Name: Visualisation et l’imagerie direct des oligodendrocytes Organelles dans des tranches de cerveau organotypique utilisant Virus Adeno-associé et microscopie confocale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Découvrez la visualisation des mitochondries d'oligodendrocytes dans des tranches cérébrales organotypiques par transduction virale AAV et imagerie confocale. Cette méthode révèle la dynamique des organelles en réponse aux changements environnementaux locaux.

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Nous remercions Linda Hildegard Bergersen et Magnar Bjørås pour accéder à la cellule de laboratoire et équipement, personnel Janelia biologie moléculaire ressource partagée pour la production de virus et de plasmide et Koen Vervaeke pour assistance avec mesures de puissance de laser. Ce travail a été financé par l’Association norvégienne de la santé, le Conseil norvégien de la recherche et de l’équipement de microscopie a été financée par Norbrain.

<ol><li>Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+organization+of+oligodendrocyte+processes+during+development+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neursosci%22%5BJournal%5D)">Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo.</a> Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).</li>
<li>Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+density+distribution+of+endoplasmic+reticulum+proteins+and+mitochondria+at+specialized+Ca2%2B+release+sites+in+oligodendrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes.</a> J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).</li>
<li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+interface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li>
<li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li>
<li>Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+myelin+in+the+vertebrate+central+nervous+system+using+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy.</a> Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).</li>
<li>Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+imaging+of+myelin+degradation+reveals+a+calcium-dependent+pathway+in+lyso-PtdCho-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination.</a> J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nat. Med. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+viral+vector+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated viral vector production and purification.</a> Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-directed+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).</li>
<li>Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+basic+protein+gene+contains+separate+enhancers+for+oligodendrocyte+and+Schwann+cell+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression.</a> J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).</li>
<li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+and+structure+of+mitochondria+in+oligodendrocytes+and+their+myelin+sheaths%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths.</a> Glia. 64, 810-825 (2016).</li>
<li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li>
<li>Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).</li>
<li>Macaskill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).</li>
<li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oligodendrocyte+development+and+myelination+by+glucose+and+lactate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate.</a> J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).</li>
<li>Davison, A. N., Dobbing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+as+a+vulnerable+period+in+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+Bull%22%5BJournal%5D)">Myelination as a vulnerable period in brain development.</a> Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+neuronal+degeneration+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures.</a> Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Pignataro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Viral+Vectors+Serotype+8+for+Cell-Specific+Delivery+of+Therapeutic+Genes+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System.</a> Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).</li>
<li>Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticospinal+tract+transduction%3A+a+comparison+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+and+a+non-integrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector.</a> Gene Ther. 19, 49-60 (2012).</li>
<li>Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+composition+of+molecular+motors+on+moving+axonal+cargo+using+cargo+mapping+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis.</a> J. Vis. Exp. (92), e52029(2014).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Le protocole permettant la culture organotypique décrite ici est une version modifiée de18 du protocole décrit par De Simoni et Yu (2006)5. Les changements les plus importants ont été décrites ci-dessous. Tampon Tris est ajouté au milieu de culture, ce qui améliore la survie des tranches en dehors de l’incubateur au cours de la transduction virale et la modification du milieu cellulaire. La procédure de stérilisation de confettis est également modifiée. Alors que les autres...

La substance blanche du cerveau se compose des axones des cellules nerveuses enveloppés dans la myéline, une plasmalemme étendu spécialisé formé par les oligodendrocytes. La myéline est nécessaire pour la propagation du potentiel d’action rapide et fiable et une survie à long terme des axones myélinisés, et une perte de la myéline peut provoquer des dysfonctionnements neurologiques. Malgré leur importance, les propriétés des oligodendrocytes sont moins connues comparées avec les neurones et les astrocytes. Par conséquent, moins d’outils ont été développés pour l’étude des oligodendrocytes.
Vivre l’imagerie des organites cellulaires tels que les mitochondries, le réticulum endoplasmatic (ER) ou différentes structures vésiculaires peuvent être utiles d’étudier les changements dynamiques dans les organites au fil du temps. Traditionnellement, l’imagerie des oligodendrocytes vivant a été réalisée en monocultures1,2. Cependant, oligodendrocytes en monoculture n’affichent pas de myéline compacte et organotypique ou tranches de cerveau aiguë peuvent, par conséquent, être une meilleure option lorsque l'on étudie le mouvement des organites et localisation. Localisation de petits organites et de protéines de la gaine de myéline peut être difficile en raison de la courte distance entre les axones myélinisés et la gaine de myéline environnante. Ainsi, lumière immunostaining microscopiques procédures seul n’ont pas la résolution spatiale d’établir une distinction entre les organites dans la gaine de myéline et ceux dans les axones myélinisés. Cela peut être résolu par transduction virale avec des gènes codant pour des protéines fluorescentes organelle ciblées grâce aux promoteurs spécifiques à un type de cellule. Les avantages sont une expression spécifique des cellules et éparse, qui permet une évaluation précise de la localisation de l’organite et dynamique. Animaux transgéniques permet également d’atteindre telle une ciblées organite spécifique des cellules expression3. Cependant, la production et l’entretien des animaux transgéniques est coûteux et habituellement n’offre pas l’expression rare qui peut être obtenue par des méthodes virales.
La méthode décrite ici utilise la transduction virale des oligodendrocytes avec mitochondrial ciblée des protéines fluorescentes (dsred ou vert fluorescent protéine GFP) conduit par le promoteur de la protéine basique de la myéline (MBP-mito-dsred ou MBP-mito-GFP) pour visualiser mitochondries dans des tranches de cerveau organotypique oligodendrocyte. En outre, l’expression d’une protéine fluorescente dans le cytoplasme (GFP utilisé conjointement avec mito-dsred ou tdtomato utilisé avec mito-GFP) est utilisée pour permettre la visualisation de la morphologie cellulaire, y compris les compartiments cytoplasmiques de la gaine de myéline. Le protocole prévoit la procédure pour faire des coupes de cerveau d’organotypique (une version modifiée du protocole décrit par De Simoni et Yu, 20064,,5). Nous décrivons ensuite la procédure d’imagerie Time-lapse pour étudier le mouvement mitochondriale. Cette procédure utilise un microscope confocal vertical avec un échange continu d’imagerie moyen, une installation qui permet une application facile de drogues ou d’autres modifications moyennes pendant la formation image. La procédure d’imagerie Time-lapse peut être effectuée sur n’importe quel microscope confocal, avec certains équipements supplémentaires pour le maintien des tranches de vie tel que décrit ci-dessous. Le protocole contient également plusieurs conseils pour optimiser l’imagerie et de réduire de phototoxicité.
Enfin, un moyen simple et rapide de visualiser la myéline non-colorées par microscopie confocale réflectance (CoRe) est décrite. Cela peut être utile pour identifier la gaine de myéline pendant la formation image live. Ces dernières années, plusieurs techniques ont été développées à la myéline image sans aucune coloration requise, mais la plupart d'entre eux nécessite des équipements et l’expertise6,7,8. La procédure décrite ici utilise les propriétés réfléchissantes de la gaine de myéline et est une version simplifiée unique-excitation d’onde de la microscopie confocale facteur de réflexion spectrale (SCoRe, dans lequel plusieurs laser des longueurs d’onde est combinés afin de visualiser la myéline) 9. coRe peut être fait sur n’importe quel microscope confocal disposant d’un laser à 488 nm et un filtre d’émission de 470-500 nm passe-bande ou un filtre accordable d’émission.

<table><tbody><tr><td>Agarose&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 19G</td><td>BD</td><td>301500</td><td>Aiguilles pour l’entrée et la sortie du bain</td></tr><tr><td>Gaz biohydroxyde Ampoules de marque</td><td>AGA</td><td>105701</td><td></td></tr><tr><td>Ampoules pipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z615927</td><td></td></tr><tr><td>Bec Bunsen (Brûleur au propane liquide)</td><td>VWR</td><td>89038-530</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble de câbles pour contrôleurs de chauffage Warner</td><td>Instruments</td><td>64-0106&nbsp ;</td><td>Régulateur de température - pièce thermomètre</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21100</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp ;</td><td>AGA</td><td>100309</td><td>CO2 pour incubateur</td></tr><tr><td>Verre de protection, carré Corning</td><td>Thermo&nbsp ; Fischer Scientific</td><td>13206778</td><td>À fixer sous le bain pour l’imagerie en direct. Sceller avec de la colle ou de la gelée de pétrole.</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Pince délicate</td><td>Finescience</td><td>11063-07</td><td>Pour dissection</td></tr><tr><td>Diamant scriber</td><td>pen Ted Pella Inc.</td><td>54463</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes jetables en verre Pasteur 230 mm</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>Pipettes en verre</td></tr><tr><td>Lame de rasoir en acier inoxydable à double tranchant</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>#7200</td><td>Lame de rasoir pour vibratome</td></tr><tr><td>Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>24010-043</td><td></td></tr><tr><td>Cercles de papier filtre</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>300,220</td><td>Papier filtre utilisé pour la filtration de PFA</td></tr><tr><td>Fun</td><td>tack Loctite</td><td>1270884</td><td>Utiliser pour connecter/ajuster la position des entrées et sorties dans la baignoire</td></tr><tr><td>Serviette de bain C-Fold 2</td><td>Katrin</td><td>344388</td><td></td></tr><tr><td>Harp, Plat pour chambre RC-41,</td> <td>Warner Instruments</td><td>&nbsp ; 64-1418</td><td>Harpe pour retenir les confettis dans le bain. Coupez les ficelles avant de les utiliser avec des tranches organotypiques. 1,5 mm, 13 mm, SHD-41/15</td></tr><tr><td>HEPES, FW : 260.3</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>Holten LaminAir, modèle 1.2</td><td>Heto-Holten</td><td>96004000M</td><td>Hotte à flux laminaire</td></tr><tr><td>Sérum de cheval, inactivé thermiquement</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Membrane LCR, PTFE,&nbsp ;</td><td>Confettis</td> <td>Millipore</td><td>FHLC0130</td></tr><tr><td>Leica VT1200</td><td>Leica</td><td>14048142065</td><td>Vibratome</td></tr><tr><td>MEM-Glutamax avec HEPES</td><td>Thermo&nbsp ; Fischer Scientific</td><td>42360024</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>R.P. Normapur</td><td>25 108.295</td><td></td></tr><tr><td>Micro cuillère Heyman Type B</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>62411-B</td><td>Petite spatule arrondie avec extrémité affûtée pour la dissection</td></tr><tr><td>Unité de filtration Millex-GP Unité</td> de filtration <td>Millipore</td><td>SLGPM33RA</td><td>Unité de filtration à seringue</td></tr><tr><td>Insert de culture cellulaire Millicell, 30 mm</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td>Inserts de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Minipuls 3 vitesses Module de contrôle</td><td>GILSON</td><td>F155001</td><td>Pompe péristaltique pour l’imagerie en direct - Pièce du module de contrôle (connexion à deux têtes cannel)</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fluka</td><td>71628</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta</td><td>Surface Thermo&nbsp ; Fischer Scientific</td><td>140675</td><td>Plaque de culture</td></tr><tr><td>Nystatin Suspension</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Objectif W « Plan-Apochromat » 40x/1.0 DIC&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td>441452-9900-000&nbsp ;</td><td>Objectif à immersion dans l’eau utilisé pour l’imagerie en direct. (WD=2.5mm), VIS-IR</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1211</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde,</td><td>Microscopie électronique</td> granulaire Sciences<td>#19208</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de perfusion PC-R</td><td>SiSkiYou</td><td>&nbsp ; 15280000E</td><td>Bain pour l’imagerie en direct</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine, liquide</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 140 mm&nbsp ;</td><td>Heger</td><td>1075</td><td>Grande boîte de Pétri</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 92x16 mm&nbsp ;</td><td>Sarstedt&nbsp ;</td><td>82.1473</td><td>Boîte de Pétri moyenne&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pétridure 55x14,2 mm</td><td>VWR</td><td>391-0868</td><td>Petite boîte de Pétri</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>Comprimés PBS</td></tr><tr><td>R2 Tête à deux canaux&nbsp ;</td><td>GILSON</td><td>F117800</td><td>Pompe péristaltique pour l’imagerie en direct - Tête à deux canaux (nécessite module de commande)</td></tr><tr><td>Spatules rondes/plates, acier inoxydable</td><td>VWR</td><td>82027-528</td><td>Grande spatule pour la dissection</td></tr><tr><td>Papier de verre</td><td>VWR</td><td>MMMA63119</td><td>En option, pour lisser les pipettes en verre brisé</td></tr><tr><td>Ciseaux,&nbsp ; 17,5 cm</td><td>Finescience</td><td>14130-17</td><td>Grands ciseaux pour la dissection</td></tr><tr><td>Ciseaux, 8,5&nbsp ;</td><td>Finescience</td><td>14084-08</td><td>Petits ciseaux tranchants pour la dissection</td></tr><tr><td>Lame à un seul tranchant, gemme</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>#71972</td><td>Lame de rasoir à un seul tranchant</td></tr><tr><td>Chauffage de solution en ligne unique SH-27B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td>Régulateur de température - pièce chauffante</td></tr><tr><td>Steritop-GP Unité de filtration, 500 ml , 45mm</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>Filtre à stériliser solutions</td></tr><tr><td>Super colle de précision</td><td>Loctite</td><td>1577386</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel chirurgical n° 22</td><td>Swann Morton Ltd.</td><td>209</td><td>Lame de scalpel arrondie</td></tr><tr><td>Régulateur de température TC324B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0100</td><td>Régulateur de température pour l’imagerie en direct (nécessite un réchauffeur de solution et un ensemble de câble)</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à chemise d’eau série II</td><td>Forma Scientific</td><td>78653-2882</td><td>Incubateur</td></tr></tbody></table>

visualisation et l’imagerie direct des oligodendrocytes organelles dans des tranches de cerveau organotypique utilisant virus adeno-associé et microscopie confocale

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Les neurones dépendent de l’isolation électrique et le soutien trophique des oligodendrocytes myélinisantes. Malgré l’importance des oligodendrocytes, les outils avancés actuellement utilisés pour étudier les neurones, en partie seulement ont été prises par des chercheurs de l’oligodendrocyte. Cellule spécifique au type de coloration par transduction virale est une approche utile pour étudier la dynamique de l’organite direct. Cet article décrit un protocole pour la visualisation des mitochondries des oligodendrocytes dans des tranches de cerveau organotypique de transduction avec adeno-associated virus (AAV) transportant des gènes mitochondries protéines fluorescentes ciblés sous le contrôle transcriptionnel de le promoteur de la protéine basique de la myéline. Il inclut le protocole pour faire des coupes de cerveau de souris coronale organotypique. Une procédure de Time-lapse imagerie des mitochondries puis suit. Ces méthodes peuvent être transférées vers les autres organites et peuvent être particulièrement utiles pour l’étude des organites dans la gaine de myéline. Enfin, nous décrivons une technique facilement accessible pour la visualisation de la myéline non colorée dans des tranches de vie par microscopie confocale réflectance (CoRe). Noyau a besoin d’aucun équipement supplémentaire et peut être utile pour identifier la gaine de myéline pendant la formation image live.

Organotypique des tranches de cerveau qui ont été cultivées et transduites tel que décrit ci-dessus montrent une distribution clairsemée des oligodendrocytes corticales exprimant mito_dsred et GFP. Immunohistochimie avec des anticorps contre Olig2 et MBP a confirmé que l’expression spécifique d’oligodendrocytes (Figure 1).
Pour l’imagerie live, oligodendrocytes transduits ont été reconnus par leur m...

Oligodendrocytes myélinisantes favorisent la propagation du potentiel d’action rapide et la survie des neurones. Décrit ici est un protocole pour l’expression des protéines fluorescentes dans organotypique oligodendrocyte spécifique des tranches de cerveau avec l’imagerie Time-lapse ultérieur. En outre, une procédure simple pour la visualisation de la myéline non-colorées est présentée.

Visualisation et l’imagerie direct des oligodendrocytes Organelles dans des tranches de cerveau organotypique utilisant Virus Adeno-associé et microscopie confocale

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Le but global de cette transduction virale et de cet enregistrement en lapso-temporel est de visualiser le déplacement des mitochondries des oligodendrocytes dans des tranches cérébrales organotypiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des oligodendrocytes, comme la manière dont les oligodendrocytes et leurs organites réagissent aux changements de l’environnement local. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des informations détaillées sur la structure des oligodendrocytes et la dynamique de leurs organites dans une préparation où toutes les cellules cérébrales différentes sont présentes et où les oligodendrocytes produisent une myéline compacte. Transduire les oligodendrocytes dans des cultures de tranches au septième jour in vitro. Prélever d’abord 1,3 microlitre d’AAV dilué par tranche. En s’assurant que l’extérieur de la pointe de pipette est sec, maintenir la pipette au-dessus du cortex aussi près que possible sans toucher la tranche avec la pointe de la pipette, puis expulser lentement la solution hors de la pipette. Lorsque la solution touche la tranche, déplacer la pointe de la pipette au-dessus du cortex afin de

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Nous présentons ici l'injection intracrânienne de vecteurs AAV pour le marquage fluorescent des neurones et cellules gliales dans le cortex visuel.

Injection intracrânienne des vecteurs adéno-associés virale

Ce protocole décrit une analyse organotypique optimisé pour le cerveau postnatal et à haute résolution imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes dans le flux rostrale migrateurs.

Un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal

Source : Kennedy, L. H., et. al. Visualisation et imagerie en direct d’organites oligodendrocytaires dans des tranches de cerveau organotypiques à l’aide d’un virus adéno-associé et de la microscopie confocale. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre l’imagerie des mitochondries oligodendrocytaires dans des tranches de cerveau de souris organotypiques. La tranche est placée à l’intérieur d’une chambre de bain avec une circulation continue du fluide et une température contrôlée. Après avoir...

Imagerie confocale du mouvement mitochondrial dans les oligodendrocytes dans des cultures de coupes cérébrales organotypiques

Source : Moye, S. L., et.al.  Visualisation de la morphologie des astrocytes à l’aide de l’ionophorèse jaune de Lucifer. J. Vis. exp. (2019).  Cette vidéo montre l’utilisation de l’ionophorèse fluorescente pour étudier la morphologie des astrocytes dans des tranches de cerveau fixes. Il détaille le perçage du soma astrocytaire avec une électrode pour délivrer un colorant anionique et hydrophile dans le cytoplasme sous un courant à basse tension, permettant au colorant de diffuser et de marquer...

Visualisation de la morphologie des astrocytes à l’aide de l’ionophorèse d’un colorant fluorescent dans une tranche de cerveau de souris fixe

Une technique d’étude des cellules NG2 et des oligodendrocytes à l’aide d’un système de culture en tranches du cerveau antérieur et du cervelet est décrite.  Cette méthode permet d’examiner la dynamique de prolifération et de différenciation des cellules au sein de la lignée des oligodendrocytes où l’environnement extracellulaire peut être facilement manipulé tout en maintenant la cytoarchitecture tissulaire.

Cultures organotypique de tranche d&#39;étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

Pour aborder les mécanismes de démyélinisation et d’apoptose neuronale dans les lésions corticales des troubles inflammatoires démyélinisants, différents modèles animaux sont utilisés. Nous décrivons ici une approche ex vivo en utilisant des lymphocytes T CD8+ spécifiques des oligodendrocytes sur des coupes de cerveau, entraînant la mort oligodendrogliale et neuronale. Les applications potentielles et les limites du modèle sont discutées.

Une Ex vivo Modèle de T-Cell Attaque de Oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales

Présenté ici est la méthode du tube mis à jour le rouleau pour la culture et intermittent une imagerie du cerveau rongeur tranches sur plusieurs semaines avec un repositionnement précis sur couvre-objet en photodécoupe. Viabilité neuronale et la morphologie de la tranche sont bien entretenus. Sont prévues des adaptations de ce système entièrement fermé à l’aide de virus pour l’expression spécifique de type cellulaire.

Mis à jour le rouleau Tube méthode d’imagerie Intermittent précisément localisé et répétitif au cours de la Culture à long terme des tranches de cerveau dans un système fermé

Nous décrivons un protocole pour l'expression spécifique de type cellulaire du capteur génétiquement codé à base de FRET ATeam1.03YEMK dans les cultures de tranches organotypiques du cerveau avant-cerveau de la souris. En outre, nous montrons comment utiliser ce capteur pour l'imagerie dynamique des niveaux d'ATP cellulaire dans les neurones et les astrocytes.

Imagerie de l'ATP intracellulaire dans les tranches de tissu organotypiques du cerveau de la souris à l'aide du capteur ATeam1.03YEMK à base de FRET

Nous présentons ici une méthode pour étudier la morphogenèse des neurites dans les explants rétiniens postnatals de souris par microscopie confocale time-lapse. Nous décrivons une approche pour le marquage clairsemé et l’acquisition de types de cellules rétiniennes et de leurs processus fins en utilisant des vecteurs de virus adéno-associés recombinants qui expriment des protéines fluorescentes ciblées sur la membrane d’une manière dépendante de Cre.

Imagerie en accéléré de l’arborisation neuronale à l’aide du marquage clairsemé du virus adéno-associé à des populations de cellules rétiniennes génétiquement ciblées

Ici, nous décrivons un protocole combinant l’injection de virus adéno-associés avec l’implantation de fenêtres crâniennes pour l’imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez la souris éveillée.

Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez des souris éveillées

Découvrez la visualisation des mitochondries d'oligodendrocytes dans des tranches cérébrales organotypiques par transduction virale AAV et imagerie confocale. Cette méthode révèle la dynamique des organelles en réponse aux changements environnementaux locaux.

Visualisation et l’imagerie direct des oligodendrocytes Organelles dans des tranches de cerveau organotypique utilisant Virus Adeno-associé et microscopie confocale (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation et l’imagerie direct des oligodendrocytes Organelles dans des tranches de cerveau organotypique utilisant Virus Adeno-associé et microscopie confocale

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