Préparation des échantillons pour l’analyse de Endopeptidomic dans le liquide céphalorachidien humaine
4 décembre 2017
On présente une méthode d’analyse par spectrométrie de masse de peptides endogènes dans le liquide céphalorachidien (LCR) humain. En utilisant la filtration de limite de poids moléculaire, fractionnement chromatographique de pré, analyse par spectrométrie de masse et une combinaison subséquente des stratégies d’identification de peptide, il était possible d’étendre la peptidome CSF connu presque décuplé par rapport à des études antérieures.
L’objectif de ce protocole est de préparer et d’analyser des échantillons de liquide céphalo-rachidien humain pour l’analyse LC-MS des peptides endogènes. Une étape de pré-fractionnement des peptides avant la LC-MS augmente le nombre de peptides identifiés et permet de détecter des peptides de LCR en assez faible abondance. Les peptides endogènes du LCR sont des molécules de calcium qui n’ont pas été explorées de manière approfondie et qui pourraient potentiellement inclure de nouveaux biomarqueurs importants de troubles neurodégénératifs. Cette méthode permet une caractérisation extensive du peptidome du LCR par spectrométrie de masse. Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle permet l’injection de peptides de LCR de faible abondance et qu’elle est compatible avec les techniques de marquage isobare multiplex, ce qui la rend applicable aux études cliniques. Jusqu’à présent, nous avons principalement appliqué cette méthode à l’analyse du liquide céphalo-rachidien. Mais nous disposons de données préliminaires indiquant qu’avec des modifications mineures, il peut également être utilisé pour l’analyse d’échantillons de plasma et de tissus. Commencez par décongeler 1,5 millilitre d’aliquotes de LCR à température ambiante sur un mélangeur à rouleaux. Une fois décongelé, transférez le contenu dans des tubes en polypropylène de 10 millilitres. Et ajoutez 80 microlitres d’une molaire TAB comme agent tampon. Ajoutez ensuite 0,65 millilitre d’un chlorhydrate de guanidinium à huit molaires pour dissoudre les agrégats de protéines et agitez doucement à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, à 60 microlitres de 200 millimolaires de PTCE aqueux, et incuber à 55
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Aperçu
Cette étude présente une méthode d'analyse par spectrométrie de masse de peptides endogènes présents dans le liquide céphalorachidien humain (CSF). En utilisant une filtration basée sur la coupure de poids moléculaire, une pré-fractionnement chromatographique et une analyse par spectrométrie de masse, la recherche élargit considérablement le peptidome du CSF connu, améliorant ainsi l'identification de peptides peu abondants qui pourraient servir de biomarqueurs pour les troubles neurodégénératifs.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Spectrométrie de masse
- Découverte de biomarqueurs
Contexte
- Les peptides endogènes dans le LCR pourraient être importants pour l'identification des troubles neurodégénératifs.
- Les peptides du LCR présents en faible abondance n'ont pas été largement étudiés.
- Les méthodes existantes ont fourni des données limitées sur le peptidome du LCR.
Objectif de l'étude
- Améliorer l'identification et la caractérisation des peptides endogènes dans le liquide céphalorachidien humain.
- Fournir une vue plus complète du peptidome du LCS.
- Explorer le potentiel de nouveaux biomarqueurs dans les affections neurodégénératives.
Méthodes utilisées
- Spectrométrie de masse avec préfractionnement des échantillons de LCS.
- Implique la décongélation et le traitement d'aliqotes de 1,5 millilitre de LCS avec des réactifs spécifiques.
- Compatible avec les techniques de marquage isobariques multiplexées.
- Peut être adaptée à l'analyse d'échantillons de plasma et de tissus avec de légères modifications.
Résultats principaux
- La méthode permet la détection d'un nombre significativement plus élevé de peptides par rapport aux études antérieures.
- Les résultats clés indiquent la présence de peptides à faible abondance auparavant inexplorés.
- Offre des perspectives qui pourraient conduire à la découverte de nouveaux biomarqueurs.
Conclusions
- La présente étude démontre une approche efficace pour caractériser le peptidome du LCS.
- La polyvalence de la méthode ouvre des perspectives pour des études cliniques sur les troubles neurodégénératifs.
- Des implications potentielles pour la compréhension des mécanismes neuronaux et l'identification de marqueurs de maladies.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
Cette méthode améliore la détection de peptides endogènes peu abondants dans le liquide céphalorachidien humain, un biofluide clé pour la découverte de biomarqueurs de maladies neurodégénératives. En réduisant la complexité protéique par fractionnement selon la masse moléculaire (MWCO) et en améliorant la couverture peptidique grâce à une préfractionnation par HPLC en phase inverse à haut pH, elle augmente la sensibilité analytique pour les efforts de validation ciblée. L'approche permet une dé-risquisation mécanistique en permettant un profilage plus approfondi du peptidome, ce qui peut guider la confiance précoce dans la cible et le choix de biomarqueurs prédictifs dans les programmes de découverte de médicaments pour le système nerveux central.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation de populations endogènes de peptides reflétant les processus physiopathologiques du système nerveux central, soutenant ainsi la vérification d'hypothèses ciblées.
- Valeur opérationnelle : Réduit l'interférence de la dynamique de concentration provoquée par les protéines abondantes du LCR, améliorant ainsi la détection de peptides signalétiques à faible concentration, pertinents pour la modulation des voies biologiques.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des profils de fractionnement peptidique reproductibles, permettant des lectures LC-MS/MS cohérentes pour la standardisation des dosages.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec le marquage isobare multiplex, permettant une analyse comparative du peptidome entre cohortes malades et témoins dans les protocoles de criblage de biomarqueurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Facilite la découverte de biomarqueurs en identifiant des peptides dérivés du LCS qui pourraient être corrélés aux mécanismes des maladies neurodégénératives.
- Valeur opérationnelle : Adaptable aux échantillons de plasma et de tissus avec de légères modifications, ce qui permet une validation croisée des échantillons dans les voies de recherche translationnelle.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, en soutenant l'exploration hypothético-déductive du peptidome avant les étapes d'identification des candidats médicaments et de validation préclinique.
- Biologie de la découverte : Permet le profilage sans a priori des peptides endogènes afin de clarifier les voies associées aux maladies et de réduire les risques liés à la sélection des cibles.
- Écrantage : Permet une détection fiable des peptides grâce à une réduction de la complexité de l'échantillon et à une amélioration de la séparation chromatographique.
- Analytique : Génère des données quantitatives sur les peptides, résolues par fractionnement, compatibles avec le multiplexage basé sur des marqueurs pour des études comparatives.
- Recherche translationnelle : Fournit une base pour l'alignement des biomarqueurs en reliant les modifications du peptidome du liquide céphalorachidien aux processus neurodégénératifs.
- Réutilisation en milieu professionnel : Le flux de travail principal — filtration par coupure moléculaire (MWCO), fractionnement à pH élevé et LC-MS — peut être standardisé entre laboratoires pour une analyse reproductible du peptidome.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente le rendement d'identification des peptides et permet la détection d'espèces peu abondantes qui pourraient servir d'indicateurs mécanistiques ou d'état pathologique.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à une pré-fractionnement standardisé et réduit la variabilité technique dans l'analyse de biofluides complexes.
- Valeur stratégique : Renforce la confiance dans les décisions lors de la validation des cibles en élargissant l'espace biologique observable dans le LCR.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation des biomarqueurs ajustée au risque grâce à une couverture plus étendue du peptidome et à une détection de signal améliorée.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Des compétences en manipulation du LCR, en inhibition des protéases et en peptidomique basée sur la spectrométrie de masse sont requises.
- Les équipements doivent inclure des systèmes LC-MS/MS compatibles avec la fractionnation en phase haute pH et dotés d'une détection sensible des peptides.
- La standardisation entre sites exige une sélection cohérente des filtres selon le seuil de coupure en masse moléculaire (MWCO), une concaténation uniforme des fractions et des paramètres d'identification basés sur des logiciels stables.
- L'adaptation au plasma ou aux tissus nécessite l'optimisation des conditions de lyse, d'épuisement et de fractionnement afin de tenir compte de la complexité variable de la matrice.
- Les limites pratiques incluent une perte potentielle de peptides lors de la filtration ainsi que la nécessité d'un contrôle rigoureux des contaminations en raison de l'analyse de cibles peu abondantes.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Title
1:12
Pre-treatment of Bulk Volume CSF without Quantification
2:24
Pre-treatment of Small Volume CSF Samples with Isobaric Labeling
4:00
MWCO Filtration, Desalting, and Sample Clean-up by Solid Phase Extraction
6:00
Offline High-pH Reverse Phase HPLC Sample Fractionation
7:09
LC-MS Analysis
7:47
Results: Peptide Identification After LC-MS Analysis
9:13
Conclusion
