Vivre-imagerie de la Migration des cellules épithéliales mammaires après la diminution transitoire des TIP60

L’objectif global de cette procédure est d’observer les effets de l’épuisement de gènes d’intérêt spécifiques sur la migration cellulaire. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés sur les métastases cancéreuses, telles que la migration des cellules cancéreuses. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de suivre la migration dynamique des cellules en temps réel.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois, lorsque nous avons observé des changements de morphologie cellulaire sur un patient de TIP60, un suppresseur de tumeur. Commencez par ensemencer un million de cellules épithéliales mammaires dans trois millilitres de milieu de culture par boîte de 10 centimètres. Ajoutez 20 minutes de mélange SRINA incubé à température ambiante goutte à goutte à la culture cellulaire expérimentale.

Secouez manuellement les deux plats pour vous assurer que les cellules sont uniformément réparties avant de les placer dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après six heures, remplacez les surnageants par huit millilitres de milieu de culture frais par plat et remettez les cultures dans l’incubateur. Le lendemain matin, remplacez les surnageants par trois millilitres de milieu de culture frais par boîte et ajoutez une deuxième parcelle de mélange SIRNA à la culture cellulaire expérimentale, comme nous venons de le démontrer, en secouant la boîte pour vous assurer que les réactifs sont complètement mélangés avant de retourner les cellules dans l’incubateur.

Remplacez ensuite les surnageants par huit millilitres de milieu de culture frais après six heures et incubez les cultures pendant la nuit. Le troisième jour, lavez les cellules une fois avec deux millilitres de BPS par plaque et détachez les cellules des deux plaques avec un millilitre d’EDTA tripson par plat pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, arrêtez la réaction avec quatre millilitres de milieu de culture complet par plaque.

Remettez les cellules en suspension par pipetage et transférez les suspensions cellulaires dans des tubes individuels de 15 millilitres. Récupérez les cellules par centrifugation et remettez les granulés en suspension dans cinq millilitres de milieu sans sérum par tube. Après le comptage, diluez les deux cultures cellulaires à une concentration de 600 000 cellules par millilitre et ajoutez 500 microlitres de cellules de chaque culture dans un puits d’une plaque de 24 puits pour assurer une confluence de 100 %.

Lorsque toutes les cellules ont été ensemencées, secouez doucement la plaque d’avant en arrière et d’un côté à l’autre pour assurer une distribution uniforme et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Pour vérifier l’efficacité de neutralisation du gène d’intérêt, collectez les cellules restantes dans les tubes de collecte avec une autre centrifugation et isolez l’ARN des pastilles, à l’aide d’un réactif commercial conformément aux instructions du fabricant pour une évaluation quantitative par PCR en temps réel. Le lendemain matin, au moins une heure avant de commencer l’imagerie des cellules vivantes, allumez le microscope et contrôlez la température.

Réglez la température à 37 degrés Celsius et l’alimentation en dioxyde de carbone à 5 %Lorsque la chambre a atteint 37 degrés Celsius, utilisez la microscopie à contraste de phase pour confirmer que les cellules sont confluentes et entièrement attachées au fond des puits. Ensuite, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres pour gratter doucement une ligne droite sur toute la longueur du centre de chaque puits et lavez doucement tous les puits cinq fois avec un milieu sans sérum pour éliminer les cellules détachées. Après le dernier lavage, ajoutez un millilitre de milieu sans sérum dans chaque puits.

Placez la plaque sur la platine du microscope sous l’objectif de puissance 10 et dirigez la lumière émise vers les oculaires au lieu de la caméra. Ajustez manuellement la mise au point pour localiser chaque plaie et les cellules qui l’entourent. Ensuite, renvoyez la lumière émise à la caméra et utilisez un système d’observation de cellules vivantes pour marquer la position des plaies et régler les conditions de temps.

Imagez les cellules pour la période d’expérience appropriée, puis ouvrez la première vidéo avi dans le logiciel d’imagerie approprié et ouvrez le plug-in m track j. Cliquez sur l’onglet Ajouter pour ajouter une piste pour les cellules individuelles et choisissez une cellule à l’extrémité du front envahissant et une cellule qui peut migrer seule. Suivez le mouvement des cellules choisies sur la vidéo à l’aide de mtrackJ pour retracer leur trafic.

Cliquez ensuite sur l’onglet Mesure pour mesurer la distance de mouvement de la cellule et enregistrer les vidéos avec les pistes au format avi. Après déplétion de TIP60, les cellules épithéliales mammaires sont plus mésenchymateuses que les cellules témoins cultivées. En effet, l’expression de TIP60, ainsi que l’expression des molécules d’adhésion des cellules épithéliales, diminuent significativement après un traitement par siTIP60.

D’autre part, l’expression de gènes moteurs spécifiques de la transition épithéliale à mésenchymateuse est augmentée lors de la déplétion de TIP60. L’imagerie en direct des cultures cellulaires après l’administration de la plaie démontre une migration cellulaire plus rapide des cellules traitées au siTIP60, par rapport aux cultures siControl, avec une augmentation significative du pourcentage de cellules migrantes observée en réponse à la déplétion du TIP60. De plus, les cellules siControl se déplacent comme une feuille, tandis que davantage de mouvements unicellulaires sont observés dans les cultures siTIP60.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser une technique d’imagerie de cellules vivantes pour surveiller les changements dynamiques de la migration cellulaire.