Name: Désensibilisation et récupération des photorécepteurs décrevisses à la livraison dun stimulus léger (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Découvrez la désensibilisation et la récupération des photorécepteurs d'écrevisses selon le temps circadien par enregistrements électriques intracellulaires. Cette méthode permet d'étudier les propriétés électrophysiologiques des photorécepteurs.

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Ces travaux ont été soutenus par la subvention DGAPA-UNAM IN224616-RN224616. Les auteurs remercient Mme Josefina Bolado, chef du département de traduction scientifique de papier, de Division de Investigacion à Facultad de Medicina, UNAM, pour avoir édité la version anglaise de ce manuscrit.

REMARQUE : Les expériences sont conformes aux Lois de protection des animaux du Mexique.
1. Configuration expérimentale
<ol><li>Connexions générales<ol>
<li>Connectez l'amplificateur à un ordinateur approprié au moyen d'un convertisseur analogique au numérique et utilisez un oscilloscope pour surveiller l'expérience (Figure 1).</li>
		<li>Connectez le phototimulator au convertis A/D.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chambre d'enregistrement<ol>
<li>Placez la chambre d'enregistrement sur une table anti-vibration et placez-la à l'intérieur d'une cage de Faraday. REMARQUE : Cela empêche les vibrations mécaniques et les bruits électriques qui peuvent affecter l'enregistrement. Notre cage de Faraday était faite de grillage noirci. Une chambre d'enregistrement en acrylique faite maison, 2 mL, est utilisée (Figure 2).</li>
		<li>Préparer la solution de bain pour maintenir la préparation en vie13: 205 mM NaCl; 5 mM KCl; 2 mM MgSO4; 13 mM CaCl2; 5 mM Hepes-NaOH, pH 7,3. REMARQUE: La solution n'inclut pas le dextrose ou tout bouillonnement de 95% O2, 5% CO2 mélange parce que la procédure expérimentale est assez courte pour détecter les dommages par l'enregistrement électrique (voir l'étape 4.2.3 pour l'exhaustivité).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Électrodes<ol>
<li>Utilisez une électrode enduite de fil d'argent recouverte de chlorure comme électrode de référence REMARQUE : Le revêtement de chlorure d'argent est nécessaire pour permettre la réaction d'électrode : AgCl (s) ete ↔Ag(s) et Cl-.</li>
		<li>Sablez un fil d'argent (épaisseur de 1 mm, longueur de 10 cm) avec un papier émeri de qualité fine afin de nettoyer sa surface.</li>
		<li>Rincer le fil d'argent avec de l'eau distillée.</li>
		<li>Immerger le fil d'argent propre dans une solution d'hypochlorite de sodium de 4 à 6 % (NaClO) jusqu'à ce qu'il semble foncé (environ 20 min).</li>
		<li>Utilisez de fines pipettes en verre remplies d'une solution d'électrolyte (2,7 M KCl) comme électrode intracellulaire.</li>
		<li>Tirez un tube capillaire en verre (diamètre interne de 1 mm) à l'aide d'une tireuse micropipette pour obtenir une fine pointe avec une petite ouverture (0,01-0,1 m)14.</li>
		<li>Remplissez le verre capillaire tiré d'une solution de 2,7 M KCl. Remplissez d'abord par capillarité (plongez la pointe de pipette dans la solution de 2,7 M KCl) puis remplissez la moitié de la pipette avec une aiguille d'injection fine. Si nécessaire, appuyez sur la pipette d'électrode pour éliminer les bulles d'air.</li>
		<li>Connectez l'électrode à son support. Connectez le support à la tête de l'amplificateur avec l'amplificateur. Placez le poste de tête porte-électrodes avec un micromanipulateur 3D stable. Abaissez l'électrode jusqu'à ce que la solution de bain couvre sa pointe. REMARQUE : L'électrode doit avoir une orientation verticale</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez le mode Pont de l'amplificateur (dans la section Mode de l'amplificateur, appuyez sur le bouton Bridge) et mesurez la résistance à l'électrode. Assurez-vous que la résistance est d'environ 50 M11. REMARQUE : Cette taille d'électrode permet un enregistrement électrique de bonne qualité avec des dommages limités à la cellule.</li>
	<li>Annuler le courant de compensation et compenser les transitoires capacitifs à l'aide du bouton Position de fixation dans la section Tension Clamp de l'amplificateur, et le bouton de neutralisation de la capacité dans la section Microélectrode 1 de l'amplificateur.</li>
	<li>Système de superfusion<ol>
<li>Verser la solution de bain (étape 1.2.2) dans un réceptacle approprié (une bouteille de sérum de 250 ml) et la connecter à un ensemble de tubes d'irrigation (3,2 mm de diamètre interne), reliant ainsi la chambre d'enregistrement. Utilisez un système de superfusion gravitationnel. Réglementer le débit à 0,5 ml/s.</li>
		<li>Connectez la chambre à un dispositif d'aspiration. Réglementer le système d'aspiration de solution de telle sorte que le volume total de la chambre d'enregistrement ne varie pas. Utilisez une pompe à vide pour l'aspiration. REMARQUE : Un volume constant dans la chambre d'enregistrement est important pour maintenir les capacitances errantes constantes tout au long de l'expérience.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Matériel biologique
Remarque : Utilisez des écrevisses adultes P. clarkii (7-10 cm de long) au stade intermolt du sexe indistincte.
<ol><li>Heure circadienne<ol>
<li>Un mois avant les expériences, maintenir 100 écrevisses sous un cycle sombre de 12 h/12 h15 (lumière blanche, 2,4 kW/m2). REMARQUE : Un mois est suffisant pour synchroniser la population d'écrevisses.</li>
		<li>Déterminer le temps circadien de la population d'écrevisses en évaluant l'amplitude des électrorétinogrammes de cinq animaux choisis au hasard15. REMARQUE: 0 h temps circadien (CT 0) indique le début d'une journée subjective, c'est-à-à-d., le temps au cours duquel un organisme est normalement actif16,17,18,19 ( Figure3). L'écrevisse est un animal nocturne, donc sous un cycle sombre de 12 h/ 12 h, il est actif pendant la phase sombre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procédure d'isolement Eyestalk<ol>
<li>Au moment circadien désiré, anesthésiez une écrevisse sélectionnée par immersion dans l'eau du robinet à 0-4 oC, pendant 15 min.</li>
		<li>Au moyen d'un ciseaux fins, détachez le regard de la base.</li>
		<li>Accédez à la rétine à l'aide d'une lame de rasoir pour faire une ouverture (1 mm2) dans la cornée dorsale.</li>
		<li>Placez le couvre-yeux au centre de la chambre d'enregistrement (le trou recouvert de silicone) avec l'ouverture d'accès à la rétine sur le dessus de la chambre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gardez le regard dans l'obscurité constante pendant 20 min. REMARQUE : 20 min est suffisamment de temps pour que la cellule photoréceptrice soit entièrement adaptée à l'obscurité.</li>
</ol>3. Impaling photorécepteur
<ol><li>Mettez le microélectrode et l'axe longitudinal de la tige des yeux parallèles de telle sorte que le microélectrode est centré pour l'accès à la rétine. Utilisez un microscope stéréoscopique (10X) pour placer les appareils dans la configuration correcte.</li>
	<li>Surveillez la différence de tension entre les électrodes de référence et d'enregistrement en sélectionnant le modepont 11 de l'amplificateur.</li>
	<li>Baissez l'électrode dans le bain et placez-la par la suite juste au-dessus de la rétine.</li>
	<li>Éloignez le microscope et placez la lampe phototimulator parallèle à l'axe longitudinal de la bande oculaire. REMARQUE : La distance entre la lampe et la chambre de superfusion est d'environ 15 cm.</li>
	<li>Abaissez lentement le microélectrode jusqu'à ce qu'une chute soudaine de tension soit détectée. REMARQUE : Une chute de tension d'environ 50 mV indique l'empalement d'une cellule photoréceptrice saine.</li>
	<li>Fournir un flash lumineux d'essai (lumière blanche, 7,2 kW/m2, durée de 10 euros) pour enregistrer le potentiel récepteur du photorécepteur. REMARQUE : Le potentiel de récepteur du photorécepteur est un potentiel de dépolarisation de 10 à 15 mV d'amplitude et de 300 ms de durée(figure 4).</li>
</ol>4. Enregistrement électrique
<ol><li>Assurez-vous que les cellules photoréceptrices sont totalement adaptées aux conditions sombres (voir l'étape 2.3).<ol>
<li>Fournir un flash de lumière de test toutes les 2 minutes. Automatisez le temps entre les flashs en choisissant une valeur adéquate (120 s) de « temps entre les épisodes » dans le logiciel d'acquisition de données. REMARQUE : 2 min est le temps nécessaire pour permettre la récupération totale des courants sous-jacents à la réponse électrique du photorécepteur.</li>
		<li>Surveillez le potentiel de la membrane de repos, ainsi que l'amplitude et la durée du potentiel récepteur. Supposons que le photorécepteur est complètement adapté une fois que le potentiel de la membrane, l'amplitude et la durée du potentiel du récepteur demeurent inchangés. Les yeux précédemment maintenus dans l'obscurité constante pendant 20 min (étape 2.3) complètent leur adaptation en environ 5 min.</li>
		<li>Arrêtez de stimuler la cellule 2 min avant d'enregistrer le courant lumineux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enregistrement actuel<ol>
<li>Clamp la tension à la valeur potentielle mesurée de la membrane de repos de la cellule en sélectionnant "Holding amplitude" dans le logiciel d'acquisition de données (dans Waveform sur la section Analog Output Channel).</li>
		<li>Sélectionnez le mode dSEVC de l'amplificateur. Dans la section Mode de l'amplificateur, sélectionnez le bouton SEVC et basculez le levier vers la position Discont SEVC.</li>
		<li>Réglez le taux de commutation à 500-1000 Hz (en utilisant le bouton D'ajustement de taux de l'amplificateur), tel que déterminé par la vitesse de l'électrode11.</li>
		<li>Délivrez un flash lumineux, et observez l'afflux d'ions évoqué. REMARQUE : Il s'agit du courant de transduction ou de transduction allumé par la lumière (figure 5).</li>
		<li>Retour au mode Bridge sur l'amplificateur et enregistrer un potentiel récepteur en envoyant un flash lumineux (voir la section 3). Assurez-vous que la cellule photoréceptrice est totalement adaptée aux conditions sombres. Mesurer les caractéristiques potentielles des récepteurs (amplitude et durée) et comparer avec les premières mesures. Supposons que la cellule photoréceptrice empalée est une cellule saine si elles ont les mêmes caractéristiques. REMARQUE : Après l'ablation de la tige des yeux, la préparation biologique est viable pendant les 2 heures suivantes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protocole de deux impulsions : Mesurez la récupération de la désensibilisation à l'égard d'un protocole à deux éclairs. REMARQUE : Le protocole de deux flash-lumière est semblable au protocole standard de tension à deux impulsions utilisé pour mesurer la récupération de l'inactivation des canaux à rayons de tension20. Le premier flash lumineux provoque un changement temporaire de la sensibilité de la cellule photoréceptrice et le second flash évalue l'état de la conductance activée par la lumière.<ol>
<li>Apportez une paire d'impulsions lumineuses. Appliquer le deuxième flash après un intervalle de temps souhaité (de 300 ms à 2 min).</li>
		<li>Numérisez les courants à l'échantillonnage de 10 KHz avec le logiciel d'acquisition de données et enregistrez les données pour l'analyse hors ligne11. REMARQUE : Une table avec les valeurs de configuration du logiciel est incluse comme matériel supplémentaire.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Analyse des données
<ol><li>Cinétique du courant lumineux<ol>
<li>Mesurer trois paramètres actuels : la latence d'activation L, le temps écoulé entre la livraison du flash lumineux jusqu'à ce que le courant atteigne 10 % de son amplitude maximale (figure 5); amplitude maximale de courant ou maximum Ip; et temps de désensibilisation constant T. Mesurer le temps de désensibilisation constant () en adaptant la phase de décomposition actuelle à : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56258/56258eq1.jpg"> où, A -I (t-0) est une constante positive (Figure 5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Désensibilisation et récupération Remarque : Le recouvrement de la désensibilisation a été évalué comme le rapport p2/p1, où p1 est le paramètre pertinent (L, Ip, ou T) du courant de contrôle, et p2 est le paramètre correspondant du deuxième courant de test.<ol>
<li>Terrain p2/p1 (l'un ou l'autre L, ip, ou T) en fonction du temps entre les impulsions.</li>
		<li>Selon le paramètre, adaptons les points de chaque parcelle à : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56258/56258eq2.jpg"> ou à : <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56258/56258eq3.jpg">
</li>
		<li>Utilisez un test statistique approprié pour déterminer le nombre de termes exponentiels requis pour s'adapter aux données expérimentales.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Nous n'avons rien à divulguer.

L'écrevisse s'est avérée être un excellent modèle en raison de sa capacité à survivre dans des conditions non naturelles. Il est facile d'accéder aux analyses électrophysiologiques in vivo et in vitro. En outre, les crustacés sont un groupe favorable pour la recherche neurobiologique dans le domaine de la chronobiologie comparative21.
Dans cet article, l'étude de la désensibilisation et de la récupération du courant de transduction-activé par la lumièr...

Pour être perçu comme un stimulus visuel, la lumière atteignant les yeux doit être transduie dans un signal électrique. Ainsi, dans tous les organismes visuels, la lumière déclenche un ion-courant de transduction, qui à son tour produit un changement dans le potentiel membranaire des cellules photoréceptrices, le potentiel dit de récepteur. Pour cette raison, la sensibilité de la lumière de l'œil dépend principalement de l'état de la conductance activée par la lumière, qui peut être disponible pour être activé ou désensibilisé.
Dans les photorécepteurs d'écrevisses, la lumière déclenche un courant lent, transitoire et ionique1. Lors de l'illumination, le courant de transduction surgit après un décalage ou une latence avant d'atteindre son maximum; par la suite, il se désintègre, comme les canaux de transduction tombent dans un état désensibilisé dans lequel ils ne répondent pas à d'autres stimulus léger2. C'est-à-dire que la lumière, en plus d'activer le courant de transduction responsable de la vision, induit également une décrement transitoire de la sensibilité des cellules photoréceptrices. La désensibilisation peut représenter un mécanisme de protection général contre la surexposition à un stimulus adéquat. La sensibilité de l'œil à la lumière est récupérée lorsque la conductance de la transduction se remet d'une désensibilisation.
L'enregistrement intracellulaire est une technique utile pour mesurer l'activité électrique des cellules excitables3,4,5,6,7,8. Bien que l'enregistrement intracellulaire soit devenu moins fréquent avec l'avènement de la technique de patch-clamp9, il est toujours une approche commode quand les cellules sont soit difficiles à isoler, ou présentent une géométrie qui rend la formation des giga-scellements patch-clamping difficile(c.-à-d., joints ou étroits-contacts entre l'électrode de correction et les membranes avec la résistance électrique de l'ordre de 109ohms). Des exemples de ces derniers sont les spermatozoïdes10 et les cellules photoréceptrices étudiées. D'après notre expérience, les photorécepteurs Procambarus clarkii sont difficiles à isoler et à conserver dans la culture primaire; en outre, ce sont des tiges minces qui rendent la formation giga-sceau difficile à atteindre. Dans les enregistrements intracellulaires, une électrode pointue est avancée dans une cellule qui est maintenue en place par le tissu environnant. L'électrode est coupée par les circuits de commutation à grande vitesse de l'amplificateur, de sorte que le courant est échantillonné entre les impulsions de tension. Ce mode est connu sous le nom de pince discontinu de tension à une électrode (mode dSEVC)11. La résistance élevée (petite ouverture) de l'électrode entrave l'échange de diffusion entre la cellule et les solutions de pipette, ce qui donne une perturbation minimale du milieu intracellulaire3. Un inconvénient potentiel de cette technique est que l'insertion d'électrode peut produire un courant de fuite non sélectif ; par conséquent, il faut prendre soin d'éviter l'enregistrement à partir de cellules où la taille du courant de fuite peut interférer avec les mesures prévues4,12.
Ici, nous utilisons des tiges isolées d'écrevisses pour évaluer la désensibilisation et la récupération de la conductance d'ion activée par la lumière en effectuant des enregistrements électriques intracellulaires des cellules photorécepteurs dans des conditions de pince de tension.

<table><tbody><tr><td>Axoclamp2A&nbsp ;</td><td>Axon Instruments Inc</td><td></td><td>Amplificateur</td></tr><tr><td>Digidata 1200 Interface</td><td>Axon Instruments Inc</td><td></td><td>Numériseur Oscilloscope</td></tr><tr><td>TDS430A</td><td>Tektronix</td><td></td><td>Oscilloscope analogique</td></tr><tr><td>Photostimulateur PS33 Plus</td><td>Extracteur de lampe d’herbe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC-100</td><td>Narishige</td><td></td><td>Extracteur de micropipette</td></tr><tr><td>Extracteur P-97</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Extracteur de micropipette</td></tr><tr><td>Tube capillaire en verre Kimax-51</td><td>Kimble Products</td><td>34502</td><td>0.8, 1.10, 100 mm</td></tr><tr><td>HS-2 Headstage</td><td>Axon Instruments Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Headstage Micromanipulateur MX-4</td><td>Narishige</td><td></td><td>Micromanipulateur mécanique</td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>pClamp</td><td>Axon Instruments Inc</td><td></td><td>Logiciel d’acquisition de données pour l’interface digidata 1200</td></tr><tr><td>Clampfit</td><td>Axon Instruments, Inc</td><td></td><td>Logiciel d’analyse lié à pClamp</td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab Corp.</td><td></td><td>Logiciel d’analyse de données et de représentation graphique</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>>99,5</td></tr> %<tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma</td><td>P-9333</td><td>Minimum 99</td></tr><tr><td> %Sulfate de magnésium</td><td>Sigma</td><td>M7506</td> Minimum <td>99,5</td></tr> %<tr><td>Chlorure</td><td>de calcium Sigma</td><td>C5080</td><td>Minimum 99,0</td></tr> %<tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H7523</td><td>>99,5 %</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>98,00 %</td></tr><tr><td>Solution d’hypochlorite de sodium</td><td>Sigma</td><td>425044</td><td>Chlore disponible, 10-15 %;</td></tr></tbody></table>

désensibilisation et récupération des photorécepteurs d'écrevisses à la livraison d'un stimulus léger

Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus

Une méthode pour étudier la désensibilisation et la récupération des photorécepteurs d'écrevisses est présentée. Nous avons exécuté des enregistrements électriques intracellulaires des cellules de photorécepteur dans les yeux isolés utilisant la configuration de tension-clamp simple discontinuous d'électrode-switched. Tout d'abord, avec une lame de rasoir, nous avons fait une ouverture dans la cornée dorsale pour avoir accès à la rétine. Par la suite, nous avons inséré une électrode de verre à travers l'ouverture, et pénétré une cellule comme indiqué par l'enregistrement d'un potentiel négatif. Le potentiel de membrane a été serré au potentiel de repos du photorécepteur et une impulsion lumineuse a été appliquée pour activer des courants. Enfin, le protocole de deux flash s'est vu utilisé pour mesurer la désensibilisation et la récupération actuelles. Le premier flash lumineux déclenche, après une période de décalage, le courant ionique de transduction qui, après avoir atteint un pic d'amplitude, se désintègre vers un état désensibilisé; le deuxième flash, appliqué à intervalles de temps variables, évalue l'état de la conductance activée par la lumière. Pour caractériser le courant lumineux, trois paramètres ont été mesurés : 1) la latence (le temps écoulé entre la livraison du flash lumineux et le moment où le courant atteint 10 % de sa valeur maximale); 2) le courant de pointe; et 3) temps de désensibilisation constant (constante de temps exponentielle de la phase actuelle de décomposition). Tous les paramètres sont affectés par la première impulsion.
Pour quantifier le rétablissement de la désensibilisation, le rapport p2/p1 a été employé par rapport au temps entre les impulsions. p1 est le courant de pointe évoqué par la première impulsion lumineuse, et p2 est le courant de pointe évoqué par la deuxième impulsion. Ces données ont été adaptées à une somme de fonctions exponentielles. Enfin, ces mesures ont été effectuées en fonction du temps circadien.

Tout d'abord, un potentiel récepteur représentatif des cellules photoréceptrices d'écrevisses est obtenu (figure 4). Par la suite, un flash lumineux d'essai a été appliqué pour déclencher le courant de transduction de lumière (figure 5). Le courant de transduction cationique1 s'active après un décalage, atteignant un maximum et tombe par la suite lentement dans un état désensibilisé absorbant à partir duqu...

Un protocole pour l'étude de la désensibilisation et de la récupération de sensibilité des photorécepteurs d'écrevisses en fonction du temps circadien est présenté.

Désensibilisation et récupération des photorécepteurs d'écrevisses à la livraison d'un stimulus léger

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor ...

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la désensibilisation et la récupération de sensibilité des photorécepteurs d’écrevisses en fonction du temps circadien, en utilisant des enregistrements électriques intercellulaires de cellules photoréceptrices dans des stocks oculaires isolés, en utilisant la configuration discontinue de pince à tension unique commutée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, telles que la dépendance circadienne du temps de tant de propriétés électrophysiologiques des photorécepteurs dans l’inactivation et la récupération. Le principal avantage de cette technique, c’est qu’elle permet de mesurer l’activité électrique des photorécepteurs.Malgré la difficulté d’isoler les cellules et sans déranger le milieu intracellulaire. Les docteurs Carolina Barriga-Montoya et Araceli de la O-Maritnez, collègues de notre laboratoire, feront la démonstration de cette procédure. Pour préparer l’électrode intracellulaire, tirez sur le tube capillaire en verre à l’aide d’un puller micropipette pour obtenir une pointe fine avec une petite ouverture.Ensuite, remplissez le verre capillaire tiré avec une solution de chlorure de potassium de 2,7 molaires par capillarité, puis remplissez la moitié de la pipette avec une aiguille d’injection fine. Si nécessaire, appuyez sur la pipette d’électrode pour éliminer les bulles d’air. Après cela, placez l’électrode sur son support.Connectez le support à l’étage avant de l’amplificateur avec l’amplificateur. Par la suite, placez le premier étage du support d’électrode avec un micromanipulateur 3D stable. Baisser l’électrode jusqu’à ce que la solution de bain couvre sa pointe.Sélectionnez le mode pont de l’amplificateur et mesurez la résistance aux électrodes. Assurez-vous que la résistance est d’environ 50 mégaohms. Annulez le courant offset et compensez les transitoires capacitifs à l’aide du bouton de position de fixation dans la pince de tension de section de l’amplificateur et du bouton neutralisation de capacitance dans la section Microelectrode 1 de l’amplificateur.Pour construire le système de super fusion, versez la solution de bain dans un réceptacle approprié et connectez-le à un ensemble de tubes d’irrigation, reliant ainsi la chambre d’enregistrement. Utilisez un système de superfusion par gravité. Réglementez le débit à 0,5 millilitres par seconde.Connectez la chambre à un dispositif d’aspiration. Réglementez le système d’aspiration de solution avec une pompe à vide de telle sorte que le volume total de la chambre d’enregistrement ne varie pas. Pour isoler le stock oculaire d’une écrevisse adulte, détachez-le de la base avec une paire de ciseaux fins.Faire une ouverture d’un millimètre carré dans la cornée dorsale à l’aide d’une lame de rasoir pour accéder à la rétine. Ensuite, placez le stock oculaire au centre de la chambre d’enregistrement avec l’ouverture de la rétine face vers le haut. Gardez le stock d’yeux dans l’obscurité pendant 20 minutes.Placez la microélecrodée parallèlement à l’axe longitudinal des stocks oculaires de telle sorte que la microélecrode soit centrée pour accéder à la rétine. Utilisez un microscope stéréoscopique pour placer les appareils dans la bonne configuration. Ensuite, surveillez la différence de tension entre les électrodes de référence et d’enregistrement en sélectionnant le mode pont de l’amplificateur.Abaissez l’électrode dans le bain et placez-la juste au-dessus de la rétine. Retirez le microscope et placez la lampe photostimulateur parallèle à l’axe longitudinal des stocks oculaires. Ensuite, abaissez lentement la microélecrode jusqu’à ce qu’une chute de tension soudaine soit détectée.Par la suite, fournir un flash de lumière d’essai pour enregistrer le potentiel récepteur du photorécepteur. Pour obtenir des enregistrements appropriés des courants lumineux, il est essentiel de faire une bonne déficience d’une cellule photoréceptrice saine. Dans cette procédure, serrez la tension au potentiel mesuré de membrane de repos de la cellule en sélectionnant l’amplitude de fixation dans le logiciel d’acquisition de données.Ensuite, sélectionnez le mode DSEVC de l’amplificateur. Dans la section mode de l’amplificateur, sélectionnez le bouton SEVC et passez le levier au Discont. position SEVC.Réglez le taux de commutation à 500 à 1000 hertz, tel que déterminé par la vitesse de l’électrode. Après cela, livrer un flash de lumière et d’observer le flux d’ion évoqué. Ensuite, livrer une paire d’impulsions lumineuses et appliquer le deuxième flash après un intervalle de temps désiré.Numérisez les courants à l’échantillonnage de 10 kilohertz avec le logiciel d’acquisition de données et enregistrez les données pour analyse hors ligne. Il est indiqué ici un protocole à deux impulsions. Des stimulus légers ont été appliqués à zéro millisecondes et 700 millisecondes.Ce chiffre montre la récupération de la désensibilisation. Voici la reprise de la latence, voici le pic de récupération actuelle, et voici le temps de désensibilisation constante tau récupération. Des expériences ont été réalisées à zéro heure circadienne.Ce chiffre montre la récupération de la désensibilisation en fonction du temps circadien. Il s’agit de la récupération iP, c’est la récupération L, et c’est la récupération tau, et ce graphique montre les constantes de temps pondérées. Les processus biphasiques sont marqués d’une flèche.Une fois maîtrisée, cette technique peut être effectuée en deux heures, si elle est faite correctement. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de viser un faible bruit et un faible courant de fuite, l’affaiblissement photorécepteur. Suivant cette procédure, d’autres méthodes, comme les analyses pharmacologiques, peuvent être faites afin de répondre à d’autres questions, comme la participation de canaux particuliers, récepteurs ou voies de signalisation.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la neurobiologie pour explorer la dépendance circadienne du temps des propriétés électrophysiologiques des cellules photoréceptrices. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier la désensibilisation et la récupération du courant de transduction activé par la lumière en utilisant la technique d’enregistrement intracellulaire.

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