Name: Quantification de l’abondance et la recharge des niveaux d’ARN de transfert chez Escherichia coli (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Découvrez une méthode pour quantifier l'abondance et la recharge des ARN de transfert chez Escherichia coli. Cette technique permet de comparer les niveaux d'ARN entre différents états de croissance cellulaire.

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Les auteurs remercient Marit Warrer excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par le Conseil danois pour la recherche indépendante | Sciences naturelles [1323-00343B] et la Fondation National danois de recherche [DNRF120].

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<li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel%28%2B%29+and+Rel%28-%29+strains+during+amino+acid+starvation%3A+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li>
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<li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li>
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<li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation%3A+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit comment mesurer simultanément le niveau de charge spécifique e. coli ARNt et comparer les niveaux relatifs des ARNt dans différents échantillons. Les points critiques du protocole sont 1) pour manipuler les échantillons de telle sorte que les niveaux de charge ARNt cellulaire sont conservées, 2) pour normaliser les quantités de tRNA de telle sorte que les niveaux relatifs de tRNA dans différents échantillons peuvent être comparés avec fiabilité et 3) pour s’assurer de la sp arrangement des so...

Dans ce qui suit, nous présentons une méthode pour quantifier les ARNt spécifiques et mesurer leur charge niveaux par Northern blot. La méthode est basée sur une technique développée par verite et al. 1. par récolte des cellules dans l’acide trichloracétique (TCA) et de garder les échantillons à 0 ° C tout au long de la purification de RNA, la liaison ester entre l’ARNt et l’acide aminé est conservé2,3,4. ARNt tRNALeu peut distinguer de leurs homologues nonacylated par électrophorèse sur gel et le transfert de Northern, dû à une diminution de la mobilité de la tRNALeu ARNt dans le gel, causé par l' aminoacide covalente5. En outre, nous présentons un protocole pour normaliser les quantités ARNt par addition du spike-dans les cellules surexprimant la rarement utilisé tRNAselC 4.
ARNt est des molécules plus abondants dans la cellule bactérienne et une partie indispensable de la machinerie de traduction. ARNt lie les acides aminés et les transférer sur les ribosomes traduction. La liaison des acides aminés d’ARNt (aminoacylation ou charge) est facilitée par l’aminoacyl tRNA synthétases. L’abondance relative des différents ARNt chargé est importante pour assurer la fidélité de la synthèse protéique, parce que la sous-représentation de l’apparenté facturés Qu'arnt pour un codon donné l’ARN messager (ARNm) augmente la probabilité d’un ARNt près-apparenté sera livrer par erreur son acide aminé à la chaîne de polypeptide croissant sur le ribosome6. L’importance de l’ARNt chargé est reflétée dans la vaste réponse de la cellule d’e. coli à une chute sévère dans les niveaux de charge d’un ARNt ; la réponse stricte. Au cours de la réponse stricte, la synthèse des ARNt, ARN ribosomal et la plupart des ARNm est abaissée en faveur de la transcription de l’ARNm spécifiques associées aux acides aminés la biosynthèse et du stress de survie, et le taux de croissance des cellules est abaissé de façon spectaculaire7 . En outre, des travaux récents par nous et d’autres ont montré qu’e. coli dégrade activement la majorité de son ARNt en réponse aux contraintes qui limitent la traduction4,8, ce qui suggère que l’ajustement des niveaux ARNt peut être important pour faire face à ces contraintes. Ainsi, des mesures fiables de l’abondance de l’ARNt et niveaux de charge sera un outil important pour bien comprendre les réactions de stress bactérien.
E. coli est couramment utilisée pour exprimer la protéine recombinante et en raison des différences dans l’utilisation de codon entre espèces, expression sous-optimale est un problème souvent rencontré9. Ceci peut être contourné par l’expression des ARNt supplémentaires nécessaires pour la traduction des ARNm recombinants10. Mesures de tRNA charge niveaux dans ces souches pourraient orienter les travaux de dépannage et vous aider à optimiser l’expression de la protéine.
Cette méthode permet également la détection de « mischarging » ; une molécule de tRNA tRNALeu avec un aminoacide non apparenté. Aminoacylation par différents acides aminés peut entraîner un ARNt migrer avec des vitesses légèrement différentes à des gels de polyacrylamide1,11. Dans certains cas, la méthode peut aussi servir à distinguer les modèles modification différente sur l’ARNt autrement identiques3.
Un autre a établi une procédure biochimique pour l’oxydation de l’enquête de l’ARNt niveaux de charge est périodique. La méthode repose sur l’observation que tRNALeu tRNA est protégé contre oxydation périodique et ARNt sans inculpation n’est pas. Le periodate après traitement d’oxydation la recharge de l’ARNt est utilisée pour estimer les niveaux de charge de l’ARN récolté. Toutefois, la recharge de plusieurs ARNt s’est avérée être affectées par le traitement, permettant ainsi une inexactitude12. La méthode présentée ici des mesures directement à partir de l’ARN purifié de charge, ce qui exclut tout biais de réactions chimiques ou enzymatiques. Une des limites de cette méthode est qu’une seule espèce de tRNA est détectée à la fois, donc même si la même Northern blot peut être dépouillé et reprobed pour plusieurs ARNt, c’est beaucoup de temps et un peu laborieux à recueillir des données sur plusieurs ARNt.
Un moyen fiable de normaliser les échantillons entre eux est vital dans les études dont le but est de comparer les niveaux relatifs d’une molécule à travers différents échantillons. Ici, nous introduisons une procédure de normalisation pour l’ARN où une petite aliquote d’e. coli cellules surexprimant la rare tRNAselC est ajoutée comme un épi-en à tous les échantillons expérimentaux avant purification RNA. Cette méthode est utile non seulement lors de l’examen des ARNt, mais pour la quantification relative de toutes les espèces d’ARN lorsque le montage expérimental est telle qu’aucun RNA endogène ne peut faire confiance pour être présents à la même concentration cellulaire dans tous les échantillons. Par exemple, le niveau d’un ARN ribosomal RNA-like « ménage » est souvent utilisé comme une référence endogène de comparer les quantités relatives d’un autre ARN entre les différents échantillons13. Mais cela est de peu d’utilité si la concentration cellulaire de l’ARN de référence varie selon les échantillons, comme peut être le cas pour les ARN ribosomiques en cas d’échantillonnage pendant un stress réponse15,16,17 ou entrée en phase stationnaire17. L’ajout du spike-dans les cellules pour les échantillons expérimentaux avant purification RNA fournit un moyen solid et précis de normalisation indépendant de l’installation d’échantillonnage. Une autre façon de normalisation est l’ajout d’un ou plusieurs épi-en ARN aux échantillons expérimentaux après purification RNA. Toutefois, cette méthode ne tient pas compte des différences dans la récupération de RNA entre les échantillons.
À l’aide de cellules d’Escherichia coli qu’overexpress l’ARN de référence comme spike-dans les cellules (voir Figure 1) dans une expérience sur e. coli présente l’inconvénient qu’il résulte en outre d’une petite quantité d’exogène e. coli total ARN pour la échantillons. Nous corrigeons pour cet ajout en analysant un échantillon ne contenant que spike-dans des cellules en parallèle avec les échantillons expérimentaux (voir le Northern blot en Figure 2, lane, étiqueté « selC »). Le protocole présenté est développé pour e. coli K-12 mais est susceptible d’être applicable pour la plupart des espèces bactériennes.

<table><tbody><tr><td>Urée</td><td>Merck</td><td>57-13-6</td><td>Pureté >99 %</td></tr><tr><td>Polyacrylamide</td><td>Serva</td><td>79-06-7</td><td></td></tr><tr><td>Bis (N,N'-Méthylène-bis-acrylamide)</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0201</td><td></td></tr><tr><td>Acide trichloracétique (TCA)</td><td>Sigma</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Phénol</td><td>Merck</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, acétate</td><td></td><td></td><td></td>de sodium</tr><tr><td>, EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, éthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>tris,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorhydrique, chlorure</td><td></td><td></td><td></td>de sodium</tr>, <tr><td>NaH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrate</td><td></td><td></td><td></td>de sodium</tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hareng Sperme ADN</td><td>Sigma</td><td>100403-24-5</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polivinylpyrrolidone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P32 &gamma ; ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligos d’ADN (sondes)</td><td>TAG Copenhagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybond N+ membrane</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroblotter</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Four</td><td></td><td></td><td></td>d’hydridisation</tr><tr><td>Geiger-M&uuml ; Tube</td><td></td><td></td><td></td>ller</tr><tr><td>Écran imageur au phosphore</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube</td><td></td><td></td><td></td>d’hybridation</tr><tr><td>Flacons de culture Tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de microcentrifugation de 1,5 ml Tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr> à <tr><td>centrifuger de 20 ml Tubes</td><td></td><td></td><td></td> à centrifuger</tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification de l’abondance et la recharge des niveaux d’arn de transfert chez escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

ARN de transfert (ARNt) est un élément essentiel de la machinerie translationnelle dans n’importe quel organisme. ARNt se lie et transférer des acides aminés dans le ribosome de traduction. Les niveaux relatifs des différents ARNt et le ratio de tRNALeu ARNt au total ARNt, connu comme le niveau de charge, sont des facteurs importants dans la détermination de la précision et la vitesse de translation. Par conséquent, l’abondance et les niveaux de charge des ARNt sont des variables importantes pour mesurer lorsque l'on étudie la synthèse des protéines, par exemple dans diverses conditions de stress. Nous décrivons ici une méthode de récolte des ARNt et directement mesurer tant l’abondance relative et le niveau de charge absolu de certaines espèces de tRNA chez Escherichia coli. L’ARNt est récolté de manière que la liaison labile entre le Tarn et ses acides aminés est préservée. L’ARN est ensuite soumis à l’électrophorèse sur gel et Northern blot, qui se traduit par la séparation des ARNt chargées et non chargées. Les niveaux des ARNt spécifiques dans différents échantillons peuvent être comparés en raison de l’ajout du spike-dans les cellules pour la normalisation. Avant la purification du RNA, nous ajoutons 5 % des cellules d’Escherichia coli qui le rare de tRNAselC à chaque échantillon de surproduction. Le montant de l’espèce de tRNA d’intérêt dans un échantillon est ensuite normalisé à la quantité de tRNAselC dans le même échantillon. Ajout de spike-dans des cellules avant purification RNA a l’avantage sur l’ajout de purifiée spike-en ARN qui elle tient compte également des différences dans l’efficacité de la lyse des cellules entre les échantillons.

Utiliser la procédure décrite ici, l’abondance et la recharge des niveaux de trois tARNs ont été mesurées chez e. coli K-12 avant et acides aminés.
NF9154 la souche auxotrophe de l’arginine (thr leu sa argH thi mtl supE44) a été cultivée depuis au moins dix générations dans un milieu minimal MOPS additionné de 0,4 % de glycérol, 50 µg/mL thréonine, leucine, arginine et histidine de 5 µg/...

Nous présentons ici une méthode pour mesurer directement les ARN de transfert, chargement des niveaux purifiée Escherichia coli RNA, mais aussi un moyen de comparer les niveaux relatifs des ARN de transfert, ou tout autre ARN court, entre les différents échantillons basées sur l’ajout de l’épi cellules exprimant un gène de référence.

Quantification de l’abondance et la recharge des niveaux d’ARN de transfert chez Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

L’objectif global de cette expérience est de quantifier l’abondance et les niveaux de charge des ARN de transfert chez Escherichia coli. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire, telles que la façon dont les niveaux de charge de l’ARNt changent à différents stades de croissance. Le principal avantage de cette méthode est que les niveaux d’ARN peuvent être comparés quantitativement même entre des états de croissance qui modifient radicalement la composition de l’ARN dans les cellules.Commencez cette expérience en cultivant des cultures expérimentales et des cultures d’E. coli selon le protocole texte. Cultivez la culture de pointe à 37 degrés Celsius, tout en secouant à 160 tr/min. Lorsque la culture de pointe a atteint une OD436 d’environ 0,1, induire l’expression de la cellule C de l’ARNt en ajoutant IPTG.Cultivez la culture jusqu’à ce qu’elle atteigne une OD436 d’environ 0,5. Ensuite, déplacez la culture sur de la glace jusqu’à ce que tous les échantillons aient été récoltés. Après cela, préchauffez un ballon de culture de 100 millilitres contenant quatre millilitres de TCA à 10 % pour chaque échantillon dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.Mesurer et enregistrer la DO 436 des cultures expérimentales directement avant la récolte cellulaire. Ensuite, transférez quatre millilitres de culture dans une fiole contenant du TCA préchauffé. Mélangez l’échantillon à la main en remuant le ballon pendant cinq secondes, ce qui désactivera immédiatement toutes les activités enzymatiques en préservant les niveaux de charge des ARNt.Lorsque tous les échantillons ont été prélevés, ajoutez 5 % de cellules de pointe à chaque échantillon. Préparez également un échantillon de contrôle composé uniquement de cellules de pointe, comme décrit dans le protocole de texte. Pour commencer l’extraction de l’ARN, versez huit millilitres de chaque échantillon, y compris les témoins, dans un tube à centrifuger refroidi à la glace.Centrifugez les échantillons à 9, 500 x G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir complètement retiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 0,3 millilitre d’acétate de sodium froid, contenant 10 millilitres d’EDTA. Transférez chaque échantillon dans un tube de microcentrifugation froid de 1,5 millilitre et ajoutez 0,3 millilitre de phénol équilibré avec le tampon, utilisé pour remettre la pastille en suspension.Ensuite, vortex chaque échantillon 10 fois pendant 15 secondes à chaque fois. Avec au moins une minute à zéro degré Celsius entre chaque vortex, pour garder les échantillons froids. Ensuite, centrifugez les échantillons à 20 000 x G à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.Transférez la face supérieure ou la face de l’eau dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajoutez 0,3 millilitre de phénol froid sur le front de l’eau et vortex les échantillons quatre fois 15 secondes chacune, comme décrit précédemment. Ensuite, centrifugez les échantillons à 20 000 x G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Transférez le visage de l’eau dans un nouveau tube de microcentrifugation froid de 1,5 millilitre et ajoutez 2,5 volumes d’éthanol froid à 96 %. Ensuite, incubez les tubes à 20 degrés Celsius pendant une heure pour précipiter l’ARN. Centrifugez les échantillons à 20 000 x G à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Après avoir retiré le surnageant, ajoutez soigneusement un millilitre d’éthanol froid à 70 % à la pastille d’ARN, en veillant à ne pas la déranger. Retournez doucement le tube une fois, pour le laver avec de l’éthanol. Enfin, centrifugez à 20 000 x G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Retirez complètement le surnageant et faites sécher la pastille à l’air libre jusqu’à ce que l’éthanol soit complètement éliminé. À 20 microlitres d’acétate de sodium froid contenant 1 millimolaire d’EDTA, tourbillonnez vigoureusement pour remettre la pastille en suspension. Pour commencer l’électrophorèse, mélangez quatre microlitres de chaque échantillon avec six microlitres de tampon de chargement.Chargez les échantillons, y compris les témoins, sur un gel de polyacrylamide 6,5 millimètres d’épaisseur contenant huit molaires surfaciques et 0,1 molaire d’acétate de sodium. Ensuite, séparez l’ARN en faisant fonctionner l’électrophorèse à 10 volts par centimètre de gel à quatre degrés Celsius pendant environ 20 heures jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol atteigne le fond du gel. Séparez soigneusement les deux plaques de verre afin que le gel reste sur l’une d’elles.Utilisez la zone de gel du colorant xylène cyanol et 20 centimètres vers le bas vers le colorant bromophénol pour le tamponnage. Coupez un mince morceau de papier filtre à la taille de la zone de buvard souhaitée. Placez le papier filtre sur la partie du gel qui sera utilisée pour le tamponnage.Coupez et jetez les parties du gel non recouvertes de papier filtre. Ensuite, utilisez le papier filtre pour retirer délicatement le gel de la plaque de verre. Placez une membrane en nylon chargée positivement sur le gel et transflot dans un tampon de transfert à 20 volts pendant 90 minutes.Terminez en réticulant l’ARN à la membrane à l’aide de la lumière UV. Ensuite, placez la membrane réticulée dans un tube d’hybridation et ajoutez six millilitres de solution d’hybridation. Faites pivoter le tube à 42 degrés Celsius pendant une heure pour pré-hybrider la membrane.Ensuite, ajoutez une sonde d’ADN oligo-radioactif à 30 pics, cinq premiers et marqués avec P32. Tournez pour incuber la membrane avec la sonde à 42 degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation, utilisez une pipette jetable de 10 millilitres pour retirer la sonde.Ensuite, lavez rapidement la membrane deux fois dans le tube d’hybridation, dans 15 millilitres de solution de lavage à température ambiante. Déplacez la membrane dans un récipient plat en plastique, couvrez-la avec la solution de lavage et fermez le couvercle. Incuber la membrane sur un shaker à température ambiante pendant 30 minutes.Changez la solution et continuez à laver jusqu’à ce que vous obteniez un rapport signal/bruit satisfaisant. À l’aide d’un tube de Müller Geiger, on obtient le rapport signal/bruit, en comparant le rayonnement de la zone où la sonde s’est hybridée à l’ARNt, au rayonnement d’une zone vide. Après cela, enveloppez hermétiquement la membrane dans une pellicule plastique et scellez-la hermétiquement par soudage.Placez cette membrane sur un écran d’imagerie phosphorescente. Après un temps d’exposition adéquat, scannez l’écran à l’aide d’un scanner laser et enregistrez le fichier au format gel. Ensuite, chargez le fichier gel dans le logiciel d’imagerie.Tracez une ligne verticale le long de chacune des voies de l’échantillon de sorte qu’elle s’étende sur la majeure partie de la largeur de la voie tout en excluant les bords des bandes où le signal peut être inégal. Pour visualiser les décomptes de chaque voie, cliquez sur analyse, puis sur Créer un graphique. Définissez manuellement les deux pics qui représentent l’ARNt chargé et l’ARNt non chargé de chaque voie.Après cela, cliquez sur analyse, puis sur rapport de zone pour obtenir les comptages de chaque sommet. Enfin, enregistrez la zone sous chacun des deux sommets. Calculez les niveaux d’ARNt comme décrit dans le protocole texte.Cette méthode a été utilisée pour mesurer l’abondance de divers ARNt et E.Coli nf915 avant et pendant notre carence en arginine. Sur la parcelle nord hybridée avec différentes sondes d’ARNt, il y a une séparation claire entre les bandes qui représentent l’ARNt chargé des bandes qui représentent l’ARNt non chargé. Le profil de rayonnement le long de chaque voie a été obtenu à partir des transferts nord à l’aide d’un logiciel d’imagerie.Le signal de rayonnement de chaque voie a été quantifié en isolant chacune du blot. Un graphique qui représente la quantification du signal à partir d’une seule voie, montre deux pics. Le pic gauche provient de l’ARNt aminoacylé et le droit de l’ARNt désacylé.La zone sous chaque pic est exportée pour une analyse plus approfondie. La quantification des bandes du transfert nord montre que l’abondance relative de toutes les espèces d’ARNt testées a rapidement et significativement diminué pendant la privation d’acides aminés. D’autre part, les niveaux de charge de l’ARNt de l’arginine acceptant l’ARNt ont chuté rapidement lors de l’élimination de l’arginine, puis ont légèrement augmenté pendant la période de famine.Cependant, les niveaux de charge des autres ARNt ont légèrement augmenté au moment de la famine, puis ont diminué à des niveaux presque antérieurs à la famine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier l’ARN de manière à ce que la charge et l’abondance de l’ARNt puissent être quantifiées et comment utiliser les cellules de pointe pour la normalisation. Tout au long de cette procédure, il est important de se rappeler de garder l’ARN froid et acide pour éviter l’hydrolyse de l’ARN.

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