conique contenant le reste de NBM + B27 (Faire un total de 13 ml pour une plaque à 24 puits ou 11 ml pour 5 -. Plaques de 35 mm Mélanger doucement et attendre que de gros morceaux de tissus à régler). </li><li> Suspension de cellules de transfert (0,5 ml / puits d&#39;une plaque à 24 puits ou 2 ml / boîte de 35 mm de la culture). </li><li> Lors de l&#39;utilisation des lamelles en verre, ajouter 80 ul par suspension cellulaire lamelle et permettre une heure dans la culture des tissus incubateur pour cellules d&#39;adhérer avant l&#39;inondation de la chambre avec plus NBM/B27 médias. </li><li> Maintenir les cultures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> Jour suivant 24 plaques ainsi: Flux chaque puits avec 0,5 ml de cellules non-neuronales conditionnée NBM/B27 moyennes (cNBM/B27; Protocole pour la préparation de cNBM/B27 milieu apparaît ci-dessous) Plats 35mm: Remplacer 0,5 ml avec cNBM/B27 moyenne. Maintenir la culture en remplaçant 0.5ml de milieu avec cNBM/B27 frais tous les 2-3 jours. Bien que les milieux de culture ne favorise pas la prolifération des cellules gliales, les cultures peuvent être traitées avec 5 um FDU (5-fluoro-2&#39;-désoxyuridine, Sigma F0503) au jour 3-5 dans la culture afin de réduire davantage le nombre de cellules gliales, si nécessaire. SET<html> -UP pour la dissection et de la Culture Stériliser les outils de dissection dans EtOH 70% ou les autoclaves: <ul><li> Ciseaux (moyennes et petites) Spatules (moyennes et petites) </li><li> Lame de rasoir Brucelles (moyennes et petites) </li><li> Lame pour le bain de tampon vibraslicer </li><li> Cale métallique pour support de lame pour le cerveau </li></ul> Autres matériaux: <ul><li> Boîtes de Pétri (60 mm) </li><li> Boîtes de Pétri (35 mm) </li><li> Le papier filtre </li><li> Pipette en verre de 10 ml </li><li> Stérile pipettes jetables, 5,10 et 25 ml </li><li> Seringue filtre de 0,2 um </li><li> Seringue 5 cc </li><li> Tubes à centrifuger de 15 ml </li><li> Pipettes Pasteur stérile en verre </li><li> PDL boîtes de culture enduits ou des lamelles de verre </li></ul> Étiquette six tubes de 15 ml centrifugeuse et suivre la préparation: Tube n ° 1: la solution enzymatique: Ajouter 50 U de la papaïne (Worthington LS 03126) à 5 ml contenant DS: <ul><li> 100 pi de L-cystéine (0,8 mg) </li><li> 7 ul NaOH 0,1 N </li><li> 50 ul APV (5mm) </li></ul> Laisser la solution à température ambiante au clair. Notez que la solution d&#39;enzyme apparaîtra «trouble» au début et a besoin d&#39;effacer avant de l&#39;utiliser. Tube # 2 et # 3: Inhibiteur de l&#39;enzyme Salut: 3 ml DS + 300 pl de BSA / Ti + 30 ul APV (5mm). Mélanger doucement pour éviter les bulles, puis diviser en deux aliquotes de 1.5ml. Tube n ° 4 - # 6: Inhibiteur de l&#39;enzyme basse: 8 ml DS + 80 ul de BSA / Ti + 80 ul APV (5mm). Mélanger doucement pour éviter les bulles, la diviser en trois aliquotes 2,6 ml. Placer les tubes numérotés # 2 à # 6 sur la glace. Laisser le tube n ° 1 (solution enzymatique) à température ambiante. SOLUTIONS ET aliquotes <ul><li> Solution A (Buffered Saline) Sigma Formule poids de 500 ml [conc.] </li><li> Chlorure de sodium NaCl S-9625 58,45 80.0g 137mm </li><li> Chlorure de potassium KCl P-4504 74.56 4.0g 5.4mm </li><li> Phosphate de sodium dibasique anhydre Na 2 HPO 4 S-0876 142,0 0,24 g 0.17mm </li><li> Potassium phosphate monobasique anhydre KH 2 PO 4 P-5379 136.09 0.3g 0.22mm </li></ul> Peser tous les ingrédients et mélanger jusqu&#39;à dissoudre avec 400 ml d&#39;eau filtrée ultra. Amener le volume final de 500 ml. Placer dans un flacon propre et autoclave. Conserver à 4 ° C et l&#39;étiquette «Solution DS A». <ul><li> Solution B (HEPES) Sigma Formule poids de 250 ml [conc.] </li><li> Hepes Hepes H-3375 283,3 9,9 mm 20.97g </li></ul> Ajouter ultra-filtrée de l&#39;eau jusqu&#39;à 200 ml. Mélanger jusqu&#39;à dissolution et amener le volume final à 250 ml. Placer dans un flacon propre et autoclave. Conserver à 4 ° C et l&#39;étiquette «Solution DS B». <ul><li> Solution de travail de 500 ml [conc.] </li><li> Ultra eau filtrée 400 ml </li><li> Une solution stock de 25 ml </li><li> Solution mère B 14 ml </li><li> D (+)-Glucose Sigma G-8270 3,0 g 33.3mM </li><li> Saccharose Sigma S-0389 7,5 g 43,8 mM </li></ul> Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH 1N. Amener le volume final à 500 ml avec de l&#39;eau filtrée ultra. Transvaser dans une bouteille en verre propre et autoclave. Conserver à 4 ° C. Label &quot;Solution de dissection». Poly-D-Lysine Préparation: <ol><li> Préparer une solution stock de 10x de poly-D-lysine (PDL; Sigma P-7280) en H 2 O stérile à 1mg/ml. </li><li> Faire aliquotes de 1,0 ml. Cette solution peut être conservée à -20 ° C jusqu&#39;à 3 mois. </li></ol> MEDIA <ol><li> Ajouter 10ml de B-27 Supplément (Gibco 17504-044) à 500 bouteilles NBM ml (milieu Neurobasal, Gibco 21103-049). </li><li> Faire aliquotes de 40 ml et conserver à 4 ° C. </li></ol> APV <ol><li> Ajouter 10 ml stériles H 2 O pour flacon de 10 mg APV (2-amino-5-phosphonopentanoic acide, Sigma A-5282) et bien mélanger. </li><li> Préparer 180 aliquotes et stocker à -20 ° C. </li></ol> BSA / Ti <ol><li> Dissoudre 1 g de BSA (albumine bovine. Sigma A-7030) et 1 g d&#39;inhibiteur de trypsine (Sigma T-9253) dans 10 ml DS. </li><li> Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH 1N. </li><li> Stériliser par filtration sur filtre seringue 0,2 um. </li><li> Diviser en 400 aliquotes et stocker à -20 ° C. </li></ol> L-CYSTÉINE Dans un tube Eppendorf dissout 0,6 mg de L-cystéine (Sigma C-7755) dans 200 ul DS. AGAR (4%) <ol><li> Dissoudre 4 g d&#39;agar Bacto (Difco 0140-01) dans 100 ml d&#39;eau stérile. Conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire pour la culture. </li><li> Agar à micro-ondes pour faire fondre et de remplir un plat de Pétri de 35 mm. Laisser reposer pour refroidir et polymériser. </li></ol> Papaïne (Worthington LS 03126) e_title &quot;&gt; non neuronales CULTURES EN BOUTEILLES DE CULTURE NUNC Flacon de culture REVÊTEMENT (4 bouteilles Nunc) <ol><li> Ajouter 9 mL d&#39;eau stérile pour chacun des 3 tubes de PDL 10X pour rendre PDL 1X. </li><li> Transfert de 30 ml 1X PDL dans la première bouteille. </li><li> Déplacer légèrement jusqu&#39;à ce que toutes les surfaces sont couvertes de croissance. Laisser reposer pendant 1 min. </li><li> Transfert 1x PDL à la deuxième bouteille. Laisser reposer pendant 1 min. </li><li> Répétez l&#39;opération avec les bouteilles troisième et quatrième. </li><li> Rincez tous les quatre bouteilles 2X avec 150 ml stériles H 2 O. </li></ol> PRÉPARER solution enzymatique (ES): <ol><li> Dans un poids de 0,6 ml par tube de centrifugeuse de 0,8 mg de L-cystéine (Sigma C7755), ajouter 150ml et DS vortex jusqu&#39;à cristaux sont dissous. </li><li> Transférer 5 ml DS à un tube de 15 ml conique, puis ajouter 150 ml de L-cystéine. </li><li> Ajouter 50 unités papaïne. (Worthington LS 03126) </li><li> Ajouter 7ml NaOH 0,1. </li></ol> PRÉPARER MEM (Gibco # 11090-081) <ol><li> Retirer 65 ml de la bouteille de 500 ml MEM. Économisez 10 ml pour préparer glucose. </li><li> Ajouter 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15070-063). </li><li> Ajouter 10 ml de glucose 1M (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml MEM) </li><li> Ajouter 50 ml de sérum bovin fœtal (Gibco # 16140-071) ou Bovine sérum de veau (Omega BC-04). </li><li> Mélangez bien, aliquote et conserver à 4 ° C. </li></ol> Neurobasal SUPPLÉMENT MEDIUM/B-27 (NBM/B27) MNB, 500 ml (Gibco # 21103-049), B-27 (50X), 10 ml (Gibco # 17504-044) <ol><li> Ajouter le contenu entier du flacon B-27 à la bouteille NBM et mélanger. </li><li> Aliquoter et stocker à 4 ° C. </li></ol> DISSECTION du tissu cérébral <ol><li> Dry dissection des outils à partir d&#39;EtOH 70% avant la dissection. </li><li> Transférer 10 ml dans chaque DS de 3-15 ml tube. </li><li> Sélectionnez souriceaux (P0 - P3), vous aurez besoin de trois cerveaux pour 4 bouteilles. </li><li> Ajouter DS à froid de 35 mm boîte de Petri. </li><li> Décapitez souris chiot et disséquer le cerveau. </li><li> Placez le cerveau dans la boîte de Pétri contenant DS froid. </li><li> Hacher les tissus en morceaux, assez petit pour passer à travers une pipette en verre. </li></ol> ENZYME DISSOCIATION <ol><li> Retirez le DS autant que possible de l&#39;antenne avec une pipette Pasteur. </li><li> ES Filtrer à travers une seringue filtre de 0,2 um et 5cc. </li><li> Placez ES dans le plat avec du tissu. </li><li> Incuber les tissus à 37 ° C incubateur (CO 2 gratuits) pendant 30 min. </li></ol> LAVAGE DE TISSUS <ol><li> Tissus de transfert avec pipette en verre pour le premier tube DS, en veillant à obtenir ES peu que possible. </li><li> Centrifuger pendant 30 sec à 1500 rpm. </li><li> Transfert des tissus et la procédure répéter deux fois plus. </li></ol> TRITURATION <ol><li> Placer 38 ml de MEM / FBS dans un tube de 50ml centrifugeuse </li><li> Ajouter 3 ml de MEM / FBS à un plat de 35 mm et le tissu transférer à cette boîte de Pétri. </li><li> Dissocier le tissu par trituration doucement grâce à une astuce eppendorf pipette 1000μl. </li><li> Transfert suspension cellulaire dans le tube contenant 38ml de MEM / FBS et mélangez bien. </li></ol> PLACAGE <ol><li> Placez la bouteille de culture verticale pour obtenir des quantités égales de la suspension cellulaire et des médias dans chaque bouteille. </li><li> Mettez 90 ml de MEM / FBS dans chaque flacon de culture. </li><li> Ajouter 10 ml de suspension cellulaire dans chaque bouteille. </li><li> Label: non-neuronales, les initiales et la date. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> ALIMENTATION <ol><li> Au jour 3 ou 4, les cellules chaudes nourrir avec MEM / FBS (décanter tous les médias et le remplacer par 100 ml de MEM / FBS). Cultures peut prendre 7-10 jours pour devenir confluentes. </li><li> Sur le changement de 7-10 jours les médias pour NBM/B27. </li><li> Le lendemain, recueillir les médias. Filtre avec 0.22μm </li><li> Faire des aliquotes de 40 ml et nourrir la culture avec MEM / FBS. </li><li> Suivant 2 ou 3 jours, le changement des médias pour NBM/B27 </li><li> Le lendemain, recueillir et répéter la procédure. </li><li> Gardez la collecte des médias pour env. 2 semaines. </li></ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

<table><tbody><tr><td>5-Fluoro-2&amp;rsquo;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Vibraslicer</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Supplément B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Neurobasal (NBM)</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Acide 2-amino-5-phosphonopentanoïque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>Albumine bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>Solution d'hydroxyde de sodium, 1N</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Papaine</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS 03126</td><td></td></tr><tr><td>Filtre stérile pour seringue, 0,2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>DDA02025S0</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-objets en verre, n°1, 12 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-00012</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Essentiel Minimum (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11090-081</td><td>avec les sels d'Earle&amp;rsquo;s, sans L-glutamine, nécessaire pour la culture de cellules non neuronales</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>pour la culture de cellules non neuronales</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td>nécessaire pour les cultures non neuronales</td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire Nunclon &quot;Triple Flask&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-25</td><td>À utiliser pour les cultures non neuronales. Ces flacons sont très pratiques pour produire du &quot;milieu Neurobasal/B27 conditionné&quot;, mais tout autre flacon ou boîte de culture cellulaire peut être utilisé à la place.</td></tr><tr><td>Boîtes de culture &quot;Imaging dishes&quot; à fond en verre</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Boîtes de culture de 35 mm à fond en verre, idéales pour l'imagerie calcique ou sodique en configuration de microscope inversé. Mais coûteuses !</td></tr></tbody></table>

préparation de cultures souris dissocié neurones corticaux

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Cette vidéo va vous guider à travers le processus pour générer des cultures de neurones corticaux de l&#39;embryon et au début de cerveau de souris postnatale. Ces cultures peuvent être utilisés pour une variété d&#39;applications, y compris immunocytochimie, biochimie, électrophysiologie, d&#39;imagerie du calcium et de sodium, de protéines et / ou d&#39;isolement d&#39;ARN. Ces cultures fournissent également une plateforme pour l&#39;étude du développement neuronal des animaux transgéniques qui portent une mutation du retard embryonnaire ou postnatale gène létal. La procédure est relativement simple, nécessite une certaine expérience dans la technique de culture de tissus et ne devrait pas prendre plus de deux à trois heures si vous êtes bien préparé. Attention séparation de l&#39;écorce corticale par le tractus de fibres thalamo-cortical permettra de réduire le nombre des grossesses non désirées cellules non-neuronales. Pour accroître les rendements des cellules neuronales triturer les pièces du tissu cortical doucement après l&#39;étape d&#39;incubation enzymatique. C&#39;est impératif car elle prévient les blessures inutiles aux cellules et la mort prématurée de cellules neuronales. Étant donné que ces cultures sont maintenues en l&#39;absence de cellules nourricières glie, ils offrent également un avantage supplémentaire de cultures de plus en plus enrichies en neurones.

Cette vidéo montre une procédure pour générer cultures de neurones de l&#39;embryon et au début du cortex de souris postnatale. Ces cultures peuvent être utilisées pour l&#39;immunocytochimie, la biochimie, l&#39;électrophysiologie, de calcium et de sodium d&#39;imagerie et de fournir une plateforme pour l&#39;étude du développement neuronal des animaux transgéniques qui portent une mutation du gène létal postnatale.

Préparation de cultures souris Dissocié neurones corticaux

Cette vidéo vous guidera à travers le processus de génération de cultures de neurones corticaux à partir du cerveau de souris à un stade embryonnaire tardif et au début de la période postnatale. Ces cultures...

Bonjour, je m'appelle Hilgenberg. Je travaille ici à l'université de Californie à Irvine, au sein du département d'anatomie neurobiologie. Aujourd'hui, je vais vous parler de la manière dont nous préparons des cultures corticales à partir de souris.Ce sont des souris au jour postnatal dont nous préparons ces neurones. Et nous utilisons généralement ces cultures soit pour l'électrophysiologie, soit pour la préparation de protéines ou d'ARN. Nous utilisons la même préparation de culture pour l'imagerie calcique ou l'imagerie sodique.La particularité intéressante de ces cultures, c'est qu'il s'agit en réalité d'une adaptation du protocole du banquier, mais nous faisons pousser ces cultures en l'absence de cellules nourricières gliales, ce qui les rend beaucoup plus pratiques, et les cultures contiennent généralement davantage de neurones que de cellules gliales. Commençons donc, et je vais vous montrer comment nous préparons ces neurones. Très bien, nous sommes maintenant arrivés au stade où nous pouvons extraire le cerveau et commencer la dissection proprement dite.Mais avant, il est important de mentionner que les lamelles sur lesquelles vous souhaitez ensemencer ces cellules doivent être revêtues. Nous avions l'habitude de le faire, généralement pendant la nuit à température ambiante, avec une concentration de polylysine de 0,1 milligramme par millilitre. Le lendemain, nous retirons la polylysine et lavons les lamelles trois fois de suite.En fonction de l'application, vous utilisez des grandes boîtes ou des petites boîtes, ou vous pouvez utiliser des lamelles en verre. Voilà, c'est là l'installation typique pour la hotte, et je vous ai brièvement expliqué quelles solutions vous devez avoir prêtes, ainsi que quels instruments s'avèrent utiles pour l'isolement ou la dissection du cerveau, puis pour la coupe proprement dite du cerveau. Ce que nous avons ici, c'est la solution de dissection, qui est froide.Normalement, il est sur de la glace. Nous disposons d’un microtome vibratome permettant de sectionner les cerveaux. J’ai un bac contenant une solution de dissection sur laquelle le cerveau est monté, puis tranché.J'ai différents outils dont j'ai besoin pour l'extraction du cerveau. J'ai une plaque foreuse. C'est une foreuse 4 % que j'utilise pour maintenir le cerveau en place.Nous avons besoin d'une seringue, de quelques filtres stériles, de boîtes en papier Rotman, de boîtes de Pétri de différentes tailles. Et voici mon outil de frappe pour pipette à souris. J'ai également des pipettes en verre tirées ici.Il s'agit de capillaires en verre que j'utilise comme outils de dissection ainsi que pour prélever les morceaux de cerveau et les manipuler de manière répétée. Notre solution enzymatique contient donc une solution de dissection. Elle comprend de la L-cystéine pour activer la pepsine, ainsi que de l'hydroxyde de sodium 0,1&nbsp;N pour équilibrer le pH.Une fois que vous avez ajouté la pepane, la solution est légèrement opaque et doit devenir limpide avant que nous puissions réellement l'utiliser pour digérer enzymatiquement le tissu. Et maintenant, nous sommes essentiellement prêts à commencer la procédure. Le fibro Slicer a été préparé.J'ai inséré une lame qui sectionne mon cerveau et j'ai également placé en dessous le récipient contenant le tampon et supportant le cerveau. Je suis maintenant prêt à monter le bloc d'AGA sur ma plaque de support qui soutiendra également le cerveau. Cet AGA est polymérisé, il s'agit d'un AGA à 4 %, et je vais simplement couper à travers une zone de ce type.Et sur les côtés, on obtient essentiellement un taraud rectangulaire découpé. Ensuite, j'utilise une spatule pour extraire simplement cette pièce du bloc du taraud. Et maintenant, je vais coller ce taraud sur ma plaque de support, le côté plat du taraud étant orienté vers l'avant.Voici donc le support sur lequel le cerveau est collé et qui le maintient en place à l’aide de cette vis sans fin. Ainsi, lorsque nous effectuons la section dans ce sens, le cerveau ne bouge pas vers l’arrière. Nous sommes maintenant prêts à retirer le cerveau.Normalement, nous utilisons une souris P0 ou P1. Très bien, voici la tête de souris décapitée et je vais simplement retirer rapidement le crâne. Je vais d'abord couper la bande musculaire située ici et de l'autre côté.Ensuite, j'interviens avec mes ciseaux. Je fais très attention à ce que l'intérieur des ciseaux n'endommage pas le cerveau. Je coupe tout autour du crâne des deux côtés.Et maintenant, nous pouvons simplement soulever le cartilage et je vais utiliser ma petite ULA pour retirer le cerveau comme ceci. Ce cerveau est ensuite placé dans ma boîte de Pétri, que j'ai remplie de solution de sectionnement et qui contient un papier filtre Watman au fond. Ce que je souhaite faire maintenant est de couper la base du cerveau afin d'obtenir une surface solide et plane pour monter le cerveau sur mon porte-échantillon.Je vais donc déposer une très petite goutte de colle folle sur ma plaque de support. Je vais maintenant prendre mon cerveau avec la spatule, en utilisant mes pinces courbes pour m'aider. Ce que je veux faire, c'est essentiellement éliminer la goutte de liquide excédentaire provenant de la solution de dissection, puis je vais monter le cerveau contre mon support en taraud.Nous sommes maintenant prêts à transférer le cerveau dans le bain tampon. J'ajoute donc de la solution de dissection dans ce petit récipient et je vais y placer le support qui maintient le cerveau. Celui-ci est monté avec le cerveau tourné vers la lame.Très bien, le cerveau est maintenant fixé et je vais utiliser le coupe-fibres pour tenter de localiser le début du cerveau, en déplaçant le cerveau vers la lame. J'ai juste coupé un petit morceau de l'organe olfactif. Maintenant, je descends ma lame d'environ 600 micromètres et j'effectue une autre coupe, qui doit traverser exactement le cortex.Voilà le cortex qui monte sur la lame. Je déplace ma lame de 600 micromètres vers le bas et je coupe la deuxième section. Il est important que cette opération soit effectuée de manière continue, sans interruption, et de façon régulière.Et lorsque vous retirez la lame, vous arrêtez le coupe-fibre. Maintenant, je vais utiliser une pipette en verre que j'ai utilisée à l'envers. J'utilise en fait l'extrémité arrière, et je vais déplacer cette section corticale ici et la transférer dans une boîte de Pétri propre.Je progresse à travers le cerveau, toujours de 600 micromètres, jusqu'à ce que j'aie collecté environ cinq à six tranches pour une souris P zéro ou P un. Et ce jusqu'à l'extrémité même du cortex. Nous sommes maintenant prêts à isoler le cortex du reste du cerveau.Très bien, j'utilise des pipettes en verre, tirées jusqu'à former une pointe aussi fine que des outils de dissection. Je commence généralement par la première section obtenue, qui est la plus petite et correspond au bulbe olfactif que nous devons retirer. J'essaie également de retirer les méninges de cette préparation.Encore une fois, retirez l'olfactif de ce fragment, en l'épluchant délicatement des méninges. Parfois, vous avez des morceaux que vous ne pouvez pas séparer facilement ; dans ce cas, passez simplement à la suite et laissez ces fragments derrière les bons morceaux. Je progresse toujours vers une extrémité, en travaillant méthodiquement section après section.Il est important que vous éliminiez les méninges et que, lorsque vous examinez ces sections, vous les retourniez parfois afin de mieux voir où se trouve le faisceau de fibres contenant la majorité des cellules non neuronales que vous ne souhaitez pas conserver dans cette préparation. Sur cette section, on observe clairement ce faisceau de fibres situé sous la couche corticale. Je pique donc juste entre l'endroit où la couche corticale se termine et le faisceau de fibres que j'indique, lequel contient la plupart des cellules non neuronales que nous cherchons à éviter dans cette préparation.Je coupe donc le long de cette ligne, en essayant de laisser les faisceaux fibreux en arrière. C'est à cette étape que vous hachez le tissu en petits cubes. Très bien, je stérilise maintenant ma solution enzymatique à l'aide d'un filtre de 0,2 micron fixé à une seringue.Et j'ajoute cela directement sur mes morceaux corticaux, comme ceci. Veillez à ce qu'il y ait suffisamment de liquide entourant tous les morceaux corticaux ; ces morceaux sont ensuite placés dans un incubateur à 37 degrés pendant 30 minutes, ce qui devrait ramollir considérablement le tissu. Les morceaux corticaux ont donc passé 30 minutes à l'incubation dans l'incubateur.En attendant, j'ai réchauffé un milieu neurobasal contenant le supplément B 27, dans lequel ces cellules seront finalement placées. J'ai également préparé quelques solutions ici. La première est la solution de dissection.Il s'agit donc d'une solution de dissection ordinaire. Ensuite, elles sont transférées dans une solution riche en inhibiteur de la trypsine contenant de l'albumine sérique bovine (BSA) comme agent piégeur et un PV pour bloquer le composant du récepteur NMDA. Puis, elles subissent trois lavages avec une solution de BSA et un PV contenant une faible concentration d'inhibiteur de la trypsine. Je vais maintenant retirer ces fragments de la solution de propane et les transférer dans un tube conique contenant la solution de dissection DS.Ces agrégats vont simplement descendre par gravité et cela peut prendre une à deux minutes avant qu’ils ne s’installent tous dans la partie conique du tube. Ensuite, je les reprendrai et je les transférerai dans la solution contenant l’inhibiteur de trypsine à forte concentration. Là encore, nous devons attendre que ces agrégats s’installent au fond du tube.Il y a un dernier lavage à l’aide d’une solution riche en inhibiteur de la trypsine, puis ces agrégats sont lavés dans une solution pauvre en inhibiteur de la trypsine. Après mon dernier lavage et l’ajout de l’inhibiteur d’enzyme à faible concentration, je vais transférer les cellules dans mon milieu neurobasal préchauffé et commencer à dissocier mécaniquement les cellules en les faisant passer plusieurs fois vers le haut et vers le bas dans une capillaire en verre dont le diamètre diminue progressivement. Je vais maintenant taper les cellules ainsi que les agrégats de tissu.Mais avant cela, je vais retirer tous les débris visibles ici. Il y a, par exemple, des protéines et de l'ADN qui s'échappent des cellules et forment cette matière filamentaire, semblable à de la ouate, qui adhère aux agrégats de tissu. Vous souhaitez d'abord éliminer cela, car cela obstrue la pointe de votre pipette et vous oblige à forcer le tissu à traverser un diamètre plus étroit.Ensuite, je vais casser certaines de ces capillaires en verre afin d'obtenir une ouverture de la taille appropriée pour faire entrer et sortir mes cellules par l'ouverture. Cette pipette est bonne. Celle-ci, vous pouvez voir qu'elle est bien ronde et ne présente aucune arête vive.Je vais insérer ceci dans mon embout de pipette pour souris. Un filtre de 0,2 micron est placé en interposition, et je vais maintenant déplacer les tissus à l’intérieur et à l’extérieur de ma capillaire en verre. La première étape devrait donc se dérouler assez facilement, car les agrégats tissulaires ne sont pas beaucoup plus gros que l’orifice de la pipette.Tout ce que vous voulez faire, c'est détendre le tissu. Ensuite, j'utilise une pointe de pipette légèrement plus petite. Je préfère avoir une pointe de pipette bien ronde et propre.Cela semble bon. Et encore une fois, tous les agrégats sont déplacés ensemble à l'intérieur et à l'extérieur du tube en un seul mouvement. Le tissu est désormais très mou et détendu, de sorte que si vous resuspendez ces agrégats dans du milieu, les cellules sortiront pratiquement d'elles-mêmes.Je vais maintenant transférer toutes mes cellules dissociées dans un nouveau tube conique de 15 millilitres, puis je les réfrigère peut-être deux ou trois fois supplémentaires, en aspirant doucement vers le haut et vers le bas afin de dissocier les cellules qui se trouvent encore dans de plus gros agrégats. Ensuite, nous devons attendre une à deux minutes pour que les plus gros fragments présents dans le tube se déposent au fond. Par ailleurs, vous pourriez avoir des morceaux de verre provenant des capillaires en verre que vous avez cassés, lesquels devraient également s'accumuler au fond.Ensuite, nous pouvons utiliser des aliquotes de ce milieu pour les ensemencer sur des lamelles ou des boîtes entièrement recouvertes de ly. J'ensemène 80 microlitres sur cette lamelle en verre préalablement recouverte de polylysine, ce qui forme une belle bulle. Les cellules finiront par se déposer et adhérer à la lamelle en verre.Après environ une heure, les cellules se sont déposées et je vais ajouter très doucement un peu de milieu supplémentaire sur toute la surface de la boîte. On peut donner un léger mouvement de rotation circulaire, comme ceci. Ensuite, ces cellules sont placées dans l'incubateur à 37 degrés, et demain je les alimenterai avec du milieu conditionné.Très bien, ce sont des cellules corticales. Elles ont un peu moins d'un jour. Elles ont été ensemencées hier et vous pouvez voir qu'il y a de nombreux neurones, tous présentant de nombreux prolongements neuronaux, ainsi que des débris cellulaires.Il s'agit des cellules qui n'ont pas survécu. Elles seront éliminées lors des prochains changements de milieu. Les cellules mortes sont de très petites cellules rondes présentant des membranes en bourrelets.J'ai simplement montré comment préparer ces cultures corticales dissociées. Il est important de se rappeler que, lors du retrait de la croûte corticale des tranches de cerveau, il faut la séparer des fibres thalamocorticales, car elle contient de nombreuses cellules non neuronales. De plus, lors de la trituration des cellules, ne pas trop insister, car cela tue essentiellement la majorité des cellules isolées que vous avez obtenues jusqu'à présent.Alors, soyez délicat avec les tranches de tissu et vous obtiendrez une culture magnifique. Bonne chance dans vos expériences.

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