Name: Préparation des Hydrogels injectables axée sur le Chitosan et son Application en Culture cellulaire 3D (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Découvrez la préparation d'hydrogels injectables à base de chitosan par chimie des imines dynamiques pour la culture cellulaire 3D. Cette méthode simple permet d'ajuster les propriétés mécaniques et d'explorer des applications en thérapie cellulaire.

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Cette recherche a été financée par le National Science Foundation de Chine (21474057 et 21604076).

attention : veuillez consulter toutes les fiches signalétiques (FS) avant utilisation. S’il vous plaît utiliser les pratiques de sécurité qui s’imposent lors de l’exécution des expériences de chimie, y compris l’utilisation d’une hotte de laboratoire et des équipements de protection individuelle (lunettes, gants, blouse de laboratoire, etc.). Le protocole exige des cellules standard (stérilisation, récupération de cellules, cellule passage, gel cell, cellule coloration, etc.) des techniques de manutention.
 1. préparation des Hydrogels <ol><li>synthèse du benzaldéhyde résilié fonctionnalisés di polyéthylène glycol (PEG DF) <ol><li>avant la dessiccation du PEG polymère <ol><li>peser 4,00 g PEG (MW 4 000, 1,00 mmol), transférer dans un ballon à fond rond (250 mL) et ajouter le toluène (100 mL). 
			Remarque : Autres pinces avec des poids moléculaires différents peuvent travailler pour la formation d’hydrogel mais conduira à différent raideur.</li>
			<li>Chauffer la solution par un pistolet à air chaud (ou une plaque de cuisson autour de 40 ° C) légèrement pour aider à dissoudre tous les polymères. Après que tous les polymères se dissolvent, utiliser un évaporateur pour supprimer tous les solvants. Répétez ce processus sec et dissoudre deux fois pour faire le PEG séché polymères. 
			ATTENTION : Ceci doit être effectuée sous une hotte avec un soin extrême. Le toluène est inflammable.</li>
		</ol></li> <li>Réaction de terminaison benzaldéhyde de PEG <ol><li>Ajouter un agitateur magnétique et le tétrahydrofurane (THF, 100 mL) dans le ballon et dissoudre la cheville à l’aide d’un agitateur. Ajouter 4-carboxybenzaldéhyde (0,90 g, 6,0 mmol) et la 4-diméthylaminopyridine (0,07 g, 0,6 mmol) séquentiellement aux solutions pour dissoudre tous les solides complètement.</li>
			<li>Add N, N &#39;-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 mmol) à la solution et ajouter un tube de séchage qui est rempli d’anhydre CaCl 2 au ballon. Laissez la réaction sous agitation à température ambiante (~ 20 ° C) pendant environ 12 h.</li>
		</ol></li> <li>Processus de réaction post <ol><li>Filtrer les blancs solides générés dans la solution par le vide après la réaction est terminée. Versez la solution dans l’éther diéthylique froid (500 mL) en remuant pour précipiter les solides blancs. Rassembler tous les solides blancs par filtre et sécher les solides sous une hotte.</li>
			<li>Dissoudre les solides blancs en THF à nouveau, filtrer toute insolubles solides blancs, verser la solution dans la fraîche froide diéthyléther à précipiter les solides blancs et séchez-le. Répétez cette opération deux ou trois fois et puis placez les solides blancs dans un four de séchage sous vide (20 ° C, 0,1 mbar) pour les faire sécher complètement. Recueillir la poudre blanche que le produit final : benzaldéhyde résilié PEG DF.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Préparation des hydrogels <ol><li>peser des quantités différentes de DF PEG (0,11 g, 0,028 mmol ; 0,22 g, 0,055 mmol ; 0,44 g, 0,110 mmol) dans un tube (10 mL), ajouter de l’eau désionisée (5,0 mL) et utiliser un vortex ou agitateur magnétique pour aider dissoudre le polymère.</li>
		<li>Dissoudre glycol chitosan (0,495 g, 6,18 x 10 -3 mmol) dans l’eau désionisée (15,0 mL) dans un tube (50 mL) et utiliser un vortex pendant quelques minutes pour homogénéiser la solution de chitosan (3 % en poids).</li>
		<li>Ajouter la solution de chitosan de glycol (0,2 mL, 3 % en poids) et DF PEG (0,2 mL) séquentiellement dans un tube (2,0 mL). Utiliser un vortex pour mélanger les solutions homogène aux hydrogels de forme en quelques minutes. Suivre les ratios dans le tableau 1 pour rendre les hydrogels de différentes résistances mécaniques. 
		Remarque : Utilisez la méthode tube inversé afin de déterminer si l’hydrogel a déjà formé.</li>
	</ol></li> <li>Des analyses de rhéologie <ol><li>réaliser des analyses de rhéologie sur un rhéomètre rotationnel avec une plaque d’acier parallèle (diamètre : 20 mm). Pour le test de gélification, répandre la solution de chitosan glycol (0,2 mL, 3 % en poids) sur une plaque inférieure. Ensuite, ajouter les solutions aqueuses de DF PEG (0,2 mL, 2 % en poids) uniformément goutte sur la surface de solution de chitosan et mélanger rapidement avec une pipette. Plus bas vers le bas de la plaque supérieure et commencer à tester</li>
		<li>D’hydrogel &#39; test de rigidité s, couper un hydrogel en un cercle (diamètre : 20 mm) et de mesurer le module de stockage (G &#39;) valeurs en fonction des analyses de fréquence à une déformation de 1 %. G typique &#39; valeurs à 6,3 rad s &#8722; 1 sont répertoriés dans le tableau 1. 
		Note : Effectuer les analyses de la rhéologie de l’hydrogel 0,5 h après la formation d’hydrogel pour assurer la stabilisation de la liaison dynamique de l’hydrogel.</li>
		<li>Pour l’hydrogel &#39; propriété Self guérissables s test, couper un hydrogel en morceaux et rassembler les morceaux d’auto-guérison pour une pièce intégrale. Puis couper le morceau d’hydrogel pour faire un cercle (diamètre : 20 mm) et placez-le sur le rhéomètre pour effectuer l’analyse rhéologique.</li>
	</ol></li></ol> 2. la culture cellulaire 3D en Hydrogels <ol><li>préparation des solutions de gélification hydrogel <ol><li>DF peser PEG (0,44 g, 0,11 mmol) dans un tube stérile (4,0 mL), ajouter dans les milieux de culture cellulaire (RPMI-1640, 2.0 mL) et utiliser un vortex ou agitateur pour aider à dissoudre le polymère pour obtenir la solution de polymère (20 % en poids). Chargez la solution dans une seringue (10,0 mL) et ensuite de le stériliser en le faisant passer à travers un filtre anti-microbien micron (0,22 µm).</li>
		<li>Peser le chitosane de glycol (0,165 g, 2,06 x 10 -3 mmol) dans un tube stérile (15,0 mL), ajouter dans les milieux de culture cellulaire (RPMI-1640, 4,0 mL) et vortex pour aider à dissoudre le polymère pour obtenir la solution de chitosan de glycol (4,0 % en poids). Chargez la solution dans une seringue (10,0 mL) et de la filtrer avec un filtre anti-microbien 0,22 µm.</li>
	</ol></li> <li>Culture cellulaire en hydrogels attention : effectuer tous procédures connexes sous une hotte de vitroplants de cellules. Connaissance de base de la technique de stérilisation est prévu.
	<ol><li>Préparation de la suspension de cellules <ol><li>cellules L929 de Culture en milieu RPMI-1640 additionné de 10 % BF, la pénicilline (10 mL) de 5 % à un Petri dish (diamètre 10 cm) et incuber à 37 ° C, 5 % de CO 2. Changer le milieu chaque jour avant l’utilisation.</li>
			<li>Récolter les cellules L929 avec du PBS contenant de la trypsine (0,025 % w/v) et l’EDTA (0,01 % p/v), puis centrifuger (70 x g, 5 min) et remettre en suspension les cellules dans le milieu RPMI-1640 (1,0 mL). Effectuer le comptage des cellules à l’aide de fonctionnement standard de comptage sang Conseil. Remettre en suspension les cellules pour ajuster la concentration en cellules à ~ 3,75 × 10 6 cellules/mL.</li>
		</ol></li> <li>Encapsulation de cellules dans des hydrogels <ol><li>solution de chitosan de glycol (0,4 mL) dans un tube (4,0 mL) par vortex se mêlent les suspensions de cellules L929 (0,4 mL, 3,75 x 10 6 cellules mL -1). Pipetter, la solution de chitosan L929/glycol (0,8 mL) dans le centre d’un plat de Pétri confocale (diamètre 2,0 cm). Dans le même plat, déposer les solutions de PEG DF (0,2 mL) et Pipetez doucement pour mélanger la solution et d’induire la formation de l’hydrogel. 
			Remarque : Évaluer la formation de l’hydrogel en inclinant le Pétri.</li>
			<li>Pour la culture cellulaire directe, ajouter des montants supplémentaires de milieux de culture RPMI-1640 (1,0 mL) sur le dessus de l’hydrogel. Mettre les hydrogels cellule intégrée (1,0 mL, wt 1,5 % glycol chitosan, 4,0 % en poids DF PEG, 1,5 × 10 6 cellules mL -1) dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO 2) et changer le support de tous les jours. Se préparer pour l’imagerie cellulaire jour 1, 3, 5 et 7, après l’encapsulation de cellules.</li>
		</ol></li> <li>Pour la culture post de cellule 3D en hydrogels après injection, préparer la cellule chargé hydrogel (1,0 mL, reportez-vous à l’étape 2.2.2) dans une seringue (10,0 mL, 48 G aiguille). Après les formes d’hydrogel, injecter l’hydrogel lentement dans une boîte de Pétri pour l’imagerie confocale. Ajouter un montant additionnel de milieux de culture (1,0 mL) sur le dessus de l’hydrogel et changez-la tous les jours. Mettre la boîte de Pétri dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO 2) et se préparer pour l’imagerie par la suite. 
		ATTENTION : Veuillez vérifier et suivre le protocole de fonctionnement de sécurité d’une seringue.</li>
	</ol></li> <li>Analyse de viabilité de cellules <ol><li>confocale observation <ol>
			<li>Rincer les hydrogels avec du PBS (1,0 mL) deux fois. Tacher les hydrogels avec fluorescéine diacétate (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) et solutions de propidium iodure (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) pendant 15 min. Après coloration, retirer tous les solvants.</li>
			<li>Observer les hydrogels à l’aide d’un microscope confocal sous excitation longueurs d’onde de 488 nm et 543 nm pour visualiser en direct et morts cellules, respectivement. Prendre z-piles grâce à chaque profondeur de 2 µm de l’hydrogel pour valider une répartition uniforme des cellules tout au long de. 
			Remarque : FDA taches des cellules vivantes tandis que PI taches mortes.</li>
		</ol></li> <li>Dégradent l’hydrogel (1,0 mL) avec de l’acide acétique (HAc, 3 v %, 1,0 mL) pendant 5 min et pipette dans un tube (4,0 mL). Prélever des cellules par centrifugation (70 x g, 5 min) et remettre en suspension les cellules dans un milieu de culture cellulaire RPMI-1640 (1,0 mL). Effectuer le comptage des cellules à l’aide d’un sang comptage Conseil.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+functional+groups+for+controlled+differentiation+of+hydrogel-encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells.</a> Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’hydrogel présentée dans le présent protocole (Figure 1) comporte deux grands volets : le chitosan de glycol polymère naturel et un benzaldéhyde synthétique fin gelator polymère DF PEG, qui sont les deux matériaux biocompatibles. Synthèse de DF PEG est présentée à l’aide d’une réaction de modification en une seule étape. PEG de poids moléculaire de 4 000 a été choisie dans le présent protocole dans les préoccupations de solubilité, efficacité de la modification, ainsi que raideur hydrogel. ...

Les hydrogels sont des matériaux polymères réticulés avec de grandes quantités d’eau et des propriétés mécaniques douces et ils ont été utilisés dans nombreuses applications bio-médicales1,2. Hydrogels peuvent offrir un environnement doux et humide, ce qui est très similaire à l’environnement physiologique des cellules in vivo. Par conséquent, hydrogels sont devenus l’un des plus populaires utilisés pour 3D cell culture3,4. Par rapport à la culture cellulaire 2D Pétri, culture cellulaire 3D a progressé rapidement pour offrir qu'une matrice extracellulaire (ECM) imité le micro-environnement des cellules à contacter et assembler pour la prolifération et la différenciation des fins5. En outre, hydrogels contenant des polymères naturels pourrait offrir des environnements biocompatibles et promotion pour les cellules à proliférer et se différencier3. Hydrogels dérivés de polymères synthétiques sont préférés pour leurs composants simples et claires, qui excluent des influences complexes comme les protéines d’origine animale ou des virus. Parmi tous les candidats d’hydrogel pour culture cellulaire 3D, hydrogels qui sont facilement préparés et ont une propriété compatible sont toujours préférés. La possibilité d’ajuster les propriétés de l’hydrogel pour s’adapter aux exigences différentes recherches est importante en tant que puits6.
Ici, nous introduisons une préparation facile d’un glycol axée sur le chitosan hydrogel utilisant la chimie dynamique imine, qui devient une plateforme polyvalente hydrogel pour 3D cell culture7. Dans cette méthode, bien connu biocompatible glycol chitosan servent à établir les cadres des réseaux de l’hydrogel. Ses groupes aminés sont réagit avec un benzaldéhyde résilié polyéthylène glycol comme le gelator de polymère forment des liaisons dynamiques imine comme crosslinkages des hydrogels8. Liaisons dynamiques imine peuvent former et se décomposent réversiblement et adaptée à un environnement, dotant les hydrogels avec réglage mécanique réticulé réseaux9,10,11. En raison de sa teneur en eau élevée, matériaux biocompatibles et résistances mécaniques réglables, l’hydrogel est appliquée avec succès comme un échafaudage pour les cellules L929 3D cell culture12,13. Le protocole ici en détail les procédures, y compris la synthèse des polymères gelator, hydrogel préparation, cellule intégration et mise en culture cellulaire 3D.
L’hydrogel montre également plusieurs autres fonctionnalités en raison de son crosslinkages imine dynamique, y compris ses multiples adaptés à divers bio-stimulants (acide/pH, pyridoxal dérivés de vitamine B6, papaïne protéine, etc.), ce qui indique que l’hydrogel peut être induit à se décomposer sous des conditions physiologiques8. L’hydrogel est également automatique guérissables et injectable, qui signifie l’hydrogel pourrait être administré via une méthode d’injection invasive minimale et obtenir un avantage dans la drogue et la cellule livraisons14,15. En ajoutant des additifs fonctionnels ou gelators polymère préconçu spécifique, l’hydrogel est compatible à l’obtention de propriétés spécifiques comme magnétique, température, pH réactif, etc.16,17, ce qui pourrait remplir un large gamme de besoins de recherche. Ces propriétés révèlent capacité potentielle de l’hydrogel pour être un injectable plusieurs porteuses des médicaments et des cellules dans des applications et de recherches bio-médicales in vitro et in vivo .

<table><tbody><tr><td>Glycol chitosan</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>39280-86-9</td><td>90 % degré de désacétylation</td></tr><tr><td>4-Carboxybenzaldéhyde</td><td>Shanghai Aladdin&nbsp ; Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>619-66-9</td><td>99</td></tr> % <tr><td>N, N'-dicyclohexylcarbodiimide</td><td>Shanghai Aladdin&nbsp ; Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>538-75-0</td><td>99 %</td></tr> <tr><td>Chlorure de calcium anhydre</td><td>Shanghai Aladdin&nbsp ; Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>10043-52-4</td><td>96</td></tr><tr><td>%4-diméthylamiopryidine</td><td>Shanghai Aladdin&nbsp ; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>1122-58</td><td>99 %</td></tr> <tr><td>Polyéthylèneglycol</td><td>Sino-pharm Réactif chimique</td><td>5254-43-7</td><td>99 %</td></tr> <tr><td>Tétrahydrofurane</td><td>Sino-pharm Réactif chimique</td><td>109-99-9</td><td>99</td></tr> % <tr><td>Toluène</td><td>Sino-pharm Réactif chimique</td><td>108-88-3</td><td>99 %</td></tr> <tr><td>Éther éthylique</td><td>Sino-pharm Réactif chimique</td><td>60-29-7</td><td>99 %</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>64-19-7</td><td>99</td></tr><tr><td> % Anhydrus CaCl2</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>10043-52-4</td><td>99 %</td></tr> <tr><td>Fluorescéine diacétate</td><td>Sigma</td><td>596-09-8</td><td>99 %</td></tr> <tr><td>Iodure de propidium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>25535-16-4</td><td>94 %</td></tr> <tr><td>RPMI-1640 milieu de culture</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td></td><td>0,25</td></tr> % <tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td></td><td>0,01 M</td></tr><tr><td>Pénicilline streptomycine solution</td><td>Hyclone</td><td></td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>Rhéomètre</td><td>TA Instrument</td><td></td> Microscope confocal <td>AR-G2</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td><td>710-3channel</td></tr><tr><td>L929 Cellules</td><td>ATCC</td><td></td><td>NCTC clone 929 ; Cellule L, L929, dérivé de la souche L</td></tr><tr><td>Évaporateur</td><td>EYELA</td><td></td><td>N-1100</td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 48</td><td>ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD</td><td></td><td>Microscope de calibre 48</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td></td><td>DM3000 B</td></tr><tr><td>Logiciel de microscope</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pistolet thermique</td><td>Confu</td><td></td><td>KF-5843&nbsp ;</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

préparation des hydrogels injectables axée sur le chitosan et son application en culture cellulaire 3d

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

Le protocole présente une méthode facile, efficace et polyvalente pour préparer les hydrogels axée sur le chitosan aide chimie dynamique imine. L’hydrogel est préparé en mélangeant des solutions de chitosan de glycol avec un gelator de polymère synthétisé benzaldéhyde résilié et hydrogels sont efficacement obtenus en quelques minutes à température ambiante. Par divers ratios entre chitosane de glycol, gelator de polymère et des teneurs en eau, hydrogels polyvalents avec temps de gélification différents et rigidité sont obtenus. Si endommagé, l’hydrogel peut récupérer ses apparitions et du module, en raison de la réversibilité des liaisons dynamiques imine comme crosslinkages. Cette propriété se guérissables permet l’hydrogel à être injectable car il peut être autonome guéri de morceaux pressés d’un hydrogel intégrale en vrac après le processus d’injection. L’hydrogel est également multi-sensible aux nombreux stimuli bio-actifs en raison de statuts différents de l’équilibration des liaisons dynamiques imine. Cet hydrogel a été confirmé comme bio-compatibles et cellules de fibroblaste de souris L929 étaient embarqués suivant les procédures standards et la prolifération cellulaire a été évaluée facilement par un procédé de culture cellulaire 3D. L’hydrogel peut offrir une plate-forme réglable pour différentes recherches où un imitateur physiologique d’un environnement 3D pour les cellules est profité. Ainsi que ses propriétés multiples adaptées, Self guérissables et injectables, les hydrogels peut potentiellement être appliqués comme plusieurs transporteurs des médicaments et des cellules dans les futures applications bio-médicales.

Une présentation schématique du présent protocole sur la préparation de l’hydrogel et son utilisation comme culture cellulaire 3D est offert à la Figure 1. Information des contenus et des rapports préparés avec différentes résistances mécaniques de l’hydrogel est résumée dans le tableau 1. L’hydrogel de self guérissables et propriété de rhéologie présente la raideur de l’hydrogel de module de stockage par rapport à la fréquence de test dans la Figure 2</...

Nous décrivons ici une préparation facile des hydrogels injectables axée sur le chitosan aide chimie dynamique imine. Méthodes pour ajuster la résistance mécanique de l’hydrogel et son application en culture cellulaire 3D sont présentés.

Préparation des Hydrogels injectables axée sur le Chitosan et son Application en Culture cellulaire 3D

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

L'objectif général de ce protocole est de préparer un hydrogel de chitosane injectable pour la culture cellulaire tridimensionnelle afin de l'utiliser ultérieurement dans des traitements thérapeutiques. Cette méthode peut répondre à des questions dans le domaine des hydrogels autoréparateurs, telles que la manière de fabriquer un hydrogel autoréparateur par immersion complète et la façon de l'utiliser pour la culture cellulaire en 3D. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'un hydrogel autoréparateur biocompatible peut être préparé de manière très simple, tout en permettant l'utilisation d'une culture cellulaire en 3D.Ce gel hydrophilique est également injectable, ce qui permet de l'utiliser comme vecteur pour la thérapie cellulaire. Maintenant, M. Yongsan Li va vous montrer comment préparer le gel hydrophilique et comment réaliser une culture cellulaire en 3D à l'aide de ce gel hydrophilique. Yongsan Li est notre étudiant diplômé au sein de notre laboratoire.Pour préparer les hydrogels, synthétisez d'abord le PEG DF. Dans un hotte chimique, peser quatre grammes de PEG de masse moléculaire 4 000 dans un ballon à fond rond, puis ajouter 100 millilitres de toluène. Ensuite, pour dissoudre les polymères, chauffer la solution.Une fois que tous les polymères sont dissous, utilisez un évaporateur pour éliminer tous les solvants. Ensuite, répétez deux fois supplémentaires le processus de mélange avec du toluène et d'évaporation pour préparer les polymères PEG secs. Ensuite, à l’aide d’un agitateur magnétique et de 100 millilitres de DHF, dissolvez les polymères.Ensuite, dissolvez 0,9 gramme de 4-carboxybenzaldéhyde dans la solution. Puis, dissolvez 0,07 gramme de diméthylaminopyrimidine dans la solution. Ajoutez maintenant 1,25 gramme de DCC dans un tube de dessiccation rempli de chlorure de calcium anhydre.Laissez maintenant la réaction sous agitation à température ambiante pendant environ 12 heures. Le lendemain, utilisez 500 millilitres d'éther diéthylique froid pour précipiter les solides blancs, puis récupérez les solides par filtration sous vide. Éliminez le soluté et séchez les solides dans un endroit bien ventilé.Ensuite, dissoudre les résidus blancs dans 100 millilitres de THF. Tout résidu blanc insoluble doit être filtré avant de poursuivre. Précipiter maintenant les résidus dissous à l’aide d’éther diéthylique froid et frais.Ensuite, utiliser la filtration sous vide pour recueillir les solides, puis les laisser sécher à nouveau. Répéter ce processus deux à trois fois, puis placer les solides blancs dans une étuve sous vide pour les sécher complètement. La poudre blanche obtenue est le produit final : DF PEG à extrémité benzaldéhyde.Pour encapsuler les cellules dans l'hydrogel pour la culture, dissoudre d'abord 0,44 gramme de DF PEG dans deux millilitres de milieu de croissance cellulaire dans un tube de quatre millilitres. Homogénéiser le mélange par vortexage afin d'obtenir une solution à 20 % en poids. Ensuite, stériliser la solution.Introduisez-le dans une seringue de 10 millilitres, puis faites-le passer à travers un filtre bactiorétentif de 0,22 micron. Mélangez ensuite 0,165 gramme de glycol-chitosane avec quatre millilitres de milieu de culture cellulaire, en utilisant un vortex pour obtenir une solution de chitosane à 4 % en poids. Stérilisez ensuite la solution à l’aide d’un autre filtre bactiorétentif de 0,22 micron.Ensuite, récoltez les cellules, par exemple les cellules L929, à l’aide de trypsine. Lavez les cellules recueillies et resuspendez-les dans un milieu à raison de 3,75 millions de cellules par millilitre. À l’étape suivante, les cellules sont implantées dans une matrice 3D.Suivre précisément ces étapes est essentiel pour obtenir un résultat concluant. Mélangez maintenant 0,4 millilitre de la suspension cellulaire avec 0,4 millilitre de solution de chitosane à l’aide d’un vortex. Ajoutez ce mélange au centre d’une boîte de Pétri de deux centimètres de diamètre à l’aide d’une pipette, puis ajoutez 0,2 millilitre de la solution DF PEG dans la boîte à l’aide d’une pipette.Ensuite, utiliser un pipetage doux pour induire la formation de l'hydrogel. Évaluer la formation de l'hydrogel en inclinant la boîte et en observant la viscosité de la solution. Pour tester l'injectabilité des cellules encapsulées, réaliser la même préparation dans une seringue de 10 millilitres.Ensuite, une fois que l'hydrogel est formé, expulsez lentement l'hydrogel à l'aide d'une aiguille de 48 gauge dans la boîte de Pétri. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu de culture au mélange hydrogel-cellules dans la plaque, puis transférez la plaque dans un incubateur pour la culture. Tous les deux jours, changez le milieu en recouvrant la culture cellulaire tridimensionnelle dans l'hydrogel.Pour préparer les cellules encapsulées dans les hydrogels en vue de l'imagerie, rincez d'abord les hydrogels deux fois avec un millilitre de PBS. Ensuite, colorez les hydrogels avec une solution de diacétate de fluorescéine et une solution d'iodure de propidium. Recouvrez les hydrogels de 0,5 millilitre de chacune des solutions et incubez-les pendant 15 minutes à température ambiante.Après l'incubation brève avec les solutions de coloration, aspirez tous les solvants. Observez maintenant les hydrogels par microscopie confocale, avec une excitation à 488 nanomètres pour visualiser les cellules vivantes, et une excitation à 543 nanomètres pour visualiser les cellules mortes. Acquérez des séries d'images avec des tranches de deux micromètres pour valider la répartition des cellules dans l'hydrogel.Cellules L929. Une lignée cellulaire typique de fibroblastes murins, cultivée dans un environnement in vivo dont la rigidité tissulaire est d’environ 5 600 pascals, a été encapsulée dans un hydrogel. Leur viabilité est restée extrêmement élevée tout au long du processus de culture, et elles ont atteint une densité cellulaire remarquable.Après sept jours de culture dans l'hydrogel, le nombre de cellules a augmenté de 200 %. Les hydrogels expulsés dans leur boîte de culture cellulaire à l’aide d’une aiguille de 48 gauge pouvaient s’auto-réparer et reformer un hydrogel intégré après environ une heure. Après sept jours de culture, ces cellules se sont également fortement multipliées. On pouvait observer des événements de fission cellulaire au cours desquels certaines cellules semblaient divisées en deux.Le test de viabilité a montré une viabilité très élevée, démontrant une prolifération cellulaire réussie dans l'hydrogel 3D après injection. Ce taux de prolifération cellulaire était d'environ les 3/4 de celui des cellules non injectées après sept jours de culture. Ainsi, bien que la force de cisaillement durant l'injection ait un effet négatif mesurable, les cellules injectées restaient tout de même fortement prolifératives.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez savoir comment préparer un hydrogel auto-réparable et comment utiliser cet hydrogel pour la culture cellulaire en 3D ainsi que pour la délivrance de cellules à l’aide de cet hydrogel. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d'une heure si elle est effectuée correctement. En suivant les meilleures pratiques, d'autres méthodes, telles que l'injection in vivo pour la thérapie cellulaire ou la délivrance de médicaments, peuvent être réalisées.

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Fabrication de microgels de chitosane-genipine à taille contrôlée et sans émulsion pour des applications d’ingénierie tissulaire

Découvrez la préparation d'hydrogels injectables à base de chitosan par chimie des imines dynamiques pour la culture cellulaire 3D. Cette méthode simple permet d'ajuster les propriétés mécaniques et d'explorer des applications en thérapie cellulaire.

Préparation des Hydrogels injectables axée sur le Chitosan et son Application en Culture cellulaire 3D

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