Name: État fondamental l’appauvrissement Super-résolution imagerie dans les cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Découvrez la microscopie GSD pour visualiser et quantifier les protéines membranaires dans les cellules de mammifères avec une résolution supérieure à la limite de diffraction. Cette méthode offre une amélioration dix fois supérieure aux techniques conventionnelles.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par une subvention de l’AHA à R.E.D. (15SDG25560035). Auteurs tient à remercier Dr. Fernando Santana pour utilisation de son microscope 3D Leica SR GSD et Dr. Johannes Hell pour aimablement l’anticorps FP1.

<ol><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+structured-illumination+microscopy%3A+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hell, S. W., Kroug, M. <a target="_blank" href="http://www3.mpibpc.mpg.de/groups/hell/publications/pdf/Appl._Phys._B._60_495_497.pdf">Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit.</a> JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).</li>
<li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+barrier+in+fluorescence+microscopy+by+optical+shelving%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving.</a> Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).</li>
<li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302(2011).</li>
<li>Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+is+associated+with+class+C+L-type+calcium+channels+%28Cav1.2%29+and+antagonizes+channel+phosphorylation+by+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase.</a> J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twinkle%2C+twinkle+little+star%3A+photoswitchable+fluorophores+for+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).</li>
<li>Dempsey, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja904588g">Photoswitching mechanism of cyanine dyes.</a> J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
<li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+versatile+method+for+GFP-based+super-resolution+microscopy+via+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies.</a> Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).</li>
<li>Dixon, R. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4360655/">Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).</li>
<li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li>
<li>Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+two+or+three%3F+Probing+the+stoichiometry+of+membrane+proteins+by+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy.</a> Sci Rep. 5, 14072(2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrentes de divulguer.

L’explosion récente des technologies qui permettent l’imagerie au-delà de la limite de diffraction ont offert de nouvelles fenêtres dans les complexités de la signalisation dans l’espace et le temps des cellules de mammifères. Ces technologies comprennent STORM, STED, PALM, GSD, SIM et leurs variantes (p. ex., dSTORM, FPALM). L’ingéniosité des scientifiques derrière ces techniques nous a permis de contourner les limitations imposées par les lois de la physique qui régissent la diffraction de la lumière. En dépit...

Réactions de signalisation cellulaires traduisent des environnements internes et externes pour amorcer une réaction cellulaire. Ils réglementent tous les aspects de la physiologie humaine, servant de la Fondation pour l’hormone et la libération des neurotransmetteurs, le rythme cardiaque, vision, de fertilisation et la fonction cognitive. Perturbation de ces cascades de signalisation peut avoir des conséquences graves dans la forme de conditions physiopathologiques, y compris le cancer, maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer. Pendant des décennies, les enquêteurs biologiques et médicales ont utilisé avec succès protéines fluorescentes, sondes et biocapteurs couplées avec la microscopie en fluorescence comme les principaux outils pour comprendre l’organisation spatiale et temporelle précise de ces cellulaires les signaux.
Les points forts de techniques optiques tels qu’épifluorescence, confocale, ou la microscopie de fluorescence (FRBR) réflexion totale interne sont leur sensibilité, la vitesse et la compatibilité avec l’imagerie de cellules vivantes, alors que la limitation majeure est leur résolution diffraction-limited, structures de sens ou complexes de protéines inférieures à 200-250 nm ne peut pas être résolus. Avec le développement théorique et pratique de Super-résolution déterministe (par exemple, émission stimulée appauvrissement microscopie STED1, structuré microscopie d’illumination (SIM2) ou stochastique Super-résolution (par exemple , appauvrissement de microscopie (PALM3), ou état fondamental localisation photoactivation (GSD4,,5)), la résolution latérale et axiale en microscopie de fluorescence a été étendue au-delà de la barrière de la diffraction, à l’ordre de dizaines de nanomètres. Ainsi, les enquêteurs ont maintenant la capacité inégalée de visualiser et de comprendre comment les organisation et dynamique des protéines se traduit en fonction au niveau moléculaire près.
État fondamental microscopie appauvrissement suivie de chaque molécule de retour (GSDIM), ou simplement de GSD comme on le sait, contourne la limite de diffraction en réduisant le nombre d’émettre simultanément des fluorophores4,5. Lumière laser de haute énergie est utilisée pour exciter l’échantillon marqué au fluorophore, bombardement d’électrons avec des photons et augmentation de la probabilité, ils subissent un « renversement de spin » et entrez le triplet ou « dark-état » de l' état excité4. Cela épuise efficacement l’état fondamental, d'où le nom « au sol appauvrissement de l’Etat ». Dans l’état de triplet, fluorophores n’émettent pas de photons et l’échantillon apparaît gradateur. Toutefois, ces fluorophores stochastique retournent à l’état fondamental et peut passer par plusieurs photons émettant des transitions d’état excité-sol avant de retourner à l’état de triplet. Avec moins générant des fluorophores à un moment donné, éclats de photon émis par fluorophores individuelles devenus distincts dans le temps et l’espace des voisins des fluorophores. L’éclatement des photons peut être adapté avec une fonction gaussienne, le centre de gravité calculé qui correspond à la position du fluorophore avec une précision de localisation qui est tributaire de l’ouverture numérique (NA) de la lentille, la longueur d’onde de la lumière utilisée pour excitation et surtout, le nombre de photons émis par un fluorophore. Une des limitations de GSD est que, étant donné que seul un sous-ensemble des fluorophores émet activement à tout moment, des milliers d’images doivent être prélevés sur plusieurs minutes à mettre en place une carte de localisation complète. Le temps d’acquisition longue combiné à l’exigence de puissance laser haute, signifie que GSD est mieux adaptée pour fixe plutôt que des échantillons vivants.
Cet article décrit la préparation d’échantillons fixes pour l’imagerie microscopie Super-résolution de membrane et le réticulum endoplasmique (re)-protéines résidentes (pour une liste des consommables et réactifs pour voir la Table des matières). Exemples de comment ce protocole peut être facilement adapté pour quantifier la taille et le degré de regroupement de voltage-dépendants Ca2 + canaux de type L (Cav1.2) dans le sarcolemme des myocytes cardiaques, ou utilisé pour visualiser la distribution cellulaire de l’ER, sont illustrés. Comprendre la répartition et l’organisation de ces composants cellulaires est extrêmement important dans la compréhension de l’initiation, la traduction et en fin de compte la fonction de nombreux Ca2 +-dépendantes cascades de signalisation. Par exemple, Cav1.2 canaux sont fondamentalement important pour couplage excitation contraction, tandis que libération2 + Ca médiée par les récepteurs de l’ER est peut-être la cascade de signalisation plus omniprésente dans les cellules de mammifères.

<table><tbody><tr><td>KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P250-500</td><td>Pour nettoyer le verre</td></tr> <tr><td>de protection#1.5 18 x 18 mm</td><td>Marienfeld Superior</td><td>0107032)</td><td>Pour cultiver/traiter/imager des cellules</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP3994</td><td>Diluer à 1x avec de l’eau désionisée</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>Aide à l’adhérence des cellules pour couvrir la</td></tr><tr><td>laminine</td> <td>de verreSigma</td><td>114956-81-9</td><td>Aide à l’adhérence cellulaire au verre de couverture</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150-059</td><td>Milieu de culture de myocytes ventriculaires</td></tr><tr><td>DMEM 11995</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437028</td><td>Supplément de milieu</td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Milieu supplément</td></tr><tr><td>0,05 % trypsine-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td>Solution de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Réactif de transfection transitoire</td></tr><tr><td>PBS sans Ca2+</td><td>Gibco</td><td>1419-144</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>100 % méthanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A414-4</td><td>Fixation cellulaire</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Cell Fixation</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBR6504V</td><td>Cell Fixation</td></tr><tr><td>SEAblock Thermo</td><td>Scientific</td><td>37527</td><td>BSA ou d’autres solutions de blocage alternatives existent</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Détergent pour perméabiliser les cellules</td></tr><tr><td>Rabbit anti-CaV1.2 (FP1)</td><td>Gift</td><td>N/A</td><td>Il existe des anticorps anti-CaV1.2 commerciaux tels que Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)</td></tr><tr><td>Souris monoclonal anti-RFP</td><td>Rockland Inc.</td><td>200-301-379</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donket anti-lapin IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A31573</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 chèvre anti-souris IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A11031</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Empêche la croissance microbienne pour le stockage à long terme des échantillons</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td>Ingrédient tampon de photocommutation</td></tr><tr><td>Glucose oxydase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Ingrédient tampon de photocommutation</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Ingrédient tampon de photocommutation</td></tr><tr><td>bêta-chlorhydrate de mercaptoéthylamine</td><td>Fisher</td><td>BP2664100</td> Fisher Ingrédient tampon de <td>photocommutation</td></tr><tr><td>&bêta ;-mercaptoéthanol</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td>Ingrédient du tampon de photocommutation</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td>Ingrédient du tampon de photocommutation</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D14-212</td><td>Ingrédient du tampon de photocommutation</td></tr><tr><td>Lames de dépression en verre</td><td>Neolab</td><td>1 &ndash ; 6293</td><td>Pour monter des échantillons</td></tr><tr><td>Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>Pour sceller le verre</td></tr><tr><td>de protection sec61&beta ;- Plasmide mCherry</td><td>Addgene</td><td>49155</td><td></td></tr><tr><td>Leica SR GSD Microscope 3D</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de bloc</td><td></td><td></td> de lavage <td>20 % SEAblock dans PBS</td></tr><tr><td>Solution d’incubation</td><td></td><td></td> d’anticorps primaires <td>0,5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, dans PBS</td></tr><tr><td>Solution d’incubation d’anticorps secondaires</td><td></td><td></td><td>1:1000 en PBS</td></tr></tbody></table>

État fondamental l’appauvrissement super-résolution imagerie dans les cellules de mammifères

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Avances en fluorescente microscopie et biologie cellulaire sont intimement corrélées, avec la meilleure possibilité de visualiser les événements cellulaires qui conduit souvent à des sauts spectaculaires dans notre compréhension de la façon dont les cellules fonction. Le développement et la disponibilité de microscopie de Super-résolution a considérablement étendu les limites de la résolution optique de ~ 250-20 nm. Les biologistes ne sont plus limités à décrire des interactions moléculaires en termes de colocalisation dans une zone de diffraction limitée, plutôt il est maintenant possible de visualiser les interactions dynamiques des molécules individuelles. Ici, nous exposons un protocole pour la visualisation et la quantification des protéines cellulaires par microscopie appauvrissement fondamental pour l’imagerie cellulaire fixe. Nous fournissons des exemples tirés de deux protéines membranaires différents, un élément de la translocon réticulum endoplasmique, sec61β et un membrane plasmique localisée voltage-dépendant type L2 + canal Ca (CaV1.2). Discutés sont les paramètres spécifiques de microscope, méthodes de fixation, photo-commutation formulation de tampon et pièges et défis du traitement de l’image.

Comme indiqué dans l’introduction, il y a nombreux microscopie de Super-résolution différentes modalités d’imagerie. Ce protocole, met l’accent sur l’imagerie de Super-résolution GSD. Images représentatives et des cartes de localisation sont indiquées dans la Figure 2 et Figure 3.
La figure 2 montre une cellule COS-7 transfectée avec le ER ...

Cet article décrit un protocole pour la détection d’un ou plusieurs plasma et/ou des protéines de la membrane intracellulaire Super-résolution par appauvrissement de l’état fondamental (GSD) microscopie en cellules mammifères. Ici, nous discutons des avantages et des considérations d’utiliser ces approches pour la visualisation et la quantification des protéines cellulaires.

État fondamental l’appauvrissement Super-résolution imagerie dans les cellules de mammifères

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

L'objectif général de cette technique d'imagerie fluorescente est de visualiser et de quantifier des protéines cellulaires dans des cellules fixées avec une résolution subdiffractionnelle, en utilisant une forme de microscopie de super-résolution appelée microscopie par épuisement de l'état fondamental et retour de molécules individuelles. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire et de la biophysique membranaire, car elle contourne la limite de résolution imposée par la diffraction, ce qui aide les chercheurs à définir, visualiser et quantifier plus précisément la distribution des protéines cellulaires. Le principal avantage de ce protocole est qu'il permet d'acquérir des images avec une amélioration de la résolution d'environ dix fois par rapport aux approches classiques d'imagerie par microscopie de fluorescence, telles que la microscopie confocale.Le déroulement de la procédure sera assuré par Oscar Vivas, post-doctorant dans mon laboratoire, et Karen Hannigan, post-doctorante dans le laboratoire de Rose Dixon. Commencez par préparer les lamelles et les cellules comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Ensuite, f

ground-state-depletion-super-resolution-imaging-in-mammalian-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous décrivons une méthode de super-résolution d'imagerie pour sonder l'organisation structurelle de la FtsZ torique bactérienne, un appareil essentiel pour la division cellulaire. Cette méthode est basée sur des analyses quantitatives de photoactivées localisation de microscopie (PALM) images et peut être appliquée à d'autres protéines du cytosquelette bactérien.

Super-resolution Imaging Division de la machinerie bactérienne

Les informations spatio-temporelles sur les protéines dynamiques à l’intérieur des cellules vivantes sont cruciales pour comprendre la biologie. Un type de microscopie à super-résolution appelé microscopie à illumination rapide structurée en 3D (f3D-SIM) révèle des informations uniques sur l’anneau cytocinétique Z chez les bactéries : à la fois son apparence en forme de perle et la dynamique rapide de FtsZ à l’intérieur de l’anneau.

Super-résolution d&#39;imagerie de l&#39;Anneau Z cytokinétique en utilisant des bactéries vivantes 3D structuré rapide Illumination Microscopy (F3d-SIM)

Nous décrivons ici une combinaison de la technique de bicouche lipidique soutenue par du verre pour former des synapses immunologiques avec la technique d’imagerie à super-résolution de la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). L’objectif de ce protocole est de fournir aux utilisateurs les instructions nécessaires pour mener à bien ces deux techniques.

Super-résolution de l&#39;imagerie cellulaire Synapse immunologique Natural Killer sur un verre soutenu par Planar lipidique en deux couches

PI (4,5) P2 régule diverses fonctions cellulaires, mais son organisation à l' échelle nanométrique dans la membrane plasmique de la cellule est mal comprise. Par étiquetage PI (4,5) P 2 avec une sonde fluorescente à double couleur fusionnée au domaine Pleckstrin Homology, nous décrivons une nouvelle approche pour étudier la PI (4,5) P2 distribution spatiale dans la membrane plasmatique à l'échelle du nanomètre .

Simple-molécule Super-résolution Imaging de phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans la membrane plasmique avec nouveaux Fluorescent Probes

Les conjugués conventionnels de BODIPY peuvent être employés pour la microscopie de localisation à cellule unique vivante (SMLM) par l’exploitation de leurs dimers terrestres de formation transitoire et à miettes rouges. Nous présentons un protocole SMLM optimisé pour suivre et résoudre les lipides neutres subcellulaires et les acides gras dans les cellules vivantes de mammifères et de levure à l’échelle de longueur nanoscopique.

Conjugués de BODIPY conventionnels pour la microscopie à super-résolution à cellules vives et le suivi à molécule unique

Présenté ici est un protocole pour l’imagerie de cellules vivantes de super-résolution dans le tissu intact. Nous avons normalisé les conditions d’imagerie d’une population de cellules souches adultes très sensibles dans son environnement tissulaire natif. Cette technique consiste à équilibrer la résolution temporelle et spatiale pour permettre l’observation directe des phénomènes biologiques dans les tissus vivants.

Imagerie de cellules vivantes à super-résolution de structures subcellulaires

La membrane basale est essentielle à la morphogenèse des tissus et des organes pendant le développement. Pour mieux comprendre les mécanismes conduisant à un placement correct de cette structure, le protocole présenté décrit des méthodes pour visualiser et caractériser le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines de la membrane basale dans les cellules épithéliales en utilisant la microscopie confocale et super-résolution.

Imagerie confocale et super-résolution du trafic intracellulaire polarisé et de la sécrétion de protéines de la membrane basale au cours de l’oogenèse de la drosophile

La microscopie à super-résolution peut fournir un aperçu détaillé de l’organisation des composants au sein du complexe synaptonémique dans la méiose. Ici, nous démontrons un protocole pour résoudre les protéines individuelles du complexe synaptonemal Caenorhabditis elegans .

Microscopie à super-résolution du complexe synaptonémique dans la lignée germinale de Caenorhabditis elegans

Ce protocole décrit la procédure pour réaliser la microscopie de localisation profonde à cellule entière à molécule unique (SMLM) à l’aide d’un microscope confocal à disque tournant avec réassignation optique de photons, permettant ainsi l’imagerie DNA-PAINT sans besoin d’optiques personnalisées ou d’illuminations complexes.

Imagerie super-résolution de cellules entières via DNA-PAINT sur un disque tournant confocal avec réaffectation optique des photons

Ce protocole détaille les applications avancées d’imagerie et la gestion des ressources partagées d’un système de microscope confocal à balayage laser intégré à un détecteur à réseau multiplexé pour l’imagerie cellulaire et subcellulaire à haute résolution. Ce flux de travail permet l’imagerie multimodale de la confocale à la super-résolution (~120 nm) sur une seule plateforme, rendant la visualisation à l’échelle nanométrique plus accessible.

Imagerie à super-résolution et gestion partagée : un protocole pour la microscopie confocale avec détection multiplex

Découvrez la microscopie GSD pour visualiser et quantifier les protéines membranaires dans les cellules de mammifères avec une résolution supérieure à la limite de diffraction. Cette méthode offre une amélioration dix fois supérieure aux techniques conventionnelles.

État fondamental l’appauvrissement Super-résolution imagerie dans les cellules de mammifères

Explorer plus de vidéos