État fondamental l’appauvrissement Super-résolution imagerie dans les cellules de mammifères

Cet article décrit un protocole pour la détection d’un ou plusieurs plasma et/ou des protéines de la membrane intracellulaire Super-résolution par appauvrissement de l’état fondamental (GSD) microscopie en cellules mammifères. Ici, nous discutons des avantages et des considérations d’utiliser ces approches pour la visualisation et la quantification des protéines cellulaires.

L’objectif global de cette technique d’imagerie fluorescente est de visualiser et de quantifier les protéines cellulaires dans des cellules fixes à une résolution limitée par la subdiffraction en utilisant une forme de microscopie à super-résolution appelée microscopie à appauvrissement de l’état fondamental et retour de molécule individuelle. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire et de la biophysique membranaire, car elle contourne la résolution limitée par la diffraction, ce qui aide les chercheurs à définir, visualiser et quantifier plus précisément la distribution des protéines cellulaires. Le principal avantage de ce protocole est qu’il permet d’acquérir des images dont la résolution est environ dix fois supérieure à celle des approches conventionnelles de microscopie à fluorescence, telles que la microscopie confocale.

La démonstration de la procédure sera assurée par Oscar Vivas, post-doctorant dans mon laboratoire, et Karen Hannigan, post-doctorante dans le laboratoire de Rose Dixon. Pour commencer, préparez les fiches de couverture et les cellules comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Fixer ensuite les échantillons et effectuer une immunocytochimie afin de marquer la membrane plasmique et/ou les protéines membranaires intracellulaires d’intérêt.

Ensuite, préparez la solution Glock de piégeage de l’oxygène en ajoutant d’abord 12,5 microlitres d’une solution mère de catalase, 3,5 milligrammes de glucose oxydase et 0,5 microlitre d’une molaire Tris à 49,5 microlitres de PBS dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Fermez le tube et agitez-le brièvement pour dissoudre les composants. Ensuite, centrifugez la solution pendant trois minutes.

Maintenant, préparez la solution de thial induisant la commutation photo en dissolvant la solution de bêta-mercaptoéthylamine dans du PBS à une concentration de 100 millimolaires et modifiez le pH à 8,0. Aliquote et conservez la solution thiale au congélateur jusqu’à une semaine. Immédiatement avant l’imagerie, mélangez les composants de piégeage du thial et de l’oxygène avec un tampon salin et stockez la solution sur de la glace.

À l’aide de 100 microlitres de tampon de commutation de photos préparé, montez des lamelles contenant des cellules colorées sur les lames de dépression. Ensuite, scellez les bords de la lamelle avec une colle silicone pour éviter l’oxydation rapide du tampon d’imagerie. Attendez quelques minutes jusqu’à ce que la colle silicone soit complètement durcie, avant de passer à l’imagerie.

Sinon, le couvercle dérivera. Pour commencer, sélectionnez un laser approprié pour éclairer l’échantillon, en fonction du fluorophore choisi. Pour un fluorophore Alexa 647, utilisez un laser de 642 nanomètres.

Ensuite, choisissez le cube d’imagerie dichroïque et l’objectif appropriés. Ouvrez le logiciel d’imagerie. Sélectionnez le mode d’acquisition 2D puis réglez le temps d’exposition sur 11 millisecondes.

Réglez également le gain EM sur 300 et sélectionnez un seuil de détection approprié. Ensuite, activez le contrôle automatique des événements et définissez le nombre d’événements par image sur huit. Entrez la taille des pixels de 20 nanomètres.

Dans l’onglet Outils GSD, accédez aux options de calcul d’image haute résolution et assurez-vous que le mode Histogramme est sélectionné. Pour imager les protéines au niveau de la membrane plasmique, sélectionnez le mode TIRF et modifiez l’angle d’incidence pour déterminer la profondeur de pénétration. Ensuite, réglez l’intensité du laser à 100 % afin d’envoyer les électrons à l’état sombre.

Ensuite, sélectionnez Détection de molécule unique pendant le pompage et configurez-la pour acquérir automatiquement lorsque la corrélation d’image est de 0,20. Pour l’acquisition, réglez l’intensité laser sur 50 % et le nombre de trames d’acquisition sur 60 000. Ensuite, commencez à prendre des images.

Pour quantifier la taille d’un cluster de protéines, ouvrez le fichier image d’une carte de localisation d’une molécule unique d’histogramme de 10 nanomètres dans ImageJ. Dans le menu Image, allez dans Ajuster et utilisez l’option Auto pour optimiser la luminosité et le contraste de l’image. Ensuite, dans le menu Type, choisissez 8 bits.

Ensuite, ouvrez le menu Analyser, cliquez sur Définir l’échelle et entrez les valeurs indiquées ici. Ensuite, dans le menu Analyser, sélectionnez Définir les mesures et cochez la case à côté de l’option Surface. De retour dans le menu Image, sélectionnez Ajuster, Seuil, puis Au-dessus/Sous.

Déplacez la valeur maximale à 255, la valeur minimale à un, puis cliquez sur Appliquer. Enfin, ouvrez le menu Analyser et sélectionnez Analyser les particules. Cochez la case pour sélectionner Unités de pixels, Afficher les résultats et Résumer.

Réglez ensuite la taille sur quatre à l’infini, sélectionnez l’option Contours nus et cliquez sur OK. La cellule imagée ici a été transfectée avec la protéine du réticulum endoplasmique, mCherry-Sec61 beta, et imagée à l’aide de la microscopie TIRF à défraction limitée et de la microscopie GSD à super-résolution en mode TIRF. Ces courbes représentent le diamètre des tubules du RE. L’image de droite montre une amélioration de la résolution latérale et représente une représentation plus précise de la structure des tubules du RE.

L’amélioration de la résolution offerte par l’imagerie GSD à super-résolution est encore démontrée dans ces images, montrant un myocyte cardiaque marqué avec un anticorps anti-CAV 1.2. En utilisant le mode GSD, l’amélioration de la résolution latérale est importante et les groupes séparés de canaux sont plus faciles à identifier. Une fois maîtrisé, ce protocole peut être complété en moins de trois jours.

L’imagerie super-résolution d’une seule cellule prend 10 à 30 minutes, selon le nombre d’images requises. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’électromicroscopie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont la protéine fluorescente d’intérêt interagit avec l’environnement cellulaire complexe. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation, de l’acquisition et de l’analyse d’échantillons pour visualiser une ou plusieurs protéines cellulaires pour la microscopie à super-résolution en utilisant la déplétion de l’état fondamental suivie d’un retour de molécule individuelle.