Mise en place du poisson-zèbre larvaire comme modèle Animal pour enquêter sur Trypanosoma cruzi motilité In Vivo

L’objectif global de cette procédure est d’établir le poisson-zèbre comme modèle in vivo pour étudier la motilité de Trypanosoma cruzi. Trypanosoma cruzi est le parasite qui cause la maladie de Chagas. Il s’agit d’une maladie tropicale négligée qui se transmet principalement par vecteur en Amérique latine et dans certaines régions des États-Unis.

Le parasite est transmis à l’homme par les excréments des vecteurs, qui contiennent la partie infectieuse, puis se répliquent dans les cellules hôtes. Le mouvement des flagelles permet au parasite de se déplacer dans le corps. Mais il est également essentiel pour l’attachement dans l’invasion cellulaire.

Les modèles d’infection in vivo à Trypanosoma cruzi concernent principalement les rongeurs. Le travail enseigne l’opacité se complique en suivant le parasite à l’intérieur de l’animal. La motilité du parasite n’a jusqu’à présent été étudiée qu’in vitro, par conséquent, un modèle in vivo permettrait de comprendre l’aspect clé du mouvement du parasite dans des conditions d’écoulement.

À la recherche d’un modèle alternatif, nous avons trouvé les larves de poisson-zèbre. Les larves de poisson-zèbre sont un modèle puissant pour étudier les interactions hôte-pathogène in vivo. Ils sont petits, bon marché et très faciles à élever par rapport aux souris.

Ce qui est très important pour notre étude, c’est que leur système immunitaire est très similaire à celui des humains. Leur système immunitaire adaptatif ne commence à se développer que quatre jours après la fécondation, et il mûrit jusqu’à quatre semaines plus tard, ce qui nous donne une très grande fenêtre pour travailler sans interférence immunitaire. Cependant, le plus grand avantage du poisson-zèbre pour notre étude est sa transparence optique.

Cela en fait un modèle idéal pour le criblage et l’imagerie microscopiques. Ceci, combiné à toutes les techniques de manipulation génétique du poisson, et à toutes les lignées transgéniques et mutantes disponibles, donne vraiment beaucoup de possibilités à étudier. Dans cette vidéo, nous allons montrer comment une larve mutante de la lignée Casper, qui est complètement transparente car sans pigmentation, peut être utilisée pour visualiser les parasites T.cruzi in vivo.

Afin de visualiser l’intérieur de ces poissons-zèbres, nous utilisons la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière. La microscopie à fluorescence à feuillet de lumière est une famille de techniques où vous n’éclairez que le plan focal de l’objectif de détection. La conséquence est que vous n’avez pas de lumière au premier plan ou à l’arrière-plan, ce qui permet d’obtenir de belles images nettes, même au plus profond de vos embryons.

Étant donné que seule la partie de l’échantillon qui vous intéresse est éclairée, vous avez beaucoup moins de dommages photo de votre échantillon, ce qui vous permet de prendre des vidéos pendant de longues périodes. Ici, nous visualisons des parasites T.cruzi vivants à l’intérieur de larves de poisson-zèbre. La nature de la feuille de lumière nous permet de prendre des vidéos à grande vitesse avec une belle résolution spatiale et temporelle, par rapport aux microscopes confocaux.

Pour autant que nous le sachions, les trypanosomes vivants n’ont jamais été visualisés à l’intérieur d’un organisme vivant. Trois jours avant les injections, établissez des accouplements avec des couples sains de poissons mâles et femelles, ou un mâle et deux femelles dans des bassins de reproduction pour augmenter la production totale d’œufs. En suivant le protocole textuel, récupérez les œufs pondus à l’aide d’une petite passoire.

Lavez les œufs en inversant la passoire et en versant de l’eau d’œuf à travers la passoire dans une boîte de Pétri. Pour garder les embryons en bonne santé, nettoyez leur eau en enlevant tous les débris ou les ovules non fécondés avec une pipette en plastique de transfert. Ensuite, placez les embryons dans un incubateur à 28 degrés Celsius et répétez la procédure de nettoyage toutes les trois heures pour éliminer les œufs non viables et garder la couvée en bonne santé.

48 heures ou deux jours après la fécondation, vérifiez que la plupart des embryons ont éclos. Cependant, si nécessaire, déchorionnez les embryons sous le stéréoscope en saisissant les extrémités opposées du chorion avec deux pinces tranchantes et tirez doucement d’une extrémité pour l’ouvrir. Utilisez une pipette de transfert pour retirer le chorion de l’eau.

Pour l’injection, préparez d’abord des aiguilles d’un millimètre à l’aide de capillaires en verre à paroi mince et d’un dispositif polaire à micropipette. Rangez les aiguilles scellées dans une boîte de Pétri sur une bande de pâte à modeler. Pour fabriquer le moule de micro-injection, préparez une solution d’agarose à 1,5 % dans de l’eau distillée et versez-la dans une boîte de Pétri.

Placez ensuite un moule de micro-injection larvaire préfabriqué sur l’agarose et laissez-le se solidifier complètement à température ambiante sur une surface plane. Soulevez le moule de micro-injection et ajoutez de l’eau pour le stockage à quatre degrés Celsius. Cela empêche l’agarose de se dessécher.

Préparez la solution anesthésiante en ajoutant de l’eau d’œuf au volume approprié de stock de tricaïne pour obtenir une concentration finale de 150 milligrammes par litre. Conservez la solution à quatre degrés Celsius. Enfin, préparez un stock d’agarose à bas point de fusion pour l’imagerie en dissolvant la poudre d’agarose à bas point de fusion dans de l’eau d’œuf à une concentration finale de 1 %. Chauffez le mélange jusqu’à ce que la solution d’agarose apparaisse homogène et stockez les aliquotes à quatre degrés dans des tubes de réaction de 1,5 millilitre.

Les parasites sont obtenus à partir d’un isolat de Trypanosoma cruzi 01/DA et sont cultivés dans une lignée cellulaire d’astrocytome humain, complétée par un milieu complet à l’aide de flacons T25. Après trois ou quatre jours de culture, les parasites sortent des cellules et des trypomastigotes peuvent être collectés sur le surnageant. Centrifugez ce surnageant pendant cinq minutes et remettez doucement la pastille en suspension dans 1X PBS avec du sérum de veau fœtal.

Ensuite, centrifugez pendant cinq minutes, jetez le surnageant et mettez-le en suspension dans un millilitre de PBS. Prenez 10 microlitres pour compter les parasites nageant librement dans une chambre Neubauer. Prenez le reste des parasites remis en suspension et ajoutez un microlitre de CFSE et incubez pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, ajoutez du PBS pour compléter 10 millilitres. Centrifugez pendant cinq minutes, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille contenant les parasites marqués dans 100 microlitres de PBS. Après cette procédure de marquage, il est important de vérifier que les parasites sont vivants et correctement marqués par visualisation directe des parasites sur un microscope à fluorescence inversée.

En mode lumière transmise, vérifiez que les parasites se déplacent. En mode fluorescence, utilisez le filtre pour évaluer le marquage des parasites. Chargez d’abord l’aiguille en verre scellée avec 10 microlitres de la solution contenant les parasites à l’aide d’une pointe de pipette à microchargeur.

Ensuite, insérez l’aiguille en verre dans le porte-aiguille du micromanipulateur. Sous le stéréoscope, coupez environ cinq millimètres de la pointe de l’aiguille à l’aide d’une pince fine. Ensuite, anesthésez la larve 48 heures après la fécondation dans une solution de tricaïne jusqu’à ce qu’elle ne réponde plus au toucher.

Placez la larve dans la plaque d’agarose en position latérale sous le stéréoscope. Ajustez le micromanipulateur de manière à ce que la pointe de l’aiguille soit au centre du jaune de la larve. Réglez les paramètres du micro-injecteur.

Injectez le poisson dans la vallée de la circulation sanguine du jaune. Vérifiez que le cœur bat et transférez immédiatement la larve dans de l’eau d’œuf fraîche pour la récupération. Transférez l’embryon injecté dans une boîte de Pétri vide et retirez soigneusement l’eau environnante à l’aide d’une pipette en plastique et d’un papier absorbant.

Ajoutez immédiatement environ 100 microlitres d’agarose préchauffée à 1 % à bas point de fusion pour couvrir l’embryon. Assurez-vous que l’agarose ne dépasse pas 40 degrés Celsius. Insérez un fil droit à l’intérieur d’un capillaire en verre et utilisez-le comme piston pour prendre l’embryon en position verticale.

Cela doit être fait rapidement avant que l’agarose ne se solidifie. Pendant que vous absorbez l’agarose, assurez-vous de laisser un peu d’agarose au-dessus de l’embryon et attendez qu’il se solidifie. Si nécessaire, poussez l’agarose supplémentaire sous l’embryon et coupez-le.

Remplissez la chambre de l’échantillon avec la solution de tricaïne et réglez la température de la chambre de l’échantillon à 28 degrés Celsius. Ensuite, insérez le capillaire contenant l’embryon dans le porte-échantillon du microscope et placez-le dans l’étape du micromanipulateur. Poussez l’extrémité contenant l’embryon jusqu’à ce qu’il pende librement.

En mode lumière transmise, positionnez l’échantillon devant la pupille de l’objectif de détection à l’aide d’un système de micromanipulateur XYZ et d’une platine de rotation pour le faire pivoter autour de l’axe vertical. Il est utile de focaliser d’abord une bordure du capillaire, puis de se déplacer pour trouver l’embryon et les structures d’intérêt, comme le cœur ou le système vasculaire. À l’aide d’un laser de 488 nanomètres ou d’une longueur d’onde similaire, passez en mode fluorescent et ajustez l’intensité de l’éclairage ainsi que le temps d’exposition pour réduire le blanchiment des photos et optimiser la résolution temporelle.

Pour cela, il faut choisir un objectif avec une bonne ouverture numérique. Lancez l’acquisition vidéo de la région d’intérêt. Dans notre cas, on observe des parasites attachés à des valves et se déplaçant librement dans la région du cœur.

Il est recommandé de prendre une vidéo d’un seul plan au fil du temps ou d’utiliser le micromanipulateur ou le système piézoélectrique et galvo pour focaliser différents plans et suivre le mouvement du parasite. Une fois l’acquisition terminée, retirez soigneusement l’embryon de l’agarose à l’aide d’une pince fine et d’un outil de boucle de cheveux. Remettez le poisson dans l’eau fraîche des œufs et vérifiez la récupération pendant 15 minutes.

Ensuite, éliminez-le selon les protocoles standard de votre établissement. Pour toutes les procédures présentées ici, des embryons 48 heures après la fécondation ont été utilisés. Différents sites anatomiques pourraient être utilisés pour inoculer le parasite, cependant, la vallée de circulation sanguine du sac vitellin ou du canal de Cuvier est la région la plus rapide et la plus facile à injecter et d’accéder au système cardiovasculaire.

Dans les huit à 10 minutes suivant l’injection de Trypanosoma cruzi dans le canal de Cuvier, les parasites sont observés dans le système cardiovasculaire en développement. Certains parasites restent attachés aux parois du sac vitellin embryonnaire ou aux structures cardiaques telles que la valve auriculo-ventriculaire. Les parasites oscillent avec des contractions cardiaques, ce qui démontre leur mécanisme d’adhérence efficace.

De plus, on voit des parasites dériver avec le flux sanguin dans la même direction que les érythrocytes dans l’espace péricardique et dans les vaisseaux sanguins. La méthode que nous avons développée permet d’observer in vivo les parasites de T. cruzi au sein de larves de poisson-zèbre transparentes. Cela peut être très utile pour visualiser et analyser la dynamique d’un agent pathogène, comme la motilité à travers le sang et les structures cardiaques d’un organisme vertébré vivant.

Il est important de garder le temps entre l’injection et la visualisation court afin de voir le parasite nageant librement. Il est également crucial d’optimiser les paramètres d’acquisition lors de l’utilisation du microscope à feuillet de lumière pour réduire les dommages photographiques tout en obtenant des images de bonne qualité. La micro-injection de T. cruzi dans les larves de poisson-zèbre est une technique efficace pour inoculer le parasite dans la circulation sanguine.

Dans cette méthode, vous avez vu que l’étiquetage CFC du parasite était une procédure pratique qui permettait une visualisation claire du parasite à l’intérieur du poisson. L’injection dans le canal de Cuvier est un moyen doux de s’assurer que les parasites passent par la circulation. T.cruzi a tendance à adhérer aux valves du cœur et aux gros vaisseaux du poisson.

Mais selon nos expériences, il n’y a pas d’infection cellulaire. D’autres études sont nécessaires pour élucider son tro-pez-ee.