Préparation des Hydrogels injectables axée sur le Chitosan et son Application en Culture cellulaire 3D

L’objectif global de ce protocole est de préparer un hydrogel de chitosane injectable pour la culture cellulaire tridimensionnelle afin de l’utiliser à terme dans des traitements thérapeutiques. Cette méthode peut répondre à des questions dans le domaine de l’hydrogel auto-cicatrisant, comme comment fabriquer un hydrogel auto-cicatrisant en l’immergeant complètement et comment l’utiliser pour la culture cellulaire 3D. L’avantage de cette technique est, par compatible auto-cicatrisant hydrogel peut être préparé de manière très simple, et l’utilisation d’une culture cellulaire 3D.

Cet hydrogel est également injectable, il peut donc être utilisé comme support pour la thérapie cellulaire. Maintenant, M. Yongsan Li va vous montrer comment fabriquer l’hydrogel et comment faire la culture cellulaire 3D à l’aide de cet hydrogel. Yongsan Li est notre étudiant diplômé de notre laboratoire.

Pour fabriquer les hydrogels, synthétisez d’abord DF PEG. Dans une hotte, pesez quatre grammes de poids moléculaire 4 000 PEG dans une fiole à fond rond et ajoutez 100 millilitres de toluène. Ensuite, pour dissoudre les polymères, réchauffez la solution.

Une fois que tous les polymères se sont dissous, utilisez un évaporateur pour éliminer tous les solvants. Ensuite, répétez le processus de mélange dans le toluène et de l’évaporation deux fois de plus pour préparer les polymères PEG secs. Ensuite, à l’aide d’un agitateur magnétique et de 100 millilitres de DHF, dissolvez les polymères.

Ensuite, dissolvez 0,9 gramme de 4-carboxybenzaldéhyde dans la solution. Ensuite, dissolvez 0,07 gramme de diméthylaminopyrimide dans la solution. Ajoutez maintenant 1,25 gramme de DCC dans un tube de séchage rempli de chlorure de calcium anhydre.

Laissez maintenant la réaction remuer à température ambiante pendant environ 12 heures. Le lendemain, utilisez 500 millilitres d’éther diéthylique froid pour précipiter les solides blancs et utilisez la filtration sous vide pour recueillir les solides. Jetez le soluté et séchez les solides sous une bonne ventilation.

Ensuite, dissolvez les solides blancs dans 100 millilitres de THF. Tous les solides blancs insolubles doivent être filtrés avant de continuer. Maintenant, précipitez les solides dissous à l’aide d’éther diéthylique froid frais.

Utilisez ensuite la filtration sous vide pour recueillir les solides et laissez-les sécher à nouveau. Répétez ce processus deux à trois fois, puis placez les solides blancs dans un four de séchage sous vide pour les sécher complètement. La poudre blanche résultante est le produit final : DF PEG terminé par du benzaldéhyde.

Pour encapsuler les cellules dans l’hydrogel pour la culture, dissolvez d’abord 0,44 gramme de DF PEG dans deux millilitres de milieu de croissance cellulaire dans un tube de quatre millilitres. Incorporer le mélange dans une solution à 20 % en poids. Ensuite, stérilisez la solution.

Chargez-le dans une seringue de 10 millilitres et pressez-le à travers un filtre antibactérien de 0,22 micron. Mélangez maintenant 0,165 gramme de glycol-chitosane avec quatre millilitres de milieu de culture cellulaire, en utilisant un vortex pour obtenir une solution de chitosane à 4 % en poids. Ensuite, stérilisez la solution à l’aide d’un autre filtre antibactérien de 0,22 micron.

Ensuite, récoltez les cellules, telles que les cellules L929, à l’aide de trypsine. Lavez les cellules collectées et mettez-les en suspension dans un milieu à raison de 3,75 millions de cellules par millilitre. Dans l’étape suivante, les cellules sont plantées dans une matrice 3D.

Suivre précisément ces étapes est essentiel pour réussir. Mélangez maintenant 0,4 millilitre de suspension cellulaire avec 0,4 millilitre de solution de chitosane à l’aide d’un vortex. Placez ce mélange au centre d’une boîte de Pétri de deux centimètres de diamètre et placez 0,2 millilitre de la solution DF PEG dans la boîte.

Ensuite, utilisez une pipetage douce pour induire la formation de l’hydrogel. Évaluez la formation de l’hydrogel en inclinant la parabole et en observant la viscosité de la solution. Pour tester l’injectabilité des cellules encapsulées, faites la même préparation dans une seringue de 10 millilitres.

Ensuite, une fois l’hydrogel formé, expulsez lentement l’hydrogel à travers une aiguille de calibre 48 dans la boîte de Pétri. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu de culture au mélange hydrogel-cellules dans la plaque et transférez la plaque dans un incubateur pour la culture. Tous les deux jours, changez de média en superposant la culture cellulaire d’hydrogel 3D.

Pour préparer les cellules encapsulées dans les hydrogels pour l’imagerie, rincez d’abord les hydrogels avec un millilitre de PBS deux fois. Ensuite, colorez les hydrogels avec une solution de fluorescéine-diacétate et une solution d’iodure de propidium. Superposez 0,5 millilitre des deux solutions sur l’hydrogel et incubez l’hydrogel pendant 15 minutes à température ambiante.

Après la brève incubation avec les solutions de colorant, aspirez tous les solvants. Observez maintenant les hydrogels à l’aide de la microscopie confocale, avec une excitation à 488 nanomètres pour voir les cellules vivantes, et une excitation à 543 nanomètres pour voir les cellules mortes. Collectez des piles d’images avec des coupes de deux microns pour valider la distribution des cellules dans l’hydrogel.

Cellules L929. Une lignée cellulaire typique de souris en fibre de verre avec une rigidité tissulaire environnementale in vivo d’environ 5 600 Pascals a été encapsulée dans un hydrogel. Leur viabilité a été extrêmement élevée tout au long du processus de culture, et ils ont atteint une densité cellulaire remarquable.

Après sept jours de culture dans l’hydrogel, le nombre de cellules a augmenté de 200 % Les hydrogels qui ont été expulsés sur leur boîte de culture cellulaire à travers une aiguille de calibre 48 pouvaient s’auto-guérir pour reformer un hydrogel intégré après environ une heure. Après sept jours de culture, ces cellules ont également proliféré de façon spectaculaire. On a pu trouver des preuves d’événements de fission cellulaire dans lesquels certaines cellules semblaient divisées en deux.

Le test de mort vivante a montré une très grande viabilité, démontrant la prolifération cellulaire réussie dans l’hydrogel 3D après injection. Ce taux de prolifération cellulaire était d’environ 3/4 de celui des cellules non injectées après sept jours de culture. Ainsi, bien que la force pure lors de l’injection ait un effet négatif mesurable, les cellules injectées étaient encore assez prolifératives.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez savoir comment préparer un hydrogel auto-cicatrisant et comment utiliser cet hydrogel pour la culture cellulaire 3D et comment délivrer la cellule avec cet hydrogel. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure si elle est exécutée correctement. En suivant la meilleure procédure, d’autres méthodes, comme l’injection in vivo pour la thérapie cellulaire ou l’administration de médicaments, peuvent être effectuées.