Création d’un Dense Transposon Insertion bibliothèque à l’aide de la conjugaison bactérienne dans les entérobactéries souches telles que Escherichia Coli et Shigella flexneri

L’objectif global de cette procédure expérimentale est de créer une banque d’insertion de transposons à haute densité chez Escherichia coli ou Shigella flexneri en utilisant la conjugaison bactérienne. Cette technique permet la création de centaines de milliers de mutants bactériens uniques par l’insertion génomique aléatoire d’un transposon Tn10. Le principal avantage de cette technique est que le transfert du plasma à l’hébergement du transposon se fait par conjugaison bactérienne au lieu d’autres méthodes moins efficaces, comme l’électroporation.

De plus, le transposon Tn10 lui-même s’insère dans le génome avec moins de biais que les autres transposons. En utilisant une technique stérile, ajoutez un millilitre de culture nocturne de la souche donneuse dans un tube eppendorf stérile. Le tube doit être étiqueté par exemple avec un D, pour donneur.

Faites de même pour la souche receveuse en prélevant un millilitre de culture nocturne de la souche receveuse dans un tube Eppendorf stérile. Encore une fois, par exemple, étiqueté avec R, pour le destinataire. Centrifugez les deux tubes pendant une minute à 14 000 fois G à température ambiante.

Cela peut être fait à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse. Pendant que la centrifugeuse est en marche, préparez les filtres pour la conjugaison. À l’aide d’une pince stérile, placez un filtre en nitrocellulose sur une plaque de gélose LB étiquetée ne contenant pas d’antibiotiques.

Alternativement, à la place du filtre nitrocellulosique, du papier buvard stérile peut être utilisé. Placez chaque filtre sur une plaque de gélose LB séparée afin de minimiser la contamination. Assurez-vous que chaque filtre est placé sur une plaque de gélose LB correctement étiquetée.

Fabriquez trois assiettes contenant chacune un filtre. Un pour la souche donneur, un pour la souche receveuse et un pour la bibliothèque. Une fois la centrifugeuse terminée, retirez les cultures de nuit.

Retirez tous les milieux de croissance contenant des antibiotiques du tube d’Eppendorf et jetez-les. Veillez à ne pas perturber ou déranger la palette de cellules bactériennes, mais essayez d’éliminer tous les milieux de croissance. Assurez-vous de travailler de manière aseptique et de changer les pointes entre chaque échantillon.

Dans chaque tube eppendorf, ajoutez 110 microlitres de milieu LB frais sans antibiotiques et pipetez de haut en bas pour remettre la culture en suspension. Assurez-vous de travailler de manière aseptique. En pipetant de haut en bas plusieurs fois pour s’assurer qu’il ne reste pas d’amas de cellules.

Cette étape est effectuée pour concentrer la culture bactérienne et éliminer tous les antibiotiques restants de la culture de nuit. À l’aide d’une pipette, placez 50 microlitres de la culture donneuse concentrée sur le filtre étiqueté Donneur. Ajoutez lentement les 50 microlitres au filtre par gouttes.

Faites de même pour la souche réceptrice en ajoutant 50 microlitres de la culture remise en suspension, la culture réactivée concentrée sur le filtre récepteur de manière goutte à goutte. Pour que la conjugaison se produise, la souche réceptrice et la souche donneuse sont ajoutées au même papier filtre afin qu’elles soient en contact physique étroit. Pour ce faire, ajoutez 50 microlitres de la souche donneuse et de la souche réceptrice dans le même filtre sur la bibliothèque étiquetée de la plaque.

Placez ces plaques de gélose contenant les filtres à 37 degrés pendant six heures. Le processus de conjugaison se déroule sur six heures à 37 degrés Celsius. Au cours de la conjugaison, la plasmine pJA1 se déplace dans la souche réceptrice.

Après conjugaison, les bactéries sont dissociées du filtre par vortex et induites avec un IPTG millimolaire. L’IPTG induit la transposase et le transposon contenant le gène de résistance à la kanamycine est inséré au hasard dans le génome de la souche réceptrice. Les bactéries sont placées sur des plaques de gélose LB contenant de la kanamycine et un autre antibiotique pour sélectionner la souche réceptrice contenant le transposon.

La souche réceptrice est Lambda pir négatif, de sorte que la plasmine pJA1 est perdue. Après six heures de croissance à 37 degrés Celsius, la conjugaison est complète. Retirez les plaques contenant les filtres de l’incubateur.

À l’aide d’une pince stérile, retirez le filtre contenant le témoin négatif du donneur de la plaque de gélose LB. Tapotez le tube pour placer le papier filtre au fond du flacon conique et assurez-vous que le filtre est complètement immergé dans le média LB. Ce tube contient deux millilitres de média LB avec IPTG et une concentration finale d’un millimolaire.

Faites tourbillonner le tube pendant une minute pour dissocier les bactéries du filtre à nitrocellulose. Le milieu LB doit devenir trouble avec des cellules bactériennes. Répétez cette opération pour le contrôle de destinataire et la bibliothèque.

Une fois que les filtres contenant les cellules bactériennes ont été complètement vortex pour dissocier les bactéries du filtre, les cellules bactériennes sont plaquées sur des supports sélectionnés. À cette étape, les bactéries sont placées dans des plaques de gélose LB contenant de la kanamycine et un autre antibiotique tel que l’acide nalidixique. La kanamycine est utilisée pour sélectionner les cellules réceptrices dont le transposon contenant le marqueur de résistance à la kanamycine est intégré avec succès dans le génome.

Les cellules réceptrices dont le marqueur n’a pas été intégré dans le génome sont sélectionnées. Un autre antibiotique tel que l’acide nalidixique est utilisé pour sélectionner contre la souche donneuse. La souche donneuse utilisée ici est sensible à l’acide nalidixique, tandis que la souche réceptrice est résistante à l’acide nalidixique.

En utilisant ce deuxième antibiotique, il est possible d’éliminer la souche donneuse. À cette étape, plusieurs dilutions doivent être plaquées pour déterminer une dilution de la bibliothèque qui donne de nombreuses colonies suffisamment espacées. Après avoir compté et enregistré le nombre de colonies sur toutes les plaques contenant la bibliothèque de transposons, certains utilisateurs peuvent vouloir regrouper ou combiner la bibliothèque en un seul tube.

Cela peut être fait à l’aide d’un épandeur stérile. Ajoutez un millilitre de milieu LB dans la plaque de gélose LB contenant la banque de transposons. Une fois que le milieu a été ajouté à la plaque, utilisez l’épandeur stérile pour gratter et dissocier les bactéries de la plaque.

Il n’est souvent pas possible d’éliminer toutes les bactéries de l’assiette. Retirez la suspension bactérienne et placez-la dans une vile conique de 50 mil ou 15 mil. Répétez cette opération pour toutes les assiettes.

Une fois que toutes les plaques ont été grattées, vortex la suspension bactérienne accumulée pendant une minute entière pour briser les amas de cellules. Celle-ci constitue désormais la bibliothèque regroupée. Après une croissance à 37 degrés pendant 18 heures, il ne devrait pas y avoir de croissance sur les plaques de contrôle du donneur ou du receveur.

Les plaques contenant la bibliothèque de mutants contiennent idéalement de nombreuses colonies de tailles variées. Différentes tailles de colonies indiquaient des clones de fitness variable et sont un bon signe que le protocole a fonctionné. La création d’une banque dense de mutagénèse par transposons chez les bactéries est potentiellement avantageuse pour de nombreuses applications en aval, allant de la découverte de gènes de virulence et de pathogènes bactériens à l’étude de gènes essentiels à l’identification de réseaux d’interaction génétique.

Toutes ces applications en aval reposent sur la construction d’une bibliothèque dense d’insertion de transposons. La méthode présentée ici fournit une procédure simple, rapide et peu coûteuse pour fabriquer une banque de transposons très dense dans des souches entérobactériennes telles que E coli ou Shigella flexneri.