Name: Préparation des échantillons pour l’analyse de Endopeptidomic dans le liquide céphalorachidien humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse peptidomique du liquide céphalorachidien humain par spectrométrie de masse avec préfractionnement chromatographique. Cette approche permet d'identifier des peptides peu abondants et de découvrir de nouveaux biomarqueurs pour les maladies neurodégénératives.

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Un grand Merci Tanveer Batth et ses collègues pour obtenir des conseils à mettre en place la méthode de fractionnement préalable.
Ce travail a été financé par le Conseil de recherche suédois, le Wallström et Sjöblom Foundation, le pistolet et Bertil Stohne Fondation Stiftelse, la Fondation de Bergwall Magnus, la Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut et Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen et FoU-Västra Götalandsregionen.
Les principaux bénéficiaires du financement de ce projet ont été Kaj Blennow, Henrik Zetterberg et Johan Gobom.

Le protocole décrit ci-dessous est une version améliorée de celle utilisée dans une étude antérieure où une grande quantité de peptides endogènes ont été identifiés en humain CSF15. Mises à jour de l’original du protocole impliquent des modifications mineures au prétraitement chimique du FSC ainsi qu’optimisation du dégradé utilisé à être fractionné avant RP HPLC pH élevé en mode hors connexion.
Considérations éthiques
Toutes les études du suédois patient et contrôle des matériaux ont été approuvés par les comités d’éthique : Göran St. (Réf. 2005-554-31/3). Échantillons de LCR de la cohorte de démence d’Amsterdam et des échantillons prélevés à l’hôpital National de neurologie et de neurochirurgie, de Londres ont été utilisés pour la recherche avec l’accord écrit de tous les patients participants et l’approbation des comités régionaux d’éthique. Le matériel utilisé ici principalement composé de restes de LCR d’échantillons prélevés aux fins de diagnostic et il était dépersonnalisée avant étant inclus dans nos études. Il n’y a aucune possibilité de remonter l’échantillon à tout donateur individuel ou un groupe de bailleurs de fonds.
1. extraction des humains le liquide céphalorachidien (LCR) :
<ol><li>Extraire des CSF par ponction lombaire (qui doit être effectuée par un médecin dûment formé) en utilisant un protocole normalisé22.</li>
	<li>Éliminer les débris cellulaires et autres matériaux non soluble par centrifugation à 2 500 g pendant 20 min.</li>
	<li>Inspecter visuellement la LCR pour la décoloration, ce qui peut indiquer la contamination de sang résultant de la ponction des saignements. La concentration de protéine significativement plus élevée dans le sang et la présence de protéases peut considérablement affecter les résultats des analyses.</li>
</ol>2. prétraitement de CSF (1,5 mL Volume d’échantillon, aucune Quantification) :
<ol><li>Décongeler les 1,5 mL d’aliquotes de la CSF à température ambiante (RT), transvaser son contenu dans les tubes en polypropylène 10 mL et ajouter 80 µL de 1 M bicarbonate de triéthylammonium (TEAB) comme un agent tampon.</li>
	<li>Ajouter le chlorhydrate de guanidine 0,65 mL 8 M (GdnHCl) (concentration active GdnHCl : 2,4 M) et vortex doucement à la droite pendant 10 min. Remarque : L’agent chaotropique, GdnHCl, affecte la viscosité du solvant et interagit avec la chaîne de polypeptide, qui se traduit par la protéine déroulement étant énergétiquement favorables23. Ainsi, GdnHCl dissout les agrégats de protéines et augmente la récupération de peptides endogènes lors de la filtration subséquente.</li>
	<li>Ajouter 60 µL de 200 mM de l’humeur aqueuse tris(2-carboxyethyl) chlorhydrate de phosphine (TCEP) (concentration active PTCE : 6 mM) et incuber à 55 ° C pendant 1 h afin de réduire les disulfures de cystéine.</li>
	<li>Ajouter 35 µL de 400 mM iodoacétamide (IAA) (concentration active IAA : 4 mM) et incuber à RT dans l’obscurité pendant 30 min à alkylat cystéines. L’ajout d’un groupement alkyle veille à ce que les résidus de cystéine ne peuvent pas constituer spontanément nouveaux ponts disulfure à tout moment lors de la préparation de l’échantillon suivant.</li>
	<li>Ajouter 3,25 mL d’eau désionisée et vortexer brièvement pour diluer l’échantillon avant la filtration MWCO, résultant en un volume de l’échantillon total de 5,5 mL. Cette étape sert à diluer GdnHCl à moins de 1 M car une concentration plus élevée a été observée parfois causer la lixiviation des substances polymériques par les appareils de filtre.</li>
</ol>3. prétraitement de CSF (Volume 10 x 150 µL de l’échantillon, étiquetage-quantification isobare) :
<ol><li>Décongeler 150 µL d’aliquotes de CSF de 10 individus au RT et ensuite transférer le contenu à tubes à centrifuger de micro faible liaison individuelle 1,5 mL et ajouter 8 µL de 1 M TEAB comme agent de mise en mémoire tampon.</li>
	<li>Ajouter 65 µL de 8 M GdnHCl (concentration active GdnHCl : 2,4 M) et vortex doucement à la droite pendant 10 min.</li>
	<li>Ajouter 6 µL de 200 mM de PTCE aqueux (concentration active PTCE : 6 mM) et une incubation à 55 ° C pendant 1 h afin de réduire les disulfures de cystéine.</li>
	<li>Ajouter 3,5 µL 400 mM aqueuse IAA (concentration active IAA : 6 mM) et incuber à RT et l’obscurité pendant 30 min à alkylat cystéines.</li>
	<li>Préparer le kit d’étiquetage isobare (e.g., balise de masse Tandem 10plex isobare réactif). Permettre l’isobares étiquetage-flacons rejoindre RT avant de les ouvrir pour éviter hydratation réactif inutiles, ajouter 41 µL de qualité HPLC acétonitrile (AcN) et dissoudre par agitation douce pendant 5 min.</li>
	<li>Transférer 30 µL de solution d’étiquetage-réactif isobare vers l’exemple correspondant et incuber pendant 1 heure à ta sous agitation modérée. L’isobare réactif inclut un groupe de NHS-ester qui réagit avec les amines primaires présents au peptide N-termini ainsi qu’avec les résidus de Lysine.</li>
	<li>Ajouter 8 µL de l’hydroxylamine 5 % (hydroxylamine concentration active : 0,16 %) et l’agiter doucement à RT pendant 20 min pour étancher la réaction d’étiquetage. Puisque les échantillons marqués séparément doivent être combinées, veiller à ce que la réaction d’étiquetage est piégée. Par addition d’une abondance de groupes amine sous la forme de l’hydroxylamine, l’isobare reste réactif réagit et est ainsi rendu inerte.</li>
	<li>Combiner le contenu de chacun des 10 échantillons étiquetés individuellement dans un tube unique de 15 mL en polypropylène.</li>
	<li>Ajouter 6,4 mL d’eau déminéralisée à l’échantillon combiné et vortexer brièvement pour réduire la concentration d’AcN de 12 % à 3 % et à la concentration de GdnHCl GdnHCl à moins de 1 M car une concentration plus élevée a été observée parfois causer la lixiviation des substances polymériques les dispositifs de filtre.</li>
</ol>4. poids moléculaire limite Filtration
<ol><li>Afin d’éliminer le potentiel contaminants, condition le MWCO filtres en chargeant les 10 mL de solution aqueuse 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB et centrifugation pendant 15 minutes à 2 500 x g et RT, jetez le cheminement (FT).</li>
	<li>Chargez le volume de l’ensemble de l’échantillon sur le filtre (5 mL non étiquetés CSF (étape 2.5) ou 10 mL isobare marqué CSF (étape 3,9)) et centrifuger pendant 30 min à 2 500 x g et RT, le cheminement (FT) dans le récipient de collecte. Le résultat de la filtration, c’est que les petites protéines et peptides soient séparés des protéines et résidus de débris cellulaires. Cette étape peut être considérée comme l’équivalent à l’utilisation de la digestion protéolytique des protéines peptidomic pour générer des peptides dans les expériences de la protéomique.</li>
	<li>Charger 5 mL de 25 mM TEAB (aqueuse) sur les filtres et la centrifugeuse à 2 500 x g pendant 15 minutes et RT, afin d’augmenter la récupération des peptides.</li>
	<li>Vortex les FTs combinées des deux étapes précédentes (total 10 mL de non étiquetés ou 15 mL de l’échantillon marqué isobare) et passez à l’acidification de l’échantillon.</li>
</ol>5. le salage et l’échantillon nettoyage par Extraction en Phase solide
<ol><li>Acidifier l’échantillon filtré de l’étape 4.4 avant extraction en phase solide (SPE). L’acidification est effectuée afin d’améliorer l’interaction du soluté (peptide) avec la phase stationnaire de la SPE-cartouche.</li>
	<li>Pour l’échantillon non marquée (volume 10 mL) : Ajouter 550 µL de 1 % d’acide trifluoroacétique (TFA) - volume total de l’échantillon : 10,55 mL avec 0.05 % TFA.</li>
	<li>Pour l’échantillon marqué isobare (volume 15 mL) : ajouter 20 mL 0,1 % TFA pour acidifier et descendre AcN concentration de 3 % à 1 % - volume total de l’échantillon : 30 mL avec 0,066 % TFA. NOTE : TFA est également ajouté à sa fonction comme un réactif de paires d’ions, qui améliore la rétention des peptides pas eux-mêmes susceptibles d’interaction hydrophobe suffisamment forte avec le matériel d’emballage de la cartouche SPE à conserver.</li>
	<li>Si pH > 3, titrer l’échantillon à 20 % d’acide phosphorique, jusqu'à ce que le pH de l’échantillon est < 3.</li>
	<li>Conditionner les cartouches SPE par addition de 1 mL de 84 % AcN, 0,1 % d’acide formique (FA) et jeter les pieds répètent une seule fois. Conditionnement de la cartouche filtrante est nécessaire pour retirer les substances indésirables qui seraient autrement éluer avec les peptides dans les étapes suivantes ; en outre, conditionnement augmente la perméabilité du filtre.</li>
	<li>Equilibrez la cartouche SPE par addition de 1 mL de 0.1 % TFA, jeter FT. répéter une fois. S’assurer que le filtre ne fonctionne pas sèche après la dernière étape de l’équilibration - garder un petit volume sur le dessus du filtre. L’équilibration de la cartouche filtrante est effectuée afin de préparer le filtre pour retenir les peptides en enlevant la substance hydrophobe (acétonitrile) à gauche de l’étape du conditionnement.</li>
	<li>Chargez le volume de l’ensemble de l’échantillon (10,55 mL pour les échantillons non étiquetés ou 30 mL pour échantillons marqués isobare), dans plusieurs portions si nécessaire et laissez le FT en déchets. Veiller à ce que la cartouche ne pas fonctionner à sec entre les cycles de chargement et après que le dernier volume de l’échantillon a été chargé - garder un petit volume sur le dessus du filtre.</li>
	<li>Passer de 1 mL de 0.1 % TFA sur les filtres pour enlever les sels et les réactifs et jeter la répétition de pi une fois. S’assurer que la cartouche ne fonctionne pas sèche après chaque lavage - garder un petit volume de liquide sur le dessus de la cartouche.</li>
	<li>1.5 de la place du micro liaison faible mL centrifuger les tubes sous la cartouche et éluer l’échantillon en passant de 1 mL de 84 % AcN, 0,1 % FA sur la cartouche.</li>
	<li>Éliminer les solvants de l’échantillon hors salée par évaporation dans une centrifugeuse vide sans chauffage actif jusqu’au sec, conserver à-80 ° C ou procéder immédiatement à pH élevé fractionnement entrer.</li>
</ol>6. hors ligne pH élevé Reverse Phase HPLC échantillon fractionnement
<ol><li>
Préparer les phases mobiles aqueuse pH élevé (HpH) : HpH tampon A: Eau Pure HpH tampon b : 84 % AcN HpH tampon C: 25 mM NH4OH Tampon de chargement HpH : 2,5 mM NH4OH, 2 % AcN Remarque : Tampon de charge HpH est utilisée comme tampon solution et échantillon de transport</li>
	<li>Dissoudre à nouveau l’échantillon dans 16 µL de tampon HpH chargement par une agitation modérée pendant 20 min</li>
	<li>Charger 15 µL de l’échantillon sur un système HPLC avec un collecteur de fraction interne pour plaques 96 puits-profonds configuré selon mohamed al. 20 avec des modifications mineures. Fractionner un débit de 100 µL/min sur une colonne de séparation stable à pH (C18 3,5 µm, 2,1 x 250 mm) et de recueillir une fraction / min sur un gradient linéaire de 60 min.</li>
	<li>Utiliser les temps-points de dégradé suivants : t = 0 min, B = 1 %, C = 10 % ; t = 4 min, B = 1 %, C = 10 %, collection de fraction de départ ; t = 76 min, B = 70 %, C = 10 % ; collection de fraction de fin ; t = 76,5 min, B = 85 %, C = 10 % ; t = 80 min, B = 85 %, C = 10 % ; t = 80,5 min, B = 1 %, C = 10 % et t = 90 min, B = 1 %, C = 10 %.</li>
	<li>Recueillir des fractions répétitivement dans 12 puits dans un motif circulaire ainsi concaténer fractions espacées de 12 min, entraînant 12 fractions, chacun contenant 6 sous-fractions concaténées.</li>
	<li>Enlever le solvant provenant d’échantillons par centrifugation sous vide à RT et 3000 tr/min à sec et stocker les échantillons à-80 ° C avant l’analyse de LC-MS.</li>
</ol>7. LC-MS
<ol><li>
Préparer les phases aqueuses de mobiles : Mémoire tampon A: 0,1 % FA Mémoire tampon b : 0,1 % FA, 84 % AcN Tampon de charge : 0.05 % TFA, 2 % AcN Remarque : Chargement mémoire tampon est utilisé comme solution de transport, de tampon et de phase mobile pour la pompe de chargement.</li>
	<li>Chacun des 12 fractions dissoudre à nouveau par l’addition de 6 µL de tampon de chargement et en agitant à ta pendant 20 min</li>
	<li>Échantillon de charge 5 µL sur un nano-débit HPLC, opérant dans la configuration de piège colonne (colonne de piège : 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å taille de pore, de granulométrie de 3 µm ; colonne de séparation : C18, 75 µm x 500 mm, 100 Å taille des pores, de granulométrie de 2 µm et d’effectuer la séparation de peptide à un débit de 150 nL/min en utilisant le gradient suivant : t = 0 min, B = 2 % ; t = 10 min, B = 2 % ; t = 11 min, B = 7 % ; t = 100 min, B = 26 % ; t = 170 min, B = 45 % ; t = 175 min, B = 80 % ; t = 181 min, B = 2 % et t = 210 min, B = 2 %.</li>
	<li>
Effectuer MS sur le spectromètre de masse haute résolution hybride relié à l’HPLC via une interface de nano-ESI. Enregistrer les spectres complets en MS mode à un paramètre de résolution de 120 000 (cible AGC 2.0e5) sur la plage de m/z 350-1 400.
	<ol>
<li>Exploiter le spectromètre de masse en mode d’acquisition dépendant des données, sélectionnez les spectres MS/MS dans les haut de la page dix pics plus intenses avec m/z > 150 et au sein de la gamme intensité 1.0e4-1.0e5 pour l’analyse des ions fragments. Isoler les ions précurseurs à l’aide d’une fenêtre d’isolement quadripolaire de 1 m/z, le temps d’injection maximal de 100 ms et l’objectif de RF à 60 %.</li>
		<li>Appliquer une exclusion dynamique avec un délai d’exclusion de 15 s, avec une tolérance de m/z de ±10 ppm. Effectuer la fragmentation dans la cellule de dissociation (HCD) d’énergie plus élevée collision et enregistre les acquisitions SM/SM dans l’Orbitrap valant à un paramètre de résolution de 50 000 (valeur de cible AGC 5.0e4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. peptide Identification
<ol><li>
Pour l’identification de peptide soumettre les .raw-fichiers résultants de l’analyse par spectrométrie de masse à un moteur de recherche protéomique appliquant les paramètres suivants : Remarque : Dans notre précédente étude15, trois moteurs de recherche ; Mascotte v2.4 Sequest HT et pics v7.5 servaient en parallèle et les paramètres spécifiés ici travaillaient tous les trois moteurs de recherche, sauf indication contraire. La majorité des paramètres réglables est universelle pour l’identification des peptides/protéines et devrait avoir les paramètres correspondants dans n’importe quel moteur de recherche donné. Sélecteur de spectre : Précurseurs des min. masse : 350 Da Max. précurseur de masse : 5 000 Da Scan type : complet Seuil de signal/bruit : 1,5 Recherche de base de données de séquence Base de données : UniProt_SwissProt [version2015_11] Taxonomie : Homo sapiens Enzyme : aucun Max. raté les clivages : 0 Instrument (mascotte uniquement) : ESI-Trap Longueur min. de peptide (SequestHT seulement) : 6 Max. longueur de peptide (SequestHT seulement) : 144 Tolérance de masse précurseur : 15 ppm Fragment de tolérance masse : 0,05 Da Modifications statiques : Carbamidomethyl (C) ; [Si] TMT10plex (N-Term) Les modifications dynamiques : oxydation (M) ; [Si] TMT10plex (K) Peptide-spectre match validateur (PSM) Percolateur (mascotte et Sequest HT seulement) ou Fusion de leurre (pics seulement) Cibler les FDR : 0,01 Validation basée sur : q-valeur</li>
</ol>

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<li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li>
<li>Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+effect+of+urea+and+guanidinium+chloride+on+the+dynamics+of+unfolded+polypeptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains.</a> J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).</li>
<li>Hölttä, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+Workflow+for+Multiplex+CSF+Proteomics+and+Peptidomics+Identification+of+Candidate+Cerebrospinal+Fluid+Biomarkers+of+Alzheimer%E2%80%99s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease.</a> J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).</li>
</ol>

Aucun des intérêts concurrents, financières ou autres, entre les auteurs n’ont été signalés.

L’introduction d’un pH élevé RP HPLC avant fractionnement pas un protocole développé antérieurement pour la récupération de peptides endogènes de poids moléculaire ultrafiltration11 échantillon relative complexité réduite et ainsi autorisé pour un 5 fois plus grand volume de l’échantillon à étudier. Ceci, à son tour, augmente la concentration du sous-ensemble des peptides présents dans chacune des fractions et ainsi amélioré les chances de détecter les faibles peptides abondantes.
<p class="jo...

Biomarqueurs dans le liquide céphalorachidien (LCR) transforment actuellement recherche dans les maladies neurodégénératives. Dans la maladie d’Alzheimer, la maladie neurodégénérative plus commune, affectant plus 60 millions de personnes dans le monde1,2, un triplet de biomarqueurs de la bêta-amyloïde de peptide, stabilisation des microtubules protéine tau et un phosphorylée forme tau, capable de détecter la maladie avec une spécificité et une sensibilité élevée et a été inclus dans les critères de recherche diagnostique3. Dans d’autres maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Parkinson et la sclérose en plaques, des études protéomiques ont identifié de nombreux candidats de biomarqueurs, dont certains sont actuellement en cours d’évaluation dans les études cliniques4,5 ,6.
Aux côtés de protéines, CSF contient également une abondance de peptides endogènes7,8,9,10,11,12. Constituant des produits de clivage de nombreuses protéines encéphales, ces peptides représentent également une source potentiellement importante de biomarqueurs de la maladie. Pour augmenter l’inventaire des peptides endogènes identifiés dans le LCR humaine et que les analyses endopeptidomic CSF dans les études cliniques, il a développé une méthode pour la préparation des échantillons et l’analyse de LC-MS (un schéma de protocole bref a été inclus dans la Figure 1 ). L’application de cette méthode dans une étude récente a permis l’identification de presque 16 400 peptides endogènes de CSF dans les échantillons de LCR mise en commun de plusieurs individus de diagnostic non spécifique, élargissant l’endopeptidome CSF connu dix fois13. La méthode peut éventuellement être utilisée parallèlement aux isobare approche étiquetage pour la quantification.
Préparation des échantillons
La principale source de masse des protéines dans le LCR est constituants du plasma (par ex. albumine et des immunoglobulines) passant sur le sang cerveau barrière14,15. Leur abondance gêne la détection des composants de l’échantillon faible-abondant, dérivé du cerveau. Les peptides endogènes peuvent être aisément séparées des protéines haute-abondantes, permettant ainsi un volume beaucoup plus important d’extrait peptide CSF à utiliser pour l’analyse de LC-MS, permettant la détection des peptides moins abondantes.
Dans le protocole présenté ici, filtration de coupure (MWCO) de poids moléculaire a été utilisée pour séparer les peptides de CSF de la fraction protéique ; une méthode qui a été utilisée dans plusieurs précédentes études8,9,10,11,12,16. L’étape de filtration a été suivie d’une étape de fractionnement avant RP HPLC hors connexion effectuée sur un gradient de phase mobile pH élevé. En effectuant deux étapes de RP HPLC en tandem, avec pH étant la principale distinction, la différence de sélectivité entre les deux étapes provient essentiellement de rétention des peptides modifiés par suite de peptides différents États de charge. La demande de fractionnement pre peptide pH élevé avant SM-dans des conditions acides s’est avérée efficace en augmentant la peptide identification17,18et même à être supérieure à cette fin dans le complexe biologique échantillons par rapport aux plus séparation orthogonale modes19, tels que chat-ions forts exchange (SCX) et PR20. Pour raccourcir le temps d’analyse, un plan de concaténation a été utilisé, mise en commun de chaque fractionth 12 (p. ex., fractions 1, 13, 25, 37 et 49), qui, en raison de la puissance de haute résolution de RP HPLC, encore largement évité co élution de peptides à partir de différents fractions dans la SM-étape20,21.
Identification de peptide
Identification de peptide dans les études de peptidomic diffère de celle des études protéomiques car aucun clivage enzymatique ne peut être spécifié dans la recherche de la base de données, et en conséquence, le taux d’identification sont habituellement inférieur à11. Une récente étude13 ont montré que les tarifs d’identification pour les peptides endogènes obtenus avec Sequest et mascotte ont été sensiblement améliorées lorsque la valeur par défaut marquant l’algorithme du logiciel respectif a été modifiée à l’aide de la notation adaptative algorithme de percolateur, indiquant que les algorithmes de notation optimales pour les peptides endogènes diffèrent de celle des peptides tryptiques13. À cet étude, identification basée sur le séquençage de novo de peptide automatique en utilisant le logiciel pics (BSI) s’est avéré pour être complémentaires aux moteurs de recherche axée sur les empreintes digitales deux fragment ions, résultant en un ensemble beaucoup plus important d’identifiés peptides.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ; 1 M Bicarbonate de triéthylammonium</td><td>Fluka, Sigma-Aldrich</td><td>17902-100ML</td><td>TEAB</td></tr><tr><td>&nbsp ; 8 M Chlorhydrate de guanidinium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7294-100ML</td><td>GdnHCl</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine</td><td>Pierce</td><td>20490</td><td>TCEP</td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>SIGMA</td><td>I1149-5G</td><td>IAA</td></tr><tr><td>Hydroxylamine 50 % (w/w)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>457804-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile, UV lointain, gradient HPLC grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-2L</td><td>N</td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Fluka, Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>56302-1mL-F</td><td>FA</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-10AMP</td><td>TFA</td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>30501-1L-1M</td><td>NH4OH</td></tr><tr><td>Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-15 avec membrane Ultracel-30</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td>MWCO-filtre</td></tr><tr><td>Sep-Pak C18, 100 mg</td><td>Waters</td><td>WAT023590</td><td>SPE-column</td></tr><tr><td>Resprep 12-port SPE Manifold&nbsp ;</td><td>Restek</td><td>26077</td><td>Collecteur à vide</td></tr><tr><td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90110</td><td>TMT10plex</td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano LC System</td><td>Dionex</td><td>5200.0356</td><td>Séparation d’échantillons en ligne</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 RPLC Separation Rapid Separation Binary System</td><td>Dionex</td><td>IQLAAAGABHFAPBMBEZ</td><td>Fractionnement hors ligne à pH élevé</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Tribrid spectromètre de masse</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td><td>Spectromètre de masse pour l’analyse d’échantillons</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer 2.0&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGABSFAKJMAUH</td><td>Plateforme de recherche de protéomique</td></tr><tr><td>Mascot v2.4</td><td>Matrix Science</td><td>&nbsp ;-&nbsp ;</td><td>Moteur de recherche en protéomique</td></tr><tr><td>Sequest HT</td><td>Thermo</td><td>&nbsp ;-&nbsp ;</td><td>Moteur de recherche en protéomique</td></tr><tr><td>PICS v7.5&nbsp ;</td><td>Bioinformatic Solutions Inc.)</td><td>&nbsp ;-&nbsp ;</td><td>Moteur de recherche en protéomique</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100, 75 & micro ; m x 2 cm, C18, 100 &Aring ; taille des pores, 3 & micro ; m granulométrie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>164535</td><td>Colonne de piège (nano HPLC)</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap C18, 75 &micro ; m x 500 mm, 100&Aring ; taille des pores,&nbsp ; 2 et micro ; m granulométrie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>164942</td><td>Colonne de séparation (nano HPLC)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Concentrateurs haute capacité</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SC210A-230</td><td>SpeedVac/Vacuum</td></tr><tr><td>Concentrateur XBridge Peptide BEH C18 Colonne, 130&Aring ;, 3.5 &micro ; m, 2,1 mm x 250 mm</td><td>Eau</td><td>186003566</td><td>colonne de séparation (micro HPLC)</td></tr></tbody></table>

préparation des échantillons pour l’analyse de endopeptidomic dans le liquide céphalorachidien humaine

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Ce protocole décrit une méthode mise au point pour identifier les peptides endogènes dans le liquide céphalorachidien (LCR) humain. Pour ce faire, une méthode déjà élaborée basée sur la filtration de coupure (MWCO) de poids moléculaire et analyse par spectrométrie de masse a été combinée avec une étape de pré fractionnement HPLC hors ligne pH élevé en phase inverse.
Sécrétion dans le CSF est la principale voie d’élimination des molécules répandu par les cellules du système nerveux central. Ainsi, de nombreux processus dans le système nerveux central sont consignées dans le LCR, en rendant un précieux fluide diagnostique. CSF a une composition complexe, contenant des protéines qui couvrent une gamme de concentrations de 8-9 ordres de grandeur. En plus des protéines, des études antérieures ont également démontré la présence d’un grand nombre de peptides endogènes. Tandis que les moins étudiés que les protéines, elles conserveront également susceptibles d’intéresser comme biomarqueurs.
Les peptides endogènes ont été séparés de la teneur en protéines par le biais de filtration MWCO CSF. En supprimant la majorité de la teneur en protéines de l’échantillon, il est possible d’augmenter le volume de l’échantillon étudié et ainsi le montant total des peptides endogènes. La complexité du mélange peptide filtrée a été adressée en incluant une phase inverse étape avant fractionnement (CLHP) à pH alcalin avant l’analyse de LC-MS. Le fractionnement a été combiné avec un schéma simple concaténation où 60 fractions ont été regroupées en 12, consommation de temps d’analyse pourrait ainsi être réduite en évitant encore largement élution Co.
Peptide automatisé identification a été réalisée à l’aide de trois programmes de logiciel d’identification différents peptides/protéines et ensuite combiner les résultats. Les différents programmes sont complémentaires et non comparable avec moins de 15 % des identifications avec chevauchement entre les trois.

La méthode décrite ici a été appliquée et évaluée dans trois études avant l’instauration du fractionnement de l’échantillon (tableau 1). La première étude utilisé hors connexion LC pour repérer des fractions de CSF sur une plaque de mire MALDI et abouti à 730 peptides endogènes identifié11. Dans les deux études, étiquetage isobare travaillait. Surtout dans une étude cas/témoins étudier simultanément pour l’identification et la caractérisation des biomarqueurs potentiels dans le CSF endopeptidome e...

On présente une méthode d’analyse par spectrométrie de masse de peptides endogènes dans le liquide céphalorachidien (LCR) humain. En utilisant la filtration de limite de poids moléculaire, fractionnement chromatographique de pré, analyse par spectrométrie de masse et une combinaison subséquente des stratégies d’identification de peptide, il était possible d’étendre la peptidome CSF connu presque décuplé par rapport à des études antérieures.

Préparation des échantillons pour l’analyse de Endopeptidomic dans le liquide céphalorachidien humaine

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

L'objectif de ce protocole est de préparer et d'analyser des échantillons de liquide céphalorachidien humain pour une analyse par spectrométrie de masse en chromatographie liquide (LC-MS) des peptides endogènes. Une étape de préfractionnement des peptides avant la LC-MS augmente le nombre de peptides identifiés et permet la détection de peptides du LCR présents à faible abondance. Les peptides endogènes dans le LCR sont des molécules régulatrices du calcium qui n'ont pas été largement explorées et pourraient potentiellement inclure de nouveaux biomarqueurs importants des troubles neurodégénératifs. Cette méthode permet une caractérisation approfondie du peptidome du LCR par spectrométrie de masse. Les principaux avantages de cette méthode sont qu'elle permet l'injection de peptides du LCR à faible abondance et qu'elle est compatible avec les techniques de marquage isobare multiplexées, ce qui la rend applicable aux études cliniques. Jusqu'à présent, nous avons principalement appliqué cette méthode à l'analyse du liquide céphalorachidien. Toutefois, nous disposons de données préliminaires indiquant qu'avec de légères modifications, elle peut également être utilisée pour l'analyse d'

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Découvrez une méthode d'analyse peptidomique du liquide céphalorachidien humain par spectrométrie de masse avec préfractionnement chromatographique. Cette approche permet d'identifier des peptides peu abondants et de découvrir de nouveaux biomarqueurs pour les maladies neurodégénératives.

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