Quantifier la chimiotaxie Monocyte humain In Vitro et lymphocytes murins traite In Vivo

Les objectifs globaux de ces tests sont de quantifier la chimiotaxie des monocytes in vitro en temps réel et de suivre la migration des lymphocytes in vivo. La méthode in vitro peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que les effets des facteurs sériques sur la chimiotaxie des cellules immunitaires. Le principal avantage de la technique in vitro est qu’elle permet des mesures quantitatives et multiplex en temps réel.

La méthode in vivo peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie sur la façon dont des types de cellules spécifiques migrent au sein d’un animal receveur. La technique in vivo est particulièrement utile pour l’évaluation quantitative de la migration de plusieurs types de cellules au sein d’un même animal. Avant de commencer l’expérience, étiquetez les cellules THP-1 avec un colorant fluorescent dans une boîte de culture cellulaire de 35 millimètres dans un milieu complet à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Pendant l’incubation des cellules, ajouter 750 microlitres de HBSS tamponnés avec 25 millimolaires d’HEPES et 0,1 % de BSA dans les puits de fond et de contrôle positif d’une plaque de 24 puits. Ajouter la concentration appropriée de MCP-1 dans l’eau enrichie de BSA dans les puits expérimentaux et les puits témoins positifs. Et placez des inserts poreux dans chaque puits, en prenant soin que les languettes des inserts s’alignent avec les encoches de la plaque.

Il est essentiel d’éliminer toutes les bulles des puits inférieurs après avoir placé les inserts, car les bulles interféreront avec les mesures de fluorescence. À la fin de l’incubation, transférez les cellules marquées dans un tube conique de 15 millilitres pour leur collecte par centrifugation. Et inspectez visuellement la pastille résultante pour confirmer l’absorption du colorant.

Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant sous vide et lavez les cellules dans un milieu RPMI-1640 sans sérum complété par 25 millimolaires HEPES dans les mêmes conditions de centrifugation. Remettez le granulé en suspension dans un milieu frais sans sérum avec HEPES pour le comptage. Et ajustez le volume à une concentration finale de un à 1,5 fois 10 à six cellules par millilitre.

Ajoutez 250 microlitres de cellules dans la chambre supérieure de chaque puits et placez la plaque dans un lecteur de plaques à 37 degrés Celsius. Ensuite, obtenez des lectures de fluorescence des chambres inférieures à des intervalles d’une à trois minutes aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de fluorescence appropriées pour le colorant. Pour préparer les cellules du donneur à leur transfert adoptif, il faut d’abord prélever la rate entière d’une souris mâle anesthésiée de huit à 12 semaines C57 black six dans un filtre à mailles en nylon de 40 micromètres dans une boîte de culture cellulaire contenant un milieu complet sur de la glace.

À l’aide de l’extrémité d’un piston de seringue, faites macérer doucement la rate à travers le grillage. Lorsqu’une suspension cellulaire unique a été obtenue, transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et ajoutez quatre volumes de chlorure d’ammonium et de potassium tampon de lyse pour épuiser les globules rouges. Après cinq minutes à température ambiante, récupérez les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille dans un milieu complet à une concentration de deux à cinq fois 10 à la septième cellule par millilitre.

Filtrez les cellules à travers un nouveau maillage en nylon de 40 micromètres pour éliminer les débris cellulaires. Et étiquetez une fois 10 à sept cellules par souris receveuse avec un colorant fluorescent compatible avec les cellules vivantes qui sera conservé lors de la fixation ultérieure pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. A la fin de l’incubation, laver les cellules dans quatre volumes de HBSS complétés par HEPES.

Et remettez le granulé en suspension dans HBSS frais plus HEPES à une concentration d’une fois 10 à la huitième cellule par millilitre. Ensuite, vortex brièvement les cellules du donneur et chargez-les dans une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 27 de 0,5 pouce. Placez les souris anesthésiées âgées de huit à 12 semaines C57 noires à six receveurs en position couchée et appliquez une légère pression caudale sur la peau dorsale de l’œil du premier animal, ce qui fait légèrement saillir le globe oculaire.

Dirigez l’aiguille vers le milieu pour l’injection rétro-orbitaire de 100 microlitres de cellules de donneur. Ensuite, retirez progressivement l’aiguille et placez la souris dans une cage de récupération individuelle avec surveillance jusqu’à récupération complète. Il est essentiel que les animaux soient correctement anesthésiés et que la procédure d’injection ait été bien pratiquée pour assurer une distribution uniforme des cellules entre les animaux et entre les expériences.

Jusqu’à 24 heures après le transfert adoptif, prélevez la rate dans un millilitre de milieu complet par receveur. Et générer une suspension unicellulaire sans globules rouges, comme cela vient d’être démontré. Après le comptage, ajustez la suspension cellulaire à une concentration de trois fois 10 à sept cellules par millilitre dans le tampon de coloration.

Et transférez 100 microlitres de cellules dans des puits individuels d’une plaque à fond rond de 96 puits. Colorer les cellules pour les marqueurs d’intérêt selon les protocoles standard d’analyse cytométrique en flux. Après 20 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière, laver les cellules dans 100 microlitres de tampon de coloration et remettre les granulés en suspension dans 200 microlitres de tampon de coloration frais pour une seconde centrifugation.

Ensuite, mettez la pastille en suspension dans 125 microlitres de tampon de coloration frais et analysez les échantillons de cellules sur un cytomètre en flux selon les protocoles standard. Les lectures fluorescentes automatisées pour suivre la migration démontrent clairement une induction de la migration cellulaire vers MCP-1 qui est augmentée en présence de sérum. Selon l’intensité du stimulus migratoire, il y a un décalage d’au moins 15 minutes avant une augmentation du signal fluorescent qui peut culminer et diminuer progressivement à mesure que les cellules passent en solution dans la chambre inférieure à partir de la face inférieure de l’insert à un rythme plus rapide que celui des cellules migrant de la chambre supérieure.

Si plus d’une population cellulaire marquée par fluorescence est transférée par adoption, il est important de quantifier la proportion relative de populations cellulaires dans le matériau d’entrée pour tenir compte de toute variance dans le mélange des populations cellulaires. Par exemple, dans cette expérience, le rapport entre les cellules fluorescentes vertes et orange était de 0,97 pour un. Le trafic a été quantifié en divisant le nombre de cellules marquées récupérées par le nombre total de cellules récupérées.

Bien qu’il y ait une variation considérable dans le nombre de cellules récupérées entre les animaux, pour un animal donné, le rapport entre les cellules fluorescentes vertes et oranges est généralement à peu près égal. Une fois maîtrisée, la technique in vitro peut être complétée en quatre heures, et la technique in vivo peut être complétée en six heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter de créer des bulles dans les chambres expérimentales et de s’efforcer d’obtenir une cohérence lors de l’injection rétro-orbitale des cellules transférées par adoption.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer la chimiotaxie in vitro et in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mener et de surveiller un test de chimiotaxie in vitro en temps réel et d’isoler les lymphocytes natifs pour leur transfert adoptif et pour suivre leur migration in vivo. Merci d’avoir regardé, et bonne chance dans vos expériences.