Name: Quantifier la chimiotaxie Monocyte humain In Vitro et lymphocytes murins traite In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Découvrez comment quantifier la chimiotaxie des monocytes humains in vitro et suivre la migration des lymphocytes murins in vivo. Ces protocoles permettent des mesures multiplex en temps réel pour la recherche en immunologie.

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Ce travail a été soutenu par Bernard L. Schwartz programme pour médecins chercheurs à l’Université Rockefeller, le Fonds de développement thérapeutique Robertson à la Rockefeller University et le centre de Sackler de biomédecine et de la recherche sur la Nutrition à la Université Rockefeller.

toutes les procédures ont été approuvées par la Rockefeller University &#39; s Institutional Animal Care et Comité d’urbanisme. Tous les animaux étaient logés dans des conditions spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes.
 1. In Vitro chimiotactisme <ol><li>Culture THP-1 cellules 6 dans Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 4-(2-hydroxyéthyl) -1- acide piperazineethanesulfonic (HEPES ; 25 mM) (toutes les médias), maintenir la densité entre 0,5 à 1,0 x 10 6 cellules/mL.</li>
	<li>La culture de cellules dans un 35 mm plat, étiquette de 3.5 x 10 5 THP-1 de cellules par État calcéine acétoxyméthyl (calcéine-AM ; 2,5 µM) ou autre colorant fluorescent dans des médias complets à 37 ° C pendant 30 min. 
	Remarque : Les colorants doivent être perméable à la membrane cellulaire et compatible avec les cellules vivantes étiquetage.</li>
	<li>Chaude avant un lecteur de plaque à 37 ° C. 
	Remarque : En plus du contrôle de la température, la fonctionnalité de lecture de fond est également nécessaire. Voir l’étape 1.10.2 pour une alternative à l’aide d’un lecteur pour la quantification de la migration des cellules.</li>
	<li>Tandis que les cellules sont étiquetage, préparer la plaque de test et de la chambre basse.
	<ol><li>Utiliser une culture de tissu de 24 puits plaque, avec une condition / puits. Effectuer chaque condition en trois exemplaires.</li>
		<li>Ajouter 750 µL de Hank &#39; s Solution saline tamponnée (HBSS) tamponnée avec 25 mM HEPES et 0,1 % sérum albumine bovine (BSA) à la plaque 24 puits. Cela sert comme la condition de contrôle basal.
		<ol><li>Utilisation autre puits pour des conditions de comparateur, gardant toujours le volume total dans la chambre inférieure à 750 µL. 
			NOTE : Dans cet exemple, humaine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) sert de témoin positif pour la chimiotaxie 7.
			<ol><li>Assemble le mélange réactif en combinant HBSS avec 25 mM HEPES, BSA (0,1 %) et le MCP-1 (75 ng/mL). Utiliser du sérum bovin adult (2,7 % v / v) avec un contrôle positif supplémentaire MCP-1. 
				NOTE : Concentration de chimiokines et chimiokines dépendra de l’axe chimiotactique sous étude. Lyophilisé MCP-1 est remis en suspension dans l’eau distillée avec BSA (0,1 %) pour faire une solution avec une concentration finale de 50 μg/mL. Cela peut être dilué dans l’eau pour une solution de travail de 10 μg/mL. Ajouter 5,6 μl de cette solution à la chambre basse.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Après la composition des chambres bas est terminée, placer un insert poreux dans chaque puits, en veillant à ce que les onglets de l’insert s’alignent avec les encoches de la plaque. 
		Remarque : Choisir la taille des pores approprié pour les inserts. Pour les monocytes et les lymphocytes, une taille de pore de 3 μm fonctionne bien. Certains types de cellules et de chemokine peuvent nécessiter une surface enduite matrice de migration optimale. Par exemple, pour la mesure de la chimiotaxie monocyte THP-1 vers MCP-1, la fibronectine ou insertions enduit de collagène sont recommandées. Pour lecteur de plaque pour le dosage, l’insert doit avoir un revêtement lumineux-imperméants, comme le polyéthylène téréphtalate, afin d’éviter la détection de non migratrice cellules dans la haute chambre 8.</li>
	</ol></li> <li>Après incubation des cellules pendant 30 min avec calcéine-AM, transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15mL. Cellules de centrifugation à 1 000 x g pendant 2 min. inspectent visuellement les cellules afin de confirmer l’absorption de calcéine-AM ( Figure 1).</li>
	<li>Retirer délicatement le surnageant à l’aide d’un aspirateur sous vide. Laver les cellules marquées en milieu sans sérum RPMI 1640 additionné de HEPES 25 mM. Centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 2 min et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Remettre les cellules en milieu sans sérum RPMI 1640 additionné de HEPES 25 mM. Compter les cellules et ajuster le volume pour que les cellules soient à une concentration finale de 1,0 à 1,5 x 10 6 cellules/mL.</li>
	<li>Distribuer 250 μL de la suspension cellulaire dans l’insert (chambre haute).</li>
	<li>Après que toutes les cavités supérieures ont été pourvues, soulever délicatement la plaque et inspectent le dessous de la présence de bulles d’air qui peuvent interférer avec la migration et la détection. Pour supprimer une bulle, tout d’abord essayez de supprimer puis repositionner l’insert. En cas d’échec, utiliser une aiguille de 27 G pour percer la bulle et puis re-positionner l’insert.</li>
	<li>Placer la plaque dans le lecteur de plaque préchauffée 37 ° C.
	<ol><li>Acquire lectures de fluorescence du fond à intervalles de 1-3 min. Lorsque vous utilisez calcéine-AM, fixé la fluorescence des longueurs d’onde d’excitation et d’émission à 485 nm et 520 nm, respectivement. Selon le système cellulaire de type et des chimiokines, chimiotactisme produit généralement sur une période de 1 à 4 h ( Figure 2 a).</li>
		<li>Comme une alternative aux mesures en continu à l’aide d’un lecteur de plaque, image des puits à l’aide d’un microscope fluorescent inversé ( Figure 2 b), capable d’excitation et de détection de la lumière à 485 nm et 520 nm, respectivement. Utiliser un grossissement faible pour capturer la majorité du dessous de l’insert. Quantifier les cellules en traitant les images avec ImageJ ou similaire du logiciel 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. Transfert adoptif de Lymphocytes murins <ol><li>préparation de cellules du donneur <ol><li>anesthésier 8-12 semaines-vieux souris mâles donneurs de C57BL/6J avec anesthésie isoflurane (1-3 %) à l’aide d’un vaporisateur. Confirmer la profondeur appropriée de l’anesthésie par orteil-pinch.</li>
		<li>Placer la souris dans la position en décubitus dorsal. Faire une incision médiane avec un scalpel et localisez la rate dans l’espace péritonéal gauche supérieur. Excise la rate toute et placez dans médias complet (RPMI additionné de 10 % FBS et 25 mM HEPES ; 1 mL/rate) sur la glace. Euthanasier les animaux donneurs anesthésiés par décapitation.</li>
		<li>Moudre tissu rate doucement à travers la maille en nylon de 40 µm dans les médias complets (1 mL /spleen) à l’aide de l’extrémité d’un piston de la seringue pour faire une suspension monocellulaire et le transfert d’un tube conique de 15 mL.</li>
		<li>Ajouter 4 volumes de la lyse de potassium (ACK) de chlorure d’ammonium de la mémoire tampon et incuber pendant 5 min à température ambiante pour la lyse des érythrocytes.</li>
		<li>Centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant. Si les érythrocytes restent dans le culot, remettre en suspension dans le tampon de lyse ACK, incuber pendant 5 min à température ambiante, centrifuger des cellules à 1 000 x g pendant 2 min et jeter le surnageant.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules dans les médias à une concentration de 2-5 x 10 7 cellules/mL, puis la suspension de cellules de la souche à travers une maille en nylon de 40 µm pour éliminer les débris cellulaires.</li>
		<li>Label 1 x 10 7 souris de cellules/destinataire avec un colorant fluorescent compatible avec vivre les cellules et qui sera retenu lors de la fixation ultérieure, par exemple 5-chloromethylfluorescein diacétate (concentration finale 2 μM) 10 . Incuber à 37 ° C pendant 30 min. 
		Remarque : Pour suivre plus d’une population de cellules, utilisez autres colorants fluorescents avec des populations de cellules supplémentaires. Par exemple, une partie des cellules du donneur peut être marquée avec benzoyle 5-(and-6)-(((4-chloromethyl)) amino) tétraméthylrhodamine (concentration finale 2 μM) 11.</li>
		<li>Ajouter 4 volumes HBSS additionné 25 mM HEPES, puis centrifuger à 1 000 x g pendant 2 min, puis jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans HBSS additionné de HEPES 25 mM à une concentration finale de 1 x 10 8 cellules/mL.
		<ol><li>Si vous utilisez plus d’un colorant fluorescent, maintenir les populations de cellules séparées jusqu'à ce qu’immédiatement avant l’injection.</li>
			<li>Transférer une petite portion (10 μL) de cellules de chaque couleur à une solution de fixation (1 mL) d’indemnisation de cytométrie en flux ultérieurs.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Transfert des lymphocytes <ol><li>anesthésier les 8-12 semaines-vieilles souris bénéficiaires mâles C57BL/6J à l’isoflurane (1-3 %) à l’aide d’un vaporisateur ; confirmer la profondeur de l’anesthésie par orteil-pinch. Pommade vétérinaire à l’animal &#39; s yeux pour éviter le dessèchement.</li>
		<li>Brièvement les cellules de donneur vortex (1 s) et le transfert à la seringue d’injection de 1 mL avec 27 G, 0,5 à aiguille, combinant des populations de cellules marquées différemment, le cas échéant.
		<ol><li>Une petite portion (10 μL) de transfert de cellules mixtes pour une solution de fixation (1 mL) pour les analyses de cytométrie en flux ultérieurs.</li>
		</ol></li> <li>Placer les animaux donneurs en position couchée. Appliquez une pression caudale douce sur la peau dorsale à le œil, causant le globe oculaire pour dépassent légèrement.</li>
		<li>Directe de l’aiguille médialement et injecter 100 µL de la suspension de cellules de donneur rétro-orbitalement dans chaque souris destinataire. Les cellules peuvent également être injectés via la veine caudale.</li>
		<li>Progressivement retirer l’aiguille d’injection et placez la souris seule dans une cage de récupération. Surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il a repris connaissance ; retour une fois pleinement récupéré l’animal à un logement social.</li>
	</ol></li> <li>Collecte et l’analyse <ol><li>après 1 h, anesthésier destinataires souris avec anesthésie isoflurane (1-3 %) à l’aide d’un vaporisateur, confirmer la profondeur de l’anesthésie par orteil-pinch. Récolter de la rate (ou autres tissus d’intérêt) (étape 2.1.2.) de chaque destinataire souris et le déposer dans les médias complets (1 mL/destinataire). Euthanasier les animaux anesthésiés par décapitation. 
		Remarque : Des intervalles plus longs avant la récolte de tissus vont augmenter l’accumulation dans les tissus grâce au moins 24 h.</li>
		<li>Moudre tissu rate doucement à travers la maille en nylon de 40 µm dans les médias complètes à l’aide de l’extrémité d’un piston de la seringue pour faire une suspension monocellulaire et transfert à tube conique de 15 mL.</li>
		<li>Ajouter 4 volumes de lyse ACK tampon et incuber 5 min à température ambiante. Centrifuger la suspension de cellules à 1 000 x g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant.</li>
		<li>Remettre les cellules en coloration buffer (tampon phosphate salin additionné de 1 % FBS). Compter les cellules et s’adapter à une concentration finale de 3 x 10 7 cellules/mL. Transférer 100 µL de suspension cellulaire dans un 96 puits autour de la plaque inférieure.</li>
		<li>Cellules de tache pour marqueurs souhaités (voir la Table des matières) pour l’analyse par cytométrie en flux. Ajouter les anticorps conjugués fluorophore (voir la Table des matières) contre marqueurs souhaités et incuber à 4 ° C pendant 20 min dans le noir. Ajouter 100 µL tampon de coloration, centrifuger des cellules à 1 000 x g pendant 3 min et éliminer le surnageant.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans 200 µL tampon de coloration, centrifuger des cellules à 1 000 x g pendant 3 min et éliminer le surnageant.</li>
		<li>Remettre le culot en coloration de 125 µL tampon et acquérir des échantillons à l’aide d’un cytomètre en flux à l’aide de procédures standards. 
		Remarque : Le colorant vert est excité par un laser à 488 nm et l’émission est détectée avec 505 et 530/30 filtres dichroïques. Le colorant orange est excité par un 561 nm et l’émission est détectée par un filtre dichroïque 582/15.
		<ol><li>Utilisation sauvé cellules 2.1.8.2 pour compenser chaque colorant fluorescent. 
			Remarque : À l’aide de rémunération à base de perle avec des fluorophores correspondant à l’excitation et les spectres d’émission des colorants étiquetage se traduira par compensation sous-optimaux.</li>
			<li>Utiliser les cellules d’entrée enregistrées depuis l’étape 2.2.2.1 pour déterminer avec précision le rapport entre marqués différemment des cellules d’entrée si vous utilisez plus d’une population marquée ( Figure 3). Calculer la migration spécifique de tissu selon le ratio d’étiquetés aux cellules sans étiquette ( Figure 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li>
<li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li>
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<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
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<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li>
<li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li>
<li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking%3A+chemokines+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Quantification de la migration des cellules immunitaires peut être accomplie à l’aide de simple et rapide des analyses in vitro et in vivo. Nous démontrons le chimiotactisme in vitro des monocytes humains en réponse à un gradient de MCP-1 et l’augmentation mammaire par le sérum. In vivo, donneur splenocytes murins ont été étiquetés de façon différente et après transfert adoptif, parasitent les animaux receveurs.
En utilisant un lecteur de plaque a l’avantage...

Immunité solide nécessite la coordination temporelle et spatiale complexe d’une multitude de types de cellules afin de répondre de manière appropriée à l’injure, infection et générer autotolérance. Plusieurs dizaines récepteurs de chimiokines et de leurs ligands correspondantes ont été découverts et caractérisé des mécanismes moléculaires par lesquels les cellules spécifiques peuvent être arrangés en un tissu spécifique à un moment précis. Ainsi, étudier le chimiotactisme et la migration est un élément indispensable de la recherche de l’immunologie. En effet, le test décrit dans vitro a récemment été utilisé comme un outil de dépistage pour identifier un cofacteur chimiotactique qui accélère le chimiotactisme des cellules T vers le C-C chimiokines 19 et 213. Le but des méthodes décrites ici sont de permettre une évaluation quantitative du chimiotactisme des cellules immunitaires in vitro et in vivo.
L’essai de chambre de Boyden (migration cellulaire et l’invasion) est une méthode rapide, reproductible et peu coûteuse pour évaluer la migration de cellules4,5. Dans l’essai standard, la chambre supérieure est ensemencée avec des cellules et est séparée par un insert poreux d’une chambre basse, dans laquelle les cellules migrent. Au moment voulu, les cellules qui ont migré vers le dessous de l’insert peuvent être fixe et colorées pour le dosage au microscope photonique. Toutefois, ces mesures restreignent la collecte de données à un seul point de fin, qui s’oppose à une collecte de données dynamique et peuvent exiger optimisation approfondie pour déterminer le point de temps optimal pour l’analyse. Ici, plusieurs adaptations sont décrits qui permettent des mesures en temps réel, quantitatives et multiplexés de chimiotactisme in vitro.
Pour des études in vivo , un point de terminaison fonctionnel est utilisé, à savoir l’accumulation spécifique des cellules dans un compartiment de tissu donné. Cellules donneuses préalablement étiquetées sont introduits dans les animaux receveurs par transfert adoptif. Ces cellules du donneur soient reconnaissables par la suite par cytométrie en flux après la récolte de tissus destinataire. Également présenté est une stratégie co étiquetage qui permet la détermination de la traite des différents types de cellules au sein d’un seul animal receveur. Cette méthode élimine la variation inter animale de l’injection de cellules et représente la variabilité physiologique des animale.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Excitation : 485nm, Émission : 520nm</td></tr><tr><td>Cellule Plat de culture</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 24 puits</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tube conique</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Bovin Serum Albumin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin adulte</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS avec calcium et magnésium ; sans rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2e lecteur de plaques</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 microscope à fluorescence inversée Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein santé animale</td><td>11695-6776-2</td><td>Anesthésie à l’isofluorane</td></tr><tr><td>Filtre cellulaire 40um nylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse ACK</td><td>Qualité Biologique</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMTMR Colorant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Excitation : 541nm, Émission : 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Vert CMFDA Colorant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Excitation : 485nm, Émission : 520nm</td></tr><tr><td>Seringue de 5ml</td><td>Seringue BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Seringue TB 1ml</td><td>Seringue BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>lignée cellulaire THP-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-souris CD3 Anticorps</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>Excitation : 405nm, Émission : 421nm</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-souris CD19</td><td>Anticorps Biolegend</td><td>115540</td><td>Excitation : 405nm, Émission : 603nm</td></tr><tr><td>Plaque inférieure ronde à 96 puits</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Cytomètre en flux</td></tr></tbody></table>

quantifier la chimiotaxie monocyte humain in vitro et lymphocytes murins traite in vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

La chimiotaxie est migration le long du gradient chimique spécifique1. Chimiokines sont chimiotactiques cytokines qui favorisent le trafic cellulaire avec spécificité anatomique et temporelle2. La chimiotaxie est une fonction critique des lymphocytes et autres cellules immunitaires pouvant être quantitativement évalués in vitro. Ce manuscrit décrit des méthodes qui permettent l’évaluation de la chimiotaxie, in vitro et in vivo, pour les types de cellules différents y compris les lignées cellulaires et les cellules natives. L' in vitro, budgétisation axée sur les plaques permet la comparaison de plusieurs conditions simultanément en temps réel et peut être complétée en 1-4 h. essai In vitro avec des conditions peuvent être manipulées pour introduire des agonistes et des antagonistes, comme ainsi que différencier la chimiotaxie des chemokinesis, qui est le mouvement aléatoire. En vivo traite les évaluations, les cellules immunitaires peuvent être étiquetés avec les colorants fluorescents multiples et utilisés pour transfert adoptif. L’étiquetage différentielle des cellules permet aux populations de cellules mixtes destinés à être introduits dans le même animal, ce qui diminue l’écart et réduit le nombre d’animaux requis pour une expérience suffisamment alimentée. Migration dans le tissu lymphoïde se produit dedans aussi peu que 1 h, et plusieurs compartiments tissulaires peuvent être dégustés. Cytométrie en flux après la récolte du tissu permet une analyse rapide et quantitative des schémas migratoires de plusieurs types de cellules.

Lors de l’utilisation de colorant de calcéine-AM, une inspection visuelle des cellules confirmera l’absorption étiquette (Figure 1). Lecture fluorescent automatique suivra migration comme transport de cellules sur le dessous de l’insert au fil du temps. Ces données montrent clairement une induction de la migration cellulaire vers MCP-1, ainsi qu’une augmentation de cette réponse par le sérum (Figure 2 a). Selon le stimulus migrat...

Protocoles pour une évaluation quantitative de la chimiotaxie des lymphocytes et des migrations sont des outils importants pour la recherche de l’immunologie. Un protocole in vitro est décrit ici, que les permis en temps réel, multiplexés évaluation de la migration cellulaire, ainsi qu’un complémentaire en vivo technique propice suivi de cellules natives de rate.

Quantifier la chimiotaxie Monocyte humain In Vitro et lymphocytes murins traite In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Les objectifs généraux de ces tests consistent à quantifier la chimiotaxie des monocytes in vitro en temps réel et à suivre la migration des lymphocytes in vivo. La méthode in vitro peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, telles que quels sont les effets des facteurs sériques sur la chimiotaxie des cellules immunitaires. Le principal avantage de la technique in vitro est qu'elle permet des mesures quantitatives et multiplexées en temps réel.La méthode in vivo peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de l'immunologie concernant la manière dont certains types cellulaires migrent au sein d'un animal receveur. La technique in vivo est particulièrement utile pour l'évaluation quantitative de la migration de plusieurs types cellulaires au sein du même animal. Avant de commencer l'expérience, marquer les cellules THP-1 avec un colorant fluorescent dans une boîte de culture cellulaire de 35 millimètres, en milieu complet, à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Pendant l'incubation des cellules, ajouter 750 microlitres de HBSS tamponné avec 25 millimolaires de HEPES et 0,1 % de BSA dans les puits de contrôle de fond et de contrô

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons un protocole de fond clair microscopie intravitale pour la mesure dynamique des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium lors du recrutement des neutrophiles en réponse à la source d'un facteur chimiotactique des neutrophiles in vivo. Neutrophiles ramper intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus de souris crémaster sont visualisés avec la photographie vidéo en temps-caduque et suivis avec ImageJ.

Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

Cette vidéo présente une étude expérimentale de la transmigration des lymphocytes à travers un modèle d’endothélium de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Une monocouche de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC) est générée in vitro, et des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) contenant des lymphocytes sont ajoutées à la monocouche. Les cellules sont ensuite incubées pour permettre la transmigration des lymphocytes, et les cellules migrées sont...

Étude de la transmigration lymphocytaire à travers une monocouche de cellules endothéliales microvasculaires

Les auteurs décrivent un protocole visant à mesurer la transmigration de monocytes dans l’ensemble des monocouches endothéliales humaines et leur maturation ultérieure en cellules spumeuses. Cela fournit une méthode polyvalente pour évaluer les propriétés athérogènes des monocytes isolés de personnes atteintes de différentes maladies et d’évaluer des facteurs dans le sang qui peut améliorer cette propension.

Quantification de Monocyte Transmigration et de la Formation de mousse cellulaire par des individus souffrant de maladies inflammatoires chroniques

Leucocytes avidement interagissent avec les cellules vasculaires et plaquettes après blessure de mur de navire ou lors d’une inflammation. Nous décrivons ici un simple test à flux laminaire pour caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires.

Analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire

Nous présentons ici un protocole intégré qui mesure la sous-population de monocyte traite sous flux in vitro par l’utilisation de marqueurs de surface spécifiques et la microscopie confocal fluorescence. Ce protocole peut être utilisé pour explorer les étapes séquentielles de recrutement aussi bien quant à profil autres sous-types de leucocytes à l’aide d’autres marqueurs de surface spécifiques.

Étude simultanée du recrutement des sous-populations de Monocyte sous flux In Vitro

Ici, nous montrons les méthodes in vivo la quantification d’évacuation de leucocytes de naïve, enflammée et peau murine maligne. Nous effectuons une comparaison entre deux modèles : transdermique FITC application et in situ photoconversion. En outre, nous démontrent l’utilité de photoconversion pour le suivi des sorties de leucocytes de tumeurs cutanées.

Quantification des leucocytes évacuation via les vaisseaux lymphatiques de peau Murine et tumeurs

Le protocole introduit ici permet la caractérisation de la capacité de radioralliement pulmonaire des lymphocytes humains primaires dans des conditions inflammatoires in vivo. Une infiltration pulmonaire des cellules immunitaires humaines moutschen transférés dans un modèle murin d’inflammation allergique peut être imagée et quantifiée par microscopie à fluorescence lumière-feuille de tissu pulmonaire chimiquement défrichées.

Avancée d’imagerie du poumon Homing des Lymphocytes humains dans un modèle In Vivo de l’Inflammation allergique, issue des feuilles lumière microscopie expérimentale

Ici nous présentons un protocole pour quantifier l'activité chimiotactique des monocytes sanguins dans les modèles de souris, pour évaluer les effets des interventions nutritionnelles, pharmacologiques et génétiques sur le monocyte sanguin et pour caractériser les macrophages dérivés des monocytes sanguins dans modèles de souris utilisant des bouchons de gel dérivés de la membrane de membrane de membrane de sous-sol monocyte-chemoattractant-1 (MCP-1).

Quantification de l'activité chimiotactique monocyte in Vivo et caractérisation des macrophages dérivés du monocyte sanguin

Dans ce protocole, les lymphocytes sont placés dans la chambre supérieure d'un système de transmigration, séparés de la chambre inférieure par une membrane poreuse. La chimiokine est ajoutée à la chambre inférieure, qui induit une migration active le long d'un gradient de chimiokine. Après 48 h, les lymphocytes sont comptés dans les deux chambres pour quantifier la transmigration.

Évaluation de la migration des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo

Ici, nous décrivons des méthodes utilisant time-lapse, microscopie phase-contraste à l’image de la souris résident macrophages péritonéal dans un complément chemotactic C5a gradient. Les protocoles peuvent être étendus à d’autres cellules immunitaires.

Imagerie time-lapse de la souris Macrophage Chemotaxis

Ce protocole fournit une méthode d’isolement primaire des lymphocytes T murins et de microscopie à intervalle de la migration des lymphocytes T dans des conditions environnementales spécifiques avec une analyse quantitative.

Essai de migration in vitro en temps réel pour les lymphocytes T CD8+ murins primaires

Découvrez comment quantifier la chimiotaxie des monocytes humains in vitro et suivre la migration des lymphocytes murins in vivo. Ces protocoles permettent des mesures multiplex en temps réel pour la recherche en immunologie.

Quantifier la chimiotaxie Monocyte humain In Vitro et lymphocytes murins traite In Vivo

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