Évaluation des lésions induites par la sénescence et In Vivo reprogrammation dans le Muscle squelettique

L'objectif général de ce protocole est d'évaluer à la fois la sénescence et le reprogrammation in vivo dans le muscle squelettique suite à une lésion tissulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la médecine régénérative, telles que la manière d'améliorer la plasticité cellulaire afin de favoriser la régénération musculaire. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à fournir une méthode fiable pour détecter et quantifier les cellules sénescentes dans leur environnement résidentiel.

Le vieillissement cellulaire a récemment été mis en évidence dans la réparation et la régénération des tissus. Comprendre les mécanismes par lesquels le vieillissement contribue à la réparation tissulaire et à la régénération aura certainement un impact sur la médecine régénérative. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons étudié l'impact potentiel des lésions tissulaires sur la reprogrammation in vivo dans le muscle squelettique.

Pour commencer cette procédure, fixer les lames contenant les échantillons musculaires dans du PBS contenant 1 % de paraformaldéhyde et 0,2 % de glutaraldéhyde pendant quatre minutes. Ensuite, laver les lames deux fois avec du PBS, chaque fois pendant 10 minutes. Puis, laver les lames avec du PBS, pH 5,5, pendant 30 minutes.

Ensuite, incuber les coupes avec la solution de X-gal à l'obscurité à 37 degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Par la suite, laver les lames avec du PBS trois fois, chaque fois pendant 10 minutes. Puis, fixer les lames à l'aide de PBS contenant 1 % de paraformaldéhyde pendant 30 minutes.

Enfin, laver les lames avec du PBS trois fois. Ensuite, contre-colorer avec de l'éosine 0,2 % en immergeant les lames dans la solution d'éosine pendant une minute. Puis, les rincer brièvement avec de l'eau distillée.

Montez les lames avec un milieu de montage aqueux non fluorescent. Fixez les lames avec du PBS contenant 4 % de paraformaldéhyde pendant 10 minutes. Rincez-les deux fois avec du PBS, chaque rinçage durant 10 minutes.

Ensuite, ajoutez la solution de perméabilisation et incubez pendant cinq minutes. Après cela, lavez les lames deux fois avec du PBS, chaque lavage durant cinq minutes. Lors du dernier lavage, ajoutez directement sur les lames 200 microlitres de PBS contenant 0,25 % de BSA, et laissez agir pendant cinq minutes.

Incuber les lames avec l'anticorps primaire anti-Nanog à 1,25 microgramme par millilitre pendant la nuit à 4 degrés Celsius dans du PBS contenant 5 % de FBS. Laver les lames deux fois avec du PBS, chaque fois pendant 10 minutes. Lors du dernier lavage, utiliser 200 microlitres de PBS contenant 0,25 % de BSA pendant cinq minutes.

Incubez ensuite les lames avec 100 microlitres d'anticorps secondaire RAB-HRP provenant d'un kit prêt à l'emploi pendant 45 minutes. Puis, lavez les lames au PBS trois fois, cinq minutes à chaque fois, afin d'éliminer l'anticorps secondaire. Ensuite, diluez le DAB dans le tampon substrat fourni par le kit prêt à l'emploi.

Vortexer vigoureusement. Ajouter 100 microlitres de solution DAB directement sur chaque lame et incuber pendant un maximum de 10 minutes à température ambiante. Ensuite, éliminer la solution DAB en rinçant les lames à l’eau.

Contrecolorer les lames avec la solution de rouge rapide pendant deux minutes. Ensuite, rincer les lames à l'eau à nouveau, brièvement. Puis, les déshydrater avec de l'éthanol à 95 % pendant cinq minutes, suivis de deux passages dans de l'éthanol à 100 %, chacun durant cinq minutes.

Ensuite, montez les lames avec un milieu de montage à durcissement rapide. Observez les lames au microscope en champ clair à un grossissement de 20x afin d'éviter les interférences de fond. Lors de cette étape, examinez les lames et sélectionnez les deux sections de meilleure qualité sur chaque lame, situées à la distance maximale possible l'une de l'autre, en fonction de l'intégrité du tissu, de la qualité de la coloration et de la contre-coloration.

Comptez les cellules positives pour la SA-Bêta-Gal dans ces deux sections et calculez la valeur moyenne. Ensuite, déterminez l'intervalle de la taille des pixels en sélectionnant manuellement les cellules positives pour la SA-Bêta-Gal les plus petites et les plus grandes. Dans l'interface ImageJ, cliquez sur Analyser, Outils, Gestionnaire de zones d'intérêt (ROI Manager), Analyser, Définir les mesures.

Ensuite, sélectionnez Zone. Utilisez l'outil de sélection pour entourer la cellule SA-Beta-Gal positive la plus petite et la plus grande, puis ajoutez-les au gestionnaire de régions d'intérêt (ROI Manager) en cliquant sur Ajouter. Mesurez ensuite les tailles à l'aide du bouton Mesurer et enregistrez les valeurs pour une utilisation ultérieure.

Ensuite, ajustez le paramètre de seuil pour vous assurer que toutes les cellules positives visibles sont sélectionnées. Convertissez l'image en niveaux de gris en cliquant sur Image, Type, puis 8 bits. Ensuite, accédez à Image, Ajuster, puis Seuil.

Déplacez le deuxième curseur jusqu'à ce que toutes les cellules SA-Beta-Gal positives soient recouvertes en rouge, puis cliquez sur Appliquer. Analysez les particules en cliquant sur Analyser, Analyser les particules, puis sélectionnez Taille et appliquez la valeur définie précédemment. Saisissez la circularité, 0,00-1,00, puis cliquez sur OK. Un résumé de toutes les particules comptées s'affichera dans le gestionnaire de régions d'intérêt (ROI Manager).

Transférez maintenant toutes les particules sélectionnées vers l'image d'origine. Ajustez manuellement la sélection pour garantir une quantification précise. Ajoutez les cellules positives ou supprimez les cellules faussement positives.

Enfin, mesurer la zone en délimitant la section à l’aide de l’outil de sélection. Cliquer sur Gestionnaire de ROI, Ajouter, puis Mesurer. Au microscope, compter manuellement les cellules positives à Nanog en champ clair à un grossissement de 20x.

Voici une représentation schématique permettant d'évaluer la reprogrammation in vivo et le niveau de sénescence après une lésion musculaire. Ci-dessous figurent des images représentatives de la coloration SA-Beta-Gal et de la coloration de Nanog sur des sections congelées de muscle squelettique lésé. Ces images montrent la coloration SA-Beta-Gal, contre-colorée à l'éosine, ainsi que la coloration de Nanog, contre-colorée au rouge rapide.

Les muscles non lésés sont représentés en haut, tandis que les muscles lésés sont représentés en bas. Ce graphique montre la quantification et la corrélation des cellules positives pour SA-Beta-Gal et des cellules positives pour Nanog dans des sections consécutives à 10 jours après la lésion. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de toujours inclure un contrôle négatif afin de garantir la spécificité de la coloration.

Après avoir suivi cette procédure, toutes les méthodes, comme l'immunofluorescence ou le choix de différents marqueurs de sénescence, peuvent être appliquées à tous les types cellulaires afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'identité cellulaire des cellules sénescentes. À la suite de chaque avancée, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la sénescence ou de la réparation et de la régénération tissulaires, leur permettant d'explorer comment la sénescence cellulaire peut favoriser la plasticité cellulaire afin de faciliter la réparation et la régénération tissulaires chez les mammifères. Ainsi, après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'identifier in vivo les cellules sénescentes et les cellules reprogrammées.