Name: Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Découvrez la microirradiation laser pour étudier les réponses cellulaires aux dommages d'ADN simples et complexes in vivo. Cette méthode permet l'analyse en temps réel du recrutement des facteurs de réparation dans les cellules.

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Nous remercions le Dr Akira Yasui à l’Université de Tohoku, Japon pour le plasmide d’expression de GFP-NTH1 et Dr. Eros Lazzerini Denchi au Scripps Research Institute, La Jolla, en Californie, pour la TRF2-YFP et EGFP-53BP11220-1711 plasmides d’expression. Ce travail a été soutenu par l’Air Force Office of Scientific Research (FA9550-04-1-0101) et la Fondation Beckman Laser Institut Inc. (pour M.W.B), la Ford Foundation Fellowship de la National Academy of Sciences (d’après) et NSF MCB-1615701 et CRCC CRR-17-426665 (de K. Y.).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les avantages de l’utilisation de laser microirradiation pour recherche DDR sont :
1. il est possible d’induire différents types et quantités d’ADN dommages causés par les cassures simple brin pour dommages à l’ADN complexes, et pour détecter les réparation différents facteurs à l’ADN endommagent sites en ajustant les paramètres de l’irradiation laser. Il est également possible d’infliger des dommages à plusieurs reprises dans un même noyau de cellule afin d’évaluer les effets de trans</em...

In Vivo Signalisation des dommages ADN, c’est pas bien comprise In vivo, l’ADN est complexé avec des histones et d’autres facteurs à fibres de chromatine forme. Règlement de la structure de la chromatine est d’une importance primordiale pour le métabolisme de l’ADN. Par exemple, la variante de l’histone H2AX est phosphorylée par l’ataxie-télangiectasie muté (ATM) et d’autres kinases bicaténaires suivant rompt l’induction (ORD) et est important pour l’amplification du signal ORD dommages ainsi que fourniture d’un site d’amarrage pour d’autres facteurs. Propagation de choix de voie de signalisation et de réparation des dommages semblent être gravement influencé par la structure de la chromatine local au dommage sites1. Un certain nombre de remodelage des facteurs, des chaperons d’histone et histone enzymes de modification de la chromatine sont en effet recrutés pour endommager les sites et sont important pour la réparation de l’ADN efficace, soulignant l’importance de la régulation de la chromatine dans le DDR et de réparation2 , 3 , 4. en outre, site de dommages de clustering ou de repositionnement a été observé dans la levure et les drosophiles5,6,7,8, réminiscence de relocalisation du locus du gène dans le compartiment subnucléaire associé à gène règlement9,10. Études récentes chez les souris et les cellules humaines a également révèlent la mobilisation des sites de l’ORD, quelles influences réparer fidélité et voie de choix11,12. Cela soulève la possibilité que DDR/réparation peut également être intimement liée à l’architecture nucléaire, organisation d’ordre supérieur la chromatine et chromosome dynamique dans le noyau de la cellule. Ainsi, il est essentiel d’élaborer des méthodes à haute résolution pour étudier les DDR et processus dans le contexte de l’environnement nucléaire endogène dans une cellule direct de réparation afin de comprendre les conséquences à court et à long terme des dommages à l’ADN.
Critical Role of PAR polymérase (PARP) dans jauger l’étendue et le Type de dommage et la régulation des protéines Assemblée sur le Site de dommages PARP1 est un capteur de nick ADN rapidement activé par des lésions de l’ADN qui joue un rôle essentiel dans la réparation de l’ADN13. PARP1 pensait à l’origine pour fonctionner avec rayons x réparer Cross complément 1 (XRCC1) pour faciliter la réparation d’excision de base (BER), mais des études récentes révèlent son rôle dans d’autres voies de réparation de l’ADN, y compris ORD réparation14. Activés PARP1 utilisations nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) comme substrat pour ADP-ribosylation des protéines cibles multiples, y compris lui-même. Cette enzyme et autres membres de la famille ont attiré beaucoup d’attention ces dernières années comme inhibiteurs de PARP ont émergé des médicaments thérapeutiques aussi prometteurs pour les cancers. Bien que les inhibiteurs de PARP trouvées au départ pour être efficace dans le gène du cancer du sein (BRCA)-mutation des cellules cancéreuses du sein, il y a maintenant une pléthore de preuves de leurs effets dans les thérapies de mono - et combinaison avec ADN, endommageant des agents/irradiation contre un large spectre de cancers présentant des mutations, sans s’y limitées BRCA15,16,17,18,19,20.
Au niveau moléculaire, activation de PARP s’est avérée un rôle essentiel dans l’organisation de la structure de la chromatine locaux sur les sites de dommages. Recrutement PAR dépendant des enzymes de modification de la chromatine facilite la réparation de l’ORD et préceptes réparer choix de voie, ce qui suggère le rôle important d’échafaudages de modification nominale sur les sites de dommages. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 , nous avons récemment démontré que l’exclusion de la protéine p53-1 (53BP1) contre les dommages des sites par 32, fournissant une autre explication pour l’hyperactivation de 53BP1 dépendant d’endjoining non homologue ( NHEJ) de PARP inhibiteur et soulignant l’importance de PARP en ORD réparation voie choix33,34. PARP1 également directement PARylates et affecte l’activité de plusieurs ADN réparation facteurs14.
À l’aide de Laser Microirradiation comme un outil pour étudier la DDR/réparation In Vivo Microirradiation laser pour produire des altérations de la sub-micronique sur chromosomes individuels a été d’abord décrite en 1969,35 et a examiné en détail en 1981,36. Plusieurs décennies plus tard, microirradiation laser a été montrée pour induire des lésions de l’ADN dans une région définie SUBMICROMETRIQUES dans le noyau de la cellule et il a été prouvée comme une technique précieuse pour l’étude de recrutement ou modifications des différents facteurs de lésions de l’ADN in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. cette méthode permet de détecter les facteurs qui ne font pas les foyers distincts d’induite par l’irradiation (IRIF) dommages sites39,,42. Il est également possible d’examiner la dynamique spatio-temporelle des changements structuraux de la chromatine au sites de dégâts et dans le reste du noyau. Nous avons comparé soigneusement la DDR induite par les systèmes laser différentes et pouvoirs pour évaluer la relation entre le type de dommages à l’ADN et le microirradiation des conditions32,43,44, l’entrée 45. Les patrons de recrutement aberrant de 53BP1 et télomériques répéter facteur obligatoire 2 (TRF2) ont été observés dans les études précédentes de dommages laser, qui constituait la base de la préoccupation récurrente du caractère « non physiologique » de dommages causés par le laser46 ,47,48,49. Nous avons constaté que ces divergences apparentes maintenant s’expliquerait par différentiel PARP signalisation qui évalue la quantité et la complexité des dommages induits32. Nous avons confirmé que : 1) cellules laser-microirradiated (même après l’irradiation haute-puissance d’entrée) sont arrêtés en interphase en dommages checkpoint-fonction de contrôle et demeurer viables (au moins jusqu'à 48 h)32,50; et 2) réparation facteur recrutement/modification récapituler fidèlement ceux observés avec le traitement par des agents nocifs ADN conventionnels et l’induction de l’ORD par endonucléases32,39,,42, 44,50,51,52. Ces résultats appuient fortement la pertinence physiologique d’étudier les réponses cellulaires induites par des dommages de laser.

<table><tbody><tr><td>Ti :Sapphire NIR laser femtoseconde pulsé Mira-900</td><td>Coherent Inc.</td>Microscope inversé <td>Mira 900</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>63X/1.4 Objectif NA</td><td>Zeiss</td><td>APOCHROMAT Ph3&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Platine de rotation compacte</td><td>Newport Corp</td><td>PR50PP</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de température</td><td>Warner</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Système de chauffage</td><td>Ibidi&nbsp ;</td><td>10918</td><td></td></tr><tr><td>Système d’incubation de gaz</td><td>Ibidi&nbsp ;</td><td>11920</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de puissance et d’énergie laser (RoHS)</td><td>Champ</td><td>cohérentMaxII-TOP&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-R2 Caméra CCD numérique</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META Microscopes à balayage laser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X/1.3 NA Zeiss Plan APO</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm Quadrillé Plats&nbsp ;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD-D</td><td></td></tr><tr><td>PtK2 cellules épithéliales rénales</td><td>ATCC</td><td>CCL 56&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Milieu indépendant du CO2&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>MEM avancé&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>complété par de la L-Glutamine, 4 % FBS</td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine&nbsp ;</td><td>&nbsp ; SIGMA</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>sérum sans media&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (Milieu sérique réduit Opti-MEM I)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Dimère de pyrimidine anti-cycolbutance (CPD) (souris)</td><td>Kamiya Biomedical Company</td><td>MC-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-XRCC1 (souris)</td><td>Gene Tex Inc</td><td>GTX72311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-53BP1 (lapin)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-22760</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CtIP (lapin)</td><td>Abcam</td><td>ab70163</td><td></td></tr><tr><td>Polymères anti-PAR (souris)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-SA216-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR (lapin)</td><td>Trevigen</td><td>4336-BPC-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRF2 (souris)</td><td>Novus Biological&nbsp ;</td><td>NB100-56506</td><td></td></tr><tr><td>Anti 6-4PP (souris)</td><td>Kamiya Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad21 (Lapin)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (pour la détection de la cohésine)</td><td>généré dans le laboratoire</td><td></td><td></td>de Yokomori (KY)</tr><tr><td>Anti-Rad51 (Lapin)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8349</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ku70 (souris)</td><td>&nbsp ; Novus Biologicals</td><td>NB100-102</td><td></td></tr><tr><td>8-oxiguanine&nbsp ;</td><td>Trévigen, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-PARP1&nbsp ; (Lapin)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>généré dans le laboratoire</td><td></td> KY <td>ref 43</td></tr><tr><td>&nbsp ; Anti-hCAPG (Lapin)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (pour la détection de condensine)</td><td>généré en laboratoire</td><td></td> KY <td>ref 42</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>&nbsp ; Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Âne Anti-Souris Alexa Fluor 488 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect siRNA Réactif de transfection</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>GFP-SMC1 lignée cellulaire stable &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>généré dans le laboratoire</td><td></td> KY <td>ref 49&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lignée cellulaire stable GFP-NEIL2</td><td>générée dans le laboratoire</td><td></td> KY <td>ref 54</td></tr><tr><td>Lignée cellulaire stable GFP-NTH1</td><td>générée dans le laboratoire</td><td></td> KY <td>ref 32</td></tr><tr><td>Plasmide GFP-SMC1</td><td>généré dans le laboratoire</td><td></td><td></td>KY</tr><tr><td>Plasmide GFP-Ku</td><td>généré dans le laboratoire</td><td></td><td></td>KY</tr><tr><td>Anti-MDC1 (lapin)</td><td>&nbsp ; Novus Biologicals</td><td>NB100&ndash ; 395</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gH2AX (lapin)</td><td>&nbsp ; Millipore</td><td>07&ndash ; 164</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-53BP1(1220-1711) Lignée cellulaire stable PtK2</td><td>générée dans le laboratoire</td><td></td> de Berns <td>ref 32</td></tr><tr><td>TRF2-YFP Lignée cellulaire stable PtK2</td><td>générée dans le laboratoire</td><td></td> de Berns <td>ref 32</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de PARG</td><td>Trevigen</td><td>4680-096-03</td><td></td></tr><tr><td>ADN&ndash ; Inhibiteur de PKcs&nbsp ; NU7026&nbsp ;</td><td>Inhibiteur de l’ATM Sigma</td><td>N1537</td><td></td></tr><tr><td>KU55933</td><td>&nbsp ; Calbiochem</td><td>118500</td><td></td></tr><tr><td>Olaparib&nbsp ;</td><td>Apexbio Technology</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde&nbsp ;</td><td>MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE SCIENC MS</td><td>100503-916 (EA)</td><td></td></tr><tr><td>Quantité Un Logiciel d’analyse 1-D Version 4.6.9</td><td>Bio-Rad</td><td>SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC&nbsp ;</td><td>Programme d’analyse d’images</td></tr><tr><td>Tableur Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>détergent</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco 10X sans calcium ni magnésium</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200166</td><td>diluer à 1X&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

laser microirradiation à l’étude in vivo des réponses cellulaires aux dommages d’adn simples et complexes

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Dommages à l’ADN induit des réponses spécifiques de réparation et de signalisation dans la cellule, ce qui est essentiel pour la protection de l’intégrité du génome. Laser microirradiation est devenu un outil expérimental pour étudier la réponse (DDR) d’endommager ADN d' in vivo. Il permet en temps réel à haute résolution unicellulaire analyse dynamique macromoléculaires en réponse aux dommages causés par le laser limité à une région de SUBMICROMETRIQUES dans le noyau de la cellule. Cependant, diverses conditions de laser ont été utilisées sans appréciation des différences dans les types de lésions induites. En conséquence, la nature du dommage n’est souvent pas bien caractérisé ou contrôlés, causant des incohérences apparentes dans les profils de recrutement ou de la modification. Nous avons démontré que les conditions d’irradiation différentes (c'est-à-dire, différentes longueurs d’onde ainsi que différentes puissances d’entrée (irradiations) d’un laser femtoseconde (fs) (NIR) à proche infrarouge) induisaient assemblées distinctes de protéines DDR et de la réparation. Cela reflète le type de dommages à l’ADN produites. Ce protocole décrit comment titrage de puissance d’entrée du laser permet d’induction de différentes quantités et de la complexité des lésions de l’ADN, qui peut être facilement contrôlée par détection des dommages de base et réticulation, différentiel poly (ADP-ribose) (PAR) de signalisation, et réparation de voie spécifique les assemblys de facteur sur les sites de dommages. Une fois que les conditions de dommages sont déterminées, il est possible d’étudier les effets de la complexité des différents dommages et dégâts différentielle de signalisation ainsi que l’appauvrissement des facteurs en amont sur n’importe quel facteur d’intérêt.

À l’aide de PtK2 cellules exprimant de manière stable EGFP-53BP11220-1711 ou TRF2-YFP, titrage de puissance d’entrée de laser a été réalisée afin de déterminer les conditions optimales pour leur recrutement (Figure 1)32.
Sites de laser de haute puissance d’entrée de dommages, le regroupement significatif des CPD (réticulation dommages typiquement généré par des dommages ultraviolet (UV)) ainsi que de la GFP-NTH1 DNA glycosylase q...

Ce protocole vise à décrire l’utilisation de laser microirradiation d’induire différents types de lésions de l’ADN, y compris relativement simples brins et lésions complexes, afin d’étudier l’ADN des dommages de signalisation et de réparation facteur Assemblée à sites de dommages in vivo .

Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

L'objectif général de ce protocole est de décrire comment utiliser la microirradiation au laser pour induire différents types de dommages de l'ADN, notamment des cassures simples du brin, ainsi que des lésions complexes, afin d'étudier in vivo la signalisation des dommages à l'ADN et l'assemblage des facteurs de réparation. Dans les années 1960 et 1970, nous avons focalisé un faisceau laser à travers un microscope, que vous pouvez voir derrière moi, et avons pu endommager une petite région d'un chromosome. La cellule s'est divisée, a survécu, et nous n'avons pas compris pourquoi.Eh bien, 40 ans plus tard, nous utilisons désormais cette méthode pour étudier de façon sélective la réparation de l'ADN, et c'est ce que vous allez découvrir aujourd'hui. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la réparation de l'ADN, telles que la manière dont les lésions de l'ADN sont reconnues et traitées, et comment le signal de dommage se propage dans la cellule. La microirradiation par laser permet une analyse en temps réel, à haute résolution et au niveau de la cellule unique, de la dynamique des macromolécules en réponse à un dommage de l'ADN localisé dans u

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