Name: Activation des cellules Müller Glia dans une dégénérescence rétinienne induite par Laser et le modèle de régénération chez le poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Découvrez l'induction de lésions rétiniennes focales par laser chez Danio rerio et le suivi des changements cellulaires in vivo. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de régénération rétinienne et les réponses des cellules gliales de Müller.

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Nous remercions Martin Zinkernagel, MD, PhD et Miriam Reisenhofer, PhD pour son apport scientifique à mettre en place le modèle et Federica Bisignani pour son aide technique excellente.

toutes les expériences ont adhéré à la déclaration pour l’utilisation des animaux en ophtalmiques et de la recherche de la Vision de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) et respecter les règlements connexes des autorités gouvernementales.
 1. animaux <ol><li>TgBAC maintenir (gfap:gfap-GFP) poisson zèbre 167 souche (AB) âgés de 6 à 9 mois dans des conditions normales dans l’eau avec une température de 26.5 ° C et un cycle lumière/obscurité de 14/10 h 18.</li>
	<li>Suivre les directives de protection des animaux des institutions impliquées pour l’expérimentation animale après approbation par les autorités gouvernementales.</li>
</ol> 2. Réversible anesthésie systémique <ol><li>préparer la solution de sel de méthanesulfonate 3-aminobenzoate d’éthyle (tricaïne) dissoudre 400 mg de poudre de tricaïne dans 97,9 mL de l’eau du réservoir et 2,1 mL de 1 M de Tris buffered saline (TBS). Ajuster le pH 7.0 avec 1 M Tris (pH 9) et les conserver à 4 ° C dans l’obscurité jusqu'à un mois. 
	NOTE : Tricaïne devrait être établi dans l’eau comme les conditions de vie naturelle de l’animal, de préférence original réservoir d’eau doit être utilisé.</li>
	<li>Diluer la solution mère 01:25 dans réservoir d’eau et consommez immédiatement.</li>
	<li>Placer le poisson-zèbre dans une boîte de Pétri contenant 50 mL de solution d’anesthésie jusqu'à ce qu’ils deviennent immobiles et ne répondent pas aux stimuli externes (environ 2-5 min, selon le poids et l’âge) de 10 cm.</li>
	<li>Transférer chaque poisson à la main sur un support de broche silicone sur mesure pour le traitement au laser ( Figure 1 a). 
	MISE EN GARDE ! Le poisson peut rester anesthésié à l’extérieur du réservoir jusqu'à 10 min seulement.</li>
	<li>Pour inverser l’anesthésie après traitement et/ou d’imagerie, mettre le poisson-zèbre dans le récipient contenant le réservoir d’eau.</li>
	<li>Pour soutenir la reprise, créer un flux d’eau fraîche sur les branchies en déplaçant le poisson-zèbre en arrière dans l’eau.</li>
</ol> 3. Une lésion focale sur la rétine au laser Remarque : laser à diode A 532 nm est utilisé pour créer des dommages légers focal sur la rétine du poisson-zèbre. Le montage expérimental du laser permet la mise en place d’une lésion rétinienne focale reproductible chez le poisson zèbre adulte.
<ol><li>Mis en place la puissance du laser : 70 mW ; diamètre de l’antenne : 50 µm ; durée de l’impulsion : Mme 100 attention ! L’utilisation de la lumière laser nécessite de protection individuelle appropriée et à l’étiquetage de la zone.</li>
	<li>Appliquer 1 à 2 gouttes d’hydroxypropylméthylcellulose de 2 % par voie topique dans les yeux avant le traitement et une lentille laser de 2,0 mm du fond de œil permet de focaliser le faisceau de pointage laser sur la rétine. 
	MISE EN GARDE ! hydroxypropylméthylcellulose gouttes sont visqueux et peut provoquer des problèmes respiratoires si il va sur les branchies.</li>
	<li>Place quatre laser taches autour du nerf optique sur la gauche les yeux et utilisez le œil droit et non traitée comme contrôle interne.</li>
</ol> 4. In vivo Imagerie de la morphologie de la rétine <ol><li>au jour J0, visualiser la rétine zebrafish directement après l’induction de laser sans raviver leur fin de l’anesthésie. Dans tous les autres points dans le temps, employer l’anesthésie générale (voir la Section 2 : anesthésie systémique réversible). Placer le poisson-zèbre immobilisé sur un support de broche silicone sur mesure ( Figure 1 B, B.1).</li>
	<li>D’obtenir des images optimales, couper une lentille de contact hydrogel disponibles dans le commerce pour s’adapter à le œil de poisson-zèbre (Ø = 5,2 mm, r = 2,70 mm, épaisseur centrale = 0,4 mm) au moyen d’une perforatrice. Remplir la surface concave de la lentille de méthylcellulose et placez-le sur la cornée.</li>
	<li>Équiper le système OCT avec un objectif de lampe de fente sans contact de 78D.</li>
	<li>Focus image infrarouge (IR) dans l’IR + mode OCT ( Figure 2 a) à visualiser le fond de le œil et l’IR photos en cliquant sur le &#34; Acquire &#34; bouton ( Figure 2 b) pour localiser le taches sur la rétine à l’aide du système au laser &#39; logiciel de s.</li>
	Mode de <li>visualiser un article en trois dimensions des couches rétiniennes dans l’IR + OCT et prendre les photos en cliquant sur le &#34; Acquire &#34; bouton ( Figure 2 b). Observer la gravité des blessures dans la couche nucléaire externe (ONL) (voir la Section 3 : blessure focal sur la rétine au Laser) dans ces images.</li>
	<li>D’inverser l’anesthésie après traitement et/ou d’imagerie a placé le poisson-zèbre dans un récipient contenant de l’eau du réservoir.</li>
	<li>Pour soutenir la reprise, créer un flux d’eau fraîche sur les branchies en déplaçant le poisson-zèbre en arrière dans l’eau.</li>
	<li>Effectuer similaire en vivo imagerie rétinienne morphologie au jour 1, 3, 7, 14 et la semaine 6.</li>
</ol> 5. L’hématoxyline &#38; éosine (H &#38; E) coloration <ol><li>euthanasier zebrafish par submersion dans le froid (4 ° C) solution anesthésie sur la glace pendant au moins 10 min et enucleate les yeux immédiatement par le biais de petites pinces courbées.</li>
	<li>Fixer les yeux tout en paraformaldéhyde à 4 % (PFA) en tampon phosphate salin (PBS) à 4 ° C pendant 20 h et puis déshydrater les échantillons en une série graduée de l’alcool (xylène 100 % pendant 5 minutes deux fois, éthanol 100 % pendant 5 minutes deux fois, éthanol 96 % pendant 3 min deux fois et l’éthanol 70 % 3 mi n une fois). 
	MISE EN GARDE ! PFA peut être irritant pour les yeux, du nez et des voies respiratoires supérieures. PFA est un carcinogène humain connu et un danger pour la reproduction présumé.</li>
	<li>Intégrer les échantillons à la paraffine, µm 5 coupes au niveau de la papille optique et montez-les sur lames de verre.</li>
	<li>Tacher les sections déparaffinées avec solution à 0,1 % acide hématoxyline pendant 5 min et tremper les lames deux fois dans l’eau distillée après trempage des diapositives dans le mélange de l’acide chlorhydrique (HCl dans 250 mL de 2 mL 25 % eau distillée eau) et ammoniac mélanger (2 mL 25 % d’ammoniaque dans 250 mL eau distillée). Tacher les sections avec l’éosine G solution aqueuse 0,5 % pendant 3 min après le développement de l’hématoxyline taches provoquées par l’eau du robinet pendant au moins 10 mn</li>
	<li>Monter les lames déshydratées dans milieu de montage de résine acrylique et d’observer les diapositives sous microscope photonique.</li>
</ol> 6. Immunohistochemistry pour l’Activation de MC <ol><li>chauffer les coupes déparaffinées dans le tampon de récupération de l’antigène (Tris-EDTA + 0,05 % de détergent non ionique, pH 9,0) pendant 3 min dans un cuit vapeur approprié ou un four à micro-ondes pendant 10-15 min et laver trois fois avec le SCT pour 5 min chaque.</li>
	<li>Cercle les sections avec un silicone stylo et ajouter 100 µL bloquant la solution (SCT + sérum normal de chèvre 10 % + 1 % d’albumine sérique bovine, pH 7,6) à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>Tache avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-gliales protéine fibrillaire acide (GFAP) et avec l’anticorps monoclonal de souris anti-glutamine synthétase (GS), tous deux dans une dilution de 1 : 200 (40 µL par exemple). Incubez la diapositive dans une chambre humidifiée à 4 ° C durant la nuit. Laver trois fois avec TBS + 0,1 % Tween 20 pour chaque 5 min.</li>
	Anticorps secondaires <li>finition visualisation avec le cas échéant. Ce protocole utilisé une chèvre de anti-lapin IgG H &#38; anticorps secondaire L vert GFAP et une chèvre anti-souris IgG H &#38; rouge vif L GS, aussi bien dans une dilution de 1/500 à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>Monter les diapositives avec support de montage contenant DAPI et observer les diapositives sous le microscope de fluorescence.</li>
</ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Régénération/dégénérescence rétinienne chez le poisson-zèbre a étudié différentes approches telles que de mort cellulaire cytotoxine22, une lésion mécanique23et lésion thermique24. Nous avons utilisé un laser à diode 532 nm à endommager la rétine de poisson-zèbre. Ainsi, notre modèle offre plusieurs avantages. Par exemple, nous avons créé rapidement une zone bien définie de lésions localisées dans la rétine externe, plus précisément dans la couche de...

Vision est probablement le sens essentiel de l’être humain et son atteinte a une forte incidence socio-économique. Dans le monde industrialisé, maladies dégénératives de la rétine constituent la majorité de la perte de la vision et de cécité chez la population adulte1. Rétinite pigmentaire (RP) est la cause héréditaire la plus fréquente de cécité chez les personnes âgées de 20 à 60, affectant environ 1,5 millions de personnes dans le monde entier2,3. C’est une famille hétérogène de rétiniennes héréditaires caractérisées par une perte progressive des photorécepteurs (PRs) suivie d’une dégénérescence de l’épithélium pigmentaire rétinien et, par la suite, une gliose et remodelage des neurones interne4. L’évolution de la maladie peut s’expliquer par la perte progressive des deux types de cellules PR, généralement en commençant avec les tiges, qui sont responsables de la vision achromatique dans la pénombre et les cônes, qui sont essentielles pour la vision et l’acuité de la couleur5. Un défaut génétique unique suffit à provoquer des RP. Jusqu'à présent, plus de 130 mutations dans les gènes de plus de 45 ont été associées à la maladie6. Cela conduit à divers phénotypes de la maladie et est une des raisons que la thérapie génique est non généralisables et donc une approche thérapeutique complexe. Par conséquent, il y a un besoin urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques générales pour traiter la dégénérescence rétinienne en aveuglant les maladies.
Souvent la dégénérescence rétinienne implique la perte de PR ; par conséquent, la mort cellulaire PR est une caractéristique des processus dégénératifs dans la rétine7. Il a déjà été démontré que la mort des cellules PR stimule Müller glia cellulaire (MC) activation et la prolifération des8. MCs, le type de cellules gliales majeur dans la rétine des vertébrés, étaient autrefois considéré comme rien de plus qu’une « colle » entre les neurones de la rétine. Ces dernières années, de nombreuses études ont montré que MCs agissent comme plus que simple structurels soutiennent le9. Parmi les différentes fonctions, MCs participent également à la neurogenèse et réparer10. En effet, en réponse à des facteurs diffusibles par la dégénérescence rétine, MCs augmentent considérablement expression de protéine fibrillaire acide gliale (GFAP). Par conséquent, GFAP étiquetage peut servir comme marqueur pour l’activation du MC en réponse secondaire à des lésions rétiniennes et dégénérescence11.
Récemment, nous avons développé une nouvelle adaptation de lésion focale en utilisant un laser pour induire la dégénérescence rétinienne chez le poisson zèbre (Danio rerio). Lésion focale est avantageuse pour l’étude de certains processus biologiques tels que la migration des cellules dans le site lésé et le calendrier précis des événements qui se produisent pendant la régénération rétinienne12. En outre, le poisson-zèbre est devenu important dans la recherche visuelle en raison des similitudes entre son système visuel et celui des autres vertébrés. Les caractéristiques morphologiques et histologiques bruts de rétines humaines et téléostéens présentent des différences peu. En conséquence, les rétines humaines et poisson-zèbre contiennent les mêmes classes de cellule majeur organisés dans le même modèle en couches, où les photorécepteurs de détection de lumière occupent la couche la plus externe, tandis que les neurones de projection rétinienne, les cellules de ganglion, résident dans la plus profonde couche neuronale, proximale de la lentille. Les interneurones rétiniens, les amacrines, bipolaire et les cellules horizontales, localiser entre les photorécepteurs et ganglion cellule couches13. En outre, la rétine du poisson-zèbre est dominée par les cônes et donc plus proche de la rétine humaine que, par exemple, la rétine rongeur étudiée. Une fascinante différence entre téléostéen et mammifères est la neurogenèse persistante dans rétine de poisson et de la régénération rétinienne après avarie. Chez le poisson zèbre, MCs peuvent dédifférenciation et médiation de régénération dans la rétine blessé14,15. Dans le poulet, MCs ont certaines capacité aussi à réintégrer le cycle cellulaire et de dédifférenciation. Suite à une lésion rétinienne chez les poissons adultes, MCs adoptent certaines caractéristiques des cellules souches et progénitrices, migrent vers le tissu rétinien endommagé et produisent de nouveaux neurones16. Le profil d’expression génique des mammifères MCs révèle inattendus similitudes avec cellules souches rétiniennes, et preuve intrinsèque potentiel neurogène des MCs dans le poulet, les rongeurs et rétine même humaine croît17. Néanmoins, pourquoi la réponse régénératrice chez les oiseaux et les mammifères est plus faible comparativement à la réponse robuste chez les poissons n’est pas encore compris. Par conséquent, la compréhension des mécanismes de réparation endogène chez le poisson zèbre peut suggérer des stratégies pour stimuler la régénération rétinienne chez les mammifères et les êtres humains. Utilisant le mécanisme de réparation endogène des MCs comme un outil thérapeutique pour le traitement des patients atteints de dégénérescence rétinienne aurait un impact exceptionnel pour notre société.
Ici, nous fournissons les étapes nécessaires pour utiliser le modèle de dégénérescence/régénération dans la recherche ophtalmologique. Nous nous sommes concentrés d’abord sur induisant des dommages focal dans la rétine neurosensorielle, puis sur l’imagerie des événements de développement sur le site de la blessure et enfin visualisation implication des MCs adjacents. Le protocole général est relativement facile à réaliser et ouvre un large éventail de possibilités pour l’évaluation de la rétine par la suite.

<table><tbody><tr><td>Solution d’hématoxyline acide</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse</td><td>2852</td><td></td></tr><tr><td>Albumine</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage DAPI</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, États-Unis</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin G solution aqueuse 0,5 %</td><td>Carl Roth, Arlesheim, Suisse</td><td>X883.2</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylène-diamine tétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin IgG H& L Alexa Fluor&reg ; 488</td><td>Life Technologies, Zoug, Suisse</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG H& L Alexa Fluor&reg ; 594</td><td>Life Technologies, Zoug, Suisse</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Sérum normal de chèvre</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Lentille de contact en hydrogel</td><td>Johnson & Johnson AG, Zoug, Suisse</td><td>n.a.1-Day</td> <td>Acuvue Moist</td></tr><tr><td>Hydroxypropylmethylcellulose 2 %</td><td>OmniVision, Neuhausen, Suisse</td><td>n.a.Methocel</td> <td>2 %</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse</td><td>A5040</td><td>Tricaine, MS-222</td></tr><tr><td>Visulas 532s</td><td>Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Allemagne</td><td>n.a.532</td> <td>nm</td></tr><tr><td>Souris laser anticorps monoclonal anti-GS</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT Imaging System</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany</td><td>n.a.Spectralis</td><td></td></tr> <tr><td>Heidelberg Eye Explorer</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany</td><td>n.a.Version</td> <td>1.9.10.0</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal anti-GFAP pour lapin</td><td>Invitrogen, Waltham, MA, USA</td><td>180063</td><td></td></tr><tr><td>Porte-goupille en silicone</td><td>Huco Vision AG Switzerland</td><td>n.a.Découpe</td> <td>à la main du plateau de stérilisation en conséquence.</td></tr><tr><td>Lampe à fente BM900</td><td>Haag-Streit AG, Koeniz, Suisse</td><td>n.a.Adaptateur</td><td></td></tr> <tr><td>de lampe à fente</td><td>Iridex Corp., Mountain View, CA, USA</td><td>n.a.Superfrost</td><td></td></tr> <tr><td>Plus lames en verre</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Allemagne</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>TgBAC (gfap :gfap-GFP) zf167 (AB)</td><td>strain KIT, Karlsruhe, Allemagne</td><td>15204</td><td>http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée Tris (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>78D Lentille de lampe à fente sans contact</td><td>Volk Optical, Mentor, OH, États-Unis</td><td>V78C</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Lentille laser de fond d’œil</td><td>oculaire Ocular Instruments, Bellevue, WA, États-Unis</td><td>OFA2-0</td><td></td></tr><tr><td>2100 Retriever</td><td>Aptum Biologics Ltd., Southampton, Royaume-Uni</td><td>R2100-EU</td><td>Cuiseur vapeur</td></tr></tbody></table>

activation des cellules müller glia dans une dégénérescence rétinienne induite par laser et le modèle de régénération chez le poisson zèbre

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Une fascinante différence entre téléostéen et mammifères est le potentiel tout au long de la rétine chez les téléostéens pour neurogenèse rétinienne et la régénération après des dommages graves. Enquête sur les voies de la régénération chez le poisson zèbre pourrait apporter de nouvelles connaissances pour élaborer des stratégies innovantes pour le traitement des maladies dégénératives de la rétine chez les mammifères. Dans les présentes, nous nous sommes concentrés sur l’induction d’une lésion focale à la rétine externe chez le poisson zèbre adulte au moyen d’un laser à diode 532 nm. Une lésion localisée permet l’étude des processus biologiques qui ont lieu au cours de la dégénérescence rétinienne et de régénération directement à la zone de dommages. En utilisant la tomographie à cohérence optique non invasif (OCT), nous avons pu définir l’emplacement de la régénération ultérieure de zone et moniteur endommagée in vivo. En effet, l’imagerie OCT produit des images haute résolution et transversales de la rétine de poisson-zèbre, fournissant des informations qui étaient auparavant uniquement disponibles avec les analyses histologiques. Afin de confirmer les données de l’OCT en temps réel, les coupes histologiques ont été réalisées et régénératrice après l’induction de la lésion rétinienne a été étudiée par immunohistochimie.

OCT en temps réel: afin d’analyser le rôle des MCs en réparation rétinienne, nous utilisons un modèle de blessure de laser induisant une zone bien délimitée de dommages à la rétine de poisson-zèbre. Le site de dommages a été photographié au moyen de in vivo OCT pour la première fois (jour 0) dans les 60 minutes suivant la lésion (Figure 3). Pour compenser l’optique de le œil de poisson, une lentille de contact sur mesure a été placée...

Le poisson-zèbre est un populaire modèle animal pour étudier les mécanismes de dégénérescence rétinienne/régénération chez les vertébrés. Ce protocole décrit une méthode pour induire des lésions localisées perturbant la rétine externe avec un minimum de dommages à la rétine interne. Par la suite, nous surveillons in vivo la morphologie de la rétine et la réponse de glia Müller tout au long de la régénération rétinienne.

Activation des cellules Müller Glia dans une dégénérescence rétinienne induite par Laser et le modèle de régénération chez le poisson zèbre

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

L'objectif général de cette vidéo est de montrer comment surveiller les changements cellulaires in vivo après un dommage rétinien focal induit par laser chez le poisson zèbre. Ce modèle peut aider à répondre à des questions clés sur la régénération rétinienne, telles que les changements morphologiques, la cinétique, ainsi que les types cellulaires impliqués. Le principal avantage de cette technique est qu'en induisant une lésion focale, les processus biologiques peuvent être étudiés directement au site de la lésion.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la régénération de la rétine du poisson zèbre, elle peut également être appliquée à l'étude du mécanisme de réparation dans différents modèles animaux. Préparez une solution mère d'anesthésique en dissolvant 400 milligrammes de poudre de tricaine dans 97,9 millimètres d'eau de bassin et 2,1 millimètres de TBS un molaire. Ajustez le pH à 7,0 à l'aide de tris un molaire à pH 9.Pour préparer la solution de travail, diluez la solution mère de tricaïne au 1/25 dans de l'eau de bassin et transférez 50 millilitres dans une boîte de Pétri. Ensuite, placez les poissons zèbres dans la solution anesthésique pendant deux à cinq minutes, jusqu'à ce qu'ils deviennent immobiles et ne réagissent plus aux stimuli externes. Transférez chaque poisson manuellement vers un support de pincement en silicone sur mesure pour le traitement au laser.Une anesthésie appropriée est essentielle pour le bien-être de l'animal et la réussite de la procédure. Par conséquent, la solution de tricaine fraîchement préparée est cruciale, et le temps passé hors de l'eau ne doit pas dépasser largement 10 minutes. Réglez la puissance de sortie du laser à 532 nanomètres sur 70 milliwatts, la durée de l'impulsion sur 100 millisecondes et le diamètre aérien sur 50 microns.Ensuite, appliquer une à deux gouttes de méthylcellulose à 2 % dans l'œil. Lors de l'application de la méthylcellulose dans l'œil, veiller à ce que la solution visqueuse n'entre pas dans les branchies. Puis, utiliser une lentille de laser fundus de 2 millimètres pour focaliser le faisceau laser de visée sur la rétine.Placer quatre taches laser autour du nerf optique de l'œil gauche et utiliser l'œil droit, non traité, comme témoin interne. Immédiatement après l'induction par laser, placer le poisson-zèbre encore anesthésié sur un support en silicone muni d'épingles, conçu sur mesure, dans la zone d'imagerie. Pour obtenir des images optimales, découper une lentille de contact en hydrogel disponible dans le commerce à l'aide d'un perforateur afin qu'elle s'adapte à l'œil du poisson-zèbre.Remplissez la surface concave de la lentille avec de la méthylcellulose, puis placez-la au-dessus de la cornée. Équipez le système de tomographie par cohérence optique d'une lentille à fente sans contact de 78D. Mettez au point l'image infrarouge en mode IR plus OCT pour visualiser le fond de l'œil.Ensuite, prendre les images en infrarouge en cliquant sur le bouton d'acquisition pour localiser les points laser sur la rétine. Puis, visualiser une section tridimensionnelle des couches rétiniennes en mode infrarouge combiné à la tomographie en cohérence optique (OCT), et prendre les images en cliquant sur le bouton d'acquisition. Observer la gravité de la lésion dans la couche nucléaire externe sur ces images.Pour inverser l'anesthésie après le traitement et l'imagerie, placer les poissons-zèbres dans un récipient contenant de l'eau de bassin. Pour favoriser la récupération, créer un flux d'eau de bassin fraîche sur les branchies en déplaçant les poissons-zèbres en avant et en arrière dans l'eau. Immédiatement après le traitement au laser, un signal hyper-réflectif diffus était localisé dans la rétine externe.Il s'étendait de l'épithélium pigmentaire rétinien jusqu'à la couche plexiforme externe. Le signal hyper-réfléchissant diffus est absent dans la rétine de l'œil témoin non lésé. Un signal hyper-réfléchissant diffus similaire est détecté le premier jour suivant la lésion.Après le troisième jour, ce signal diffus est devenu plus organisé et plus dense. Il était observé de manière constante dans la couche nucléaire externe, s'étendant jusqu'à la couche des photorécepteurs. Après la première semaine, une diminution significative de la taille moyenne des lésions a été notée, et seul un petit signal hyper-réfléchissant a été détecté.À partir du jour 14 jusqu'au dernier point temporel analysé, les taches laser n'étaient plus visibles sur les images en IR et en OCT, et la morphologie de la rétine est comparable à celle du côté contrôle, visible ici. La coloration H&E a été utilisée pour étudier l'ampleur et la cinétique de la dégénérescence et de la régénération rétiniennes. Cette image montre la coupe témoin.Cette image montre une coloration H&E trois jours après la lésion, au moment où la perte maximale de photorécepteurs est apparente. Une immunohistochimie a été réalisée pour visualiser les marqueurs des cellules gliales, la glutamine synthétase en rouge et la protéine acide fibrillaire gliale en vert. Cette image montre une rétine témoin dans laquelle il y a très peu de fluorescence verte, ce qui est indicatif de la GFAP.Le signal de la GFAP était surexprimé au troisième jour suivant la lésion, tandis que le signal rouge de la glutamine synthétase restait inchangé. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la microscopie à deux photons ainsi que des analyses cellulaires et moléculaires peuvent être réalisées afin d'étudier l'implication des cellules moléculaires dans les mécanismes de réparation endogènes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment induire une lésion focale dans la rétine du poisson zèbre et suivre in vivo les processus dégénératifs et régénératifs qui s'ensuivent.

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Cette vidéo montre une procédure pour induire la dégénérescence rétinienne chez le poisson-zèbre adulte à l’aide d’une lésion laser. Le laser cible les cellules photoréceptrices de la rétine, déclenchant la mort cellulaire et un processus dégénératif. Ces dommages activent les cellules gliales de Müller (MG), entraînant leur dédifférenciation en progéniteurs de cellules souches qui aident à la régénération rétinienne.

Modélisation de la dégénérescence et de la régénération rétiniennes chez le poisson-zèbre à l’aide d’une lésion focale au laser

Source : Lahne, M., et.al. Culture d’explants rétiniens de poisson-zèbre transgénique adulte pour l’imagerie de cellules vivantes par microscopie multiphotonique. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo démontre l’imagerie de cellules vivantes de la migration nucléaire gliale de Muller dans des explants rétiniens de poisson-zèbre inclus dans de l’agarose suite à des lésions des photorécepteurs induites par la lumière. Le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) libéré par les photorécepteurs endommagés...

Imagerie de cellules vivantes de la migration nucléaire gliale de Muller pendant la régénération rétinienne du poisson-zèbre

Bien que le système nerveux périphérique (SNP) est capable de réparations importantes après une blessure, on en sait peu sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ce phénomène. L'utilisation en direct, le poisson-zèbre transgénique et un essai de section du nerf reproductible, nous pouvons étudier les comportements des cellules gliales dynamiques au cours de la dégénérescence nerveuse et la régénération.

Moteur section du nerf et imagerie time-lapse de comportements de cellules gliales chez le poisson zèbre en direct

Protocoles de légers dégâts multiples ont été décrits pour les photorécepteurs des dommages et par conséquent induire une réponse de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte. Ce protocole décrit une méthode améliorée qui peut être utilisé chez les animaux pigmentés et qui endommage la grande majorité de la tige et des cônes photorécepteurs dans la rétine entière.

A Novel lumière paradigme de dommages pour utilisation dans les études de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte

Ici, nous démontrons la quantification des ment de la rétine et de la régénération et de son impact sur ​​la fonction visuelle en utilisant la N -nitrosourea de N chez le poisson zèbre adulte. Baisse de l'acuité visuelle et une diminution du nombre de photorécepteurs ont été suivis par une prolifération dans la couche nucléaire interne. Régénération morphologique et fonctionnelle complète a eu lieu 30 jours après le traitement initial.

Méthylnitrosourée (MNU) induite par dégénérescence rétinienne et la régénération dans le poisson zèbre: caractéristiques histologiques et fonctionnelles

Les manipulations ciblées pour provoquer un stress dirigé ou la mort dans des cellules individuelles ont été relativement difficiles à réaliser. Ici, une approche d’ablation à résolution cellulaire unique pour stresser et tuer sélectivement des cellules individuelles dans des cultures cellulaires et des animaux vivants est décrite sur la base d’un laser UV confocal standard.

Déclenchement Stress cellulaire et la mort Utilisation conventionnelle UV Laser Microscopie confocale

la régénération rétinienne Zebrafish a surtout été étudiée en utilisant des rétines fixes. Cependant, les processus dynamiques tels que la migration nucléaire interkinetic se produisent au cours de la réponse régénérative et nécessitent imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes sous-jacents. Ici, nous décrivons la culture et d'imagerie conditions pour surveiller Interkinetic Migration nucléaire (INM) en temps réel en utilisant la microscopie multiphoton.

Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

L’ablation au laser est une technologie largement applicable pour étudier la régénération dans les systèmes biologiques. Le protocole présenté décrit l’utilisation d’un microscope confocal standard de laser-balayage pour l’ablation de laser et la formation image time-lapse suivante des cellules interuromast régénérantes dans la ligne latérale de zebrafish.

Essai confocal d’ablation et de régénération au microscope dans les cellules interuromast de Zebrafish

Le présent protocole décrit une méthode pour induire des lésions tissulaires spécifiques et hautement reproductibles chez les larves de poisson zèbre à l’aide d’un système de lésion laser combiné à une plate-forme microfluidique automatisée pour la manipulation des larves.

Lésions semi-automatisées contrôlées induites par laser pour étudier la régénération de la moelle épinière chez les larves de poisson zèbre

L’article explique comment enlever chirurgicalement les yeux des larves vivantes de poisson zèbre comme première étape vers l’étude de la façon dont l’apport rétinien influence la croissance et le développement du tectum optique. En outre, l’article fournit des informations sur l’anesthésie larvaire, la fixation et la dissection cérébrale, suivies de l’immunohistochimie et de l’imagerie confocale.

Enlèvement des yeux chez les larves vivantes de poisson zèbre pour examiner la croissance et le développement du système visuel dépendants de l’innervation

Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide d’un modèle transgénique de poisson-zèbre. L’adaptation du protocole pour incorporer la modulation de la voie de signalisation à l’aide de composés pharmacologiques est très détaillée. Une plate-forme MATLAB pour quantifier la régénération RPE basée sur la pigmentation a été développée et est présentée et discutée.

Ablation médiée par la nitroréductase/métronidazole et une plate-forme MATLAB (RpEGEN) pour l’étude de la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre

Découvrez l'induction de lésions rétiniennes focales par laser chez Danio rerio et le suivi des changements cellulaires in vivo. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de régénération rétinienne et les réponses des cellules gliales de Müller.

Activation des cellules Müller Glia dans une dégénérescence rétinienne induite par Laser et le modèle de régénération chez le poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal

Activation des cellules Müller Glia dans une dégénérescence rétinienne induite par Laser et le modèle de régénération chez le poisson zèbre

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