Visualisation et l’imagerie direct des oligodendrocytes Organelles dans des tranches de cerveau organotypique utilisant Virus Adeno-associé et microscopie confocale
23 octobre 2017
Oligodendrocytes myélinisantes favorisent la propagation du potentiel d’action rapide et la survie des neurones. Décrit ici est un protocole pour l’expression des protéines fluorescentes dans organotypique oligodendrocyte spécifique des tranches de cerveau avec l’imagerie Time-lapse ultérieur. En outre, une procédure simple pour la visualisation de la myéline non-colorées est présentée.
Le but global de cette transduction virale et de cet enregistrement en lapso-temporel est de visualiser le déplacement des mitochondries des oligodendrocytes dans des tranches cérébrales organotypiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des oligodendrocytes, comme la manière dont les oligodendrocytes et leurs organites réagissent aux changements de l’environnement local. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des informations détaillées sur la structure des oligodendrocytes et la dynamique de leurs organites dans une préparation où toutes les cellules cérébrales différentes sont présentes et où les oligodendrocytes produisent une myéline compacte. Transduire les oligodendrocytes dans des cultures de tranches au septième jour in vitro. Prélever d’abord 1,3 microlitre d’AAV dilué par tranche. En s’assurant que l’extérieur de la pointe de pipette est sec, maintenir la pipette au-dessus du cortex aussi près que possible sans toucher la tranche avec la pointe de la pipette, puis expulser lentement la solution hors de la pipette. Lorsque la solution touche la tranche, déplacer la pointe de la pipette au-dessus du cortex afin de répartir la solution sur toute la surface corticale. Une fois que toutes les tranches d’un plat ont été transduites, remettre le plat dans l’incubateur, puis répéter le processus sur les autres plats. Examiner les tranches pour l’expression des marqueurs fluorescents et imager les tranches lorsque les niveaux d’expression des marqueurs fluorescents sont suffisants et que les tranches semblent saines. Commencer à préparer la chambre d’imagerie en utilisant de l’argile modelable pour fixer des aiguilles de seringue courbées à un angle de 45
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cette étude porte sur la dynamique des oligodendrocytes au moyen d'un protocole d'expression spécifique des protéines fluorescentes dans les tranches cérébrales organotypiques. En utilisant l'imagerie en temps réel, les chercheurs visent à visualiser le déplacement des mitochondries des oligodendrocytes et à comprendre leur réponse aux changements environnementaux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Techniques d'imagerie
Contexte
- Les oligodendrocytes myélinisants sont essentiels à une transmission neuronale efficace.
- Ils améliorent la propagation du potentiel d'action et soutiennent la survie neuronale.
- Comprendre le comportement des oligodendrocytes peut fournir des informations sur le fonctionnement cérébral et les pathologies.
Objectif de l'étude
- Visualiser le déplacement des mitochondries des oligodendrocytes dans un modèle de tranches cérébrales organotypiques.
- Étudier la manière dont les oligodendrocytes réagissent aux changements environnementaux locaux.
- Fournir une méthode facilitant l'évaluation de la structure et de la dynamique des oligodendrocytes.
Méthodes utilisées
- L'expérience utilise des tranches cérébrales organotypiques pour observer le comportement des oligodendrocytes.
- Les oligodendrocytes sont transduits au septième jour in vitro à l'aide d'un vecteur viral.
- La méthode d'imagerie en prise de vue instantanée capture les changements dynamiques des oligodendrocytes.
- Des techniques de pipetage soigneuses sont employées pour assurer une transduction uniforme à travers les tranches.
Résultats principaux
- L'approche permet une observation détaillée du mouvement des oligodendrocytes et de la dynamique mitochondriale.
- Des informations sur les réponses structurelles des oligodendrocytes devraient émerger des données d'imagerie.
Conclusions
- Ce protocole facilite la visualisation de la dynamique des oligodendrocytes dans un modèle pertinent.
- Les résultats pourraient améliorer la compréhension des fonctions des oligodendrocytes et de leurs implications pour la santé neuronale.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet la visualisation de la dynamique des organites des oligodendrocytes dans un modèle de tranches cérébrales physiologiquement pertinent, soutenant ainsi la validation de cibles dans les maladies démyélinisantes. En reliant le comportement mitochondrial aux réponses environnementales, il offre une détection mécanistique des risques pour les candidats neurothérapiques affectant la fonction gliale. L'approche renforce la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte en permettant l'observation directe de la santé des oligodendrocytes et des interactions avec les gaines de myéline.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier des hypothèses spécifiques aux oligodendrocytes concernant les réponses des organites aux changements du microenvironnement.
- Valeur opérationnelle : Utilise une transduction médiée par AAV sous le promoteur de la protéine basique de la myéline pour un marquage spécifique au type cellulaire, réduisant ainsi les effets hors cible.
- Valeur prédictive : Facilite la validation fonctionnelle de cibles en corrélant la dynamique mitochondriale et la santé des oligodendrocytes dans un tissu intact.
Développement de criblage et de tests
- Prêt-à-l’emploi pour tests : Génère des données quantitatives en temps réel sur le mouvement mitochondrial, permettant des lectures normalisées pour le criblage de composés.
- Reproductibilité : Les tranches organotypiques conservent les interactions cellulaires natives, améliorant la cohérence entre les expériences.
- Extensibilité : Compatible avec les plateformes de microscopie confocale couramment utilisées dans les laboratoires de découverte.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Directement applicable aux modèles de démyélinisation où le stress des organites des oligodendrocytes est impliqué.
- Continuité translationnelle : Relie les résultats in vitro à la physiopathologie au niveau tissulaire grâce à l'imagerie en temps réel des processus associés à la myéline.
- Réduction des risques mécanistiques : Permet d'évaluer si des composés testés corrigent ou aggravent le dysfonctionnement des organites dans les oligodendrocytes.
Intégration des pipelines et des flux de travail
S'inscrit dans le continuum de la découverte, de la validation de la cible à l'évaluation préclinique, en particulier pour les programmes portant sur les maladies neurodégénératives et les maladies démyélinisantes.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur les réponses des organites des oligodendrocytes à des perturbations pharmacologiques ou génétiques.
- Criblage : Permet le développement de tests utilisant la mobilité ou la morphologie mitochondriale comme paramètres phénotypiques.
- Analytique : Fournit des données d'imagerie quantitatives (par exemple, vitesse, densité, durée du déplacement mitochondrial) pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Relie la dynamique cellulaire à l'intégrité de la myéline grâce à une microscopie Confocale par Réflexion complémentaire permettant une visualisation sans marquage de la myéline.
- Réutilisation en entreprise : Ce protocole peut être adapté à d'autres organites (par exemple, lysosomes, RE) en utilisant le même vecteur viral AAV, augmentant ainsi l'utilité de la plateforme.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la découverte de médicaments ciblant les oligodendrocytes en visualisant le comportement des organites en temps réel.
- Valeur opérationnelle : Un protocole standardisé de transduction et d'imagerie améliore la reproductibilité entre les sites et les équipes.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt en révélant précocement les effets secondaires sur la santé des cellules gliales.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des composés ajustée au risque, fondée sur leurs effets sur la physiologie des oligodendrocytes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en transduction virale, en culture de tranches organotypiques et en microscopie confocale.
- Dépend de la disponibilité des AAV, de l'optimisation du titre viral et de la spécificité du promoteur pour le ciblage des oligodendrocytes.
- Exige un contrôle environnemental (CO2, température) pour maintenir la viabilité des tranches pendant l'imagerie en temps réel.
- L'adaptation à d'autres organites nécessite la validation des signaux de ciblage mitochondrial par rapport aux séquences de localisation alternatives.
- Limitée par la viabilité des tranches dans le temps et par une variabilité potentielle de l'efficacité de transduction entre les préparations.
