Name: Un protocole universel pour à grande échelle gRNA bibliothèque Production provenant de toute Source d’ADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Découvrez la méthode CORALINA pour produire des bibliothèques d'ARN guide complètes par digestion enzymatique de l'ADN purifié. Cette technique économique simplifie la génération de gRNA pour les écrans CRISPR.

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Les auteurs tiennent à remercier Prof. Dr. Stephan Beck et Prof. Dr. Magdalena Goetz pour leur contribution, d’aide et de support dans l’élaboration de la méthode CORALINA, Maximilian Wiessbeck et Valentin Baumann des commentaires utiles. Le travail a été soutenu par la DFG (STR 1385/1-1).

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<li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORALINA%3A+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).</li>
<li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li>
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<li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

CORALINA peut servir à générer des bibliothèques gRNA à grande échelle par la digestion nucléasique contrôlé d’ADN cible et en vrac clonage de fragments bicaténaire qui en résulte. Inférence statistique indique que beaucoup plus de 10 séquences gRNA individuels de7 ont déjà été clonés avec succès en utilisant le protocole à main9. CORALINA peut être personnalisé de plusieurs façons. Le choix du modèle ADN définit la région cible et la complexité maximale de la bibliothèque générée. Utilisant ce protocole, CORALINA bibliothèques ont été générées précédemment à partir de l’homme et l’ADN génomique de souris9. Résultats représentatifs présentés ici représentent la génération d’une bibliothèque CORALINA d’ADN purifié. Personnalisation supplémentaire est possible par le choix de séquences de gRNA expression vector et éditeur de liens. Nous avons déjà testé trois paires différentes de longueurs de l’éditeur de liens pour l’assemblage de Gibson avec petites variations en efficacité9.
En raison de leur origine de l’ADN bulk digéré, protospacer de CORALINA gRNAs ne sont généralement pas exactement 20 bp en longueur, mais montrent une distribution de longueur avec une moyenne qui dépend à la fois sur les paramètres de la digestion MNase ainsi que la taille de l’excision fait du gel de la PAGE s. l’exemple représentatif indiqué sur la Figure 2 b et C, représente des fragments d’une longueur médiane entre 19 et 27 ans bp. Dans notre expérience, la longueur des fragments est fidèlement préservée par le gRNA généré protospacer9. Alors que des fragments plus courts que 20 bp doit être évitée en raison de taux hors cible plus gRNAs qui en résulte, plus longs fragments risquent beaucoup moins de problème pour les applications en aval, puisqu’il a été démontré que gRNAs avec protospacers tant que 45 bp sont toujours fonctionnelle de9.
Les deux étapes les plus critiques dans le protocole CORALINA sont la sélection de la taille des fragments digérés MNase et étapes de clonage. Génération de fragments qui sont trop courte (p. ex. moyenne moins de 18 ans bp) ou intégration des vecteurs d’expression trop vide gRNA rendra la bibliothèque inutile. Ainsi, il est important optimiser l’étape de digestion MNase (Figure 2 a), pour surveiller l’excision (Figure 2 b, C), vérifiez pour la digestion complète du squelette gRNA vector et y compris aucun fragment des contrôles tout au long du protocole. Une attention particulière doit également être prises pour préserver la représentation de la bibliothèque gRNA. Un goulot d’étranglement courant de génération de la bibliothèque est en général le transfert efficace des plasmides dans les bactéries pour l’amplification. Ainsi, de grandes quantités de bactéries possédant des compétences excellent et un grand nombre d’événements de l’électroporation individuels sont nécessaires pour réaliser un grand nombre de clones gRNA.
Nouvelles stratégies pour la production de bibliothèque gRNA sera nécessaires pour récolter tout le potentiel des approches de dépistage basé sur CRISPR dans les prochaines décennies. Il y a une forte demande pour des méthodes efficaces, simples et personnalisables générer des bibliothèques à grande échelle, une condition sine qua non pour faire le dépistage se prêtent à un plus grand nombre de systèmes modèles et approches ingénieries CRISPR différents. CORALINA fournit un premier pas vers cela. Les utilisations potentielles sont multiples, notamment pour produire des bibliothèques complètes de génomes, ADNc provenant des bibliothèques de systèmes de modèles moins courants, des bibliothèques très ciblés et des montages expérimentaux dans lequel différentes protéines CRISPR (avec PAM différente exigences) sont utilisés en combinaison.
Contrairement aux autres méthodes, CORALINA génère toutes gRNAs possibles de l’entrée de l’ADN. Cependant, un inconvénient de la méthode est que gRNAs manque la séquence nécessaire de PAM sont également inclus dans la bibliothèque, une caractéristique qu’elle partage avec une deuxième méthode enzymatique pour la génération de bibliothèque gRNA, mangeur de CRISPR (tableau 1). Le choix de la méthode idéale pour génération de bibliothèque gRNA dépend les spécifications de la projection prévue expérimenter, en particulier la nature (génique, réglementation, intergénique) et la taille de la région cible (locus unique, plusieurs régions, Génome-large). Nous voyons une tête spéciale en utilisant CORALINA lorsqu’un grand nombre de non codantes ou régions régulatrices doivent être analysés, s’il existe des informations sur les séquences incomplètes ou peu fiables (systèmes modèles exotiques, mélanges d’espèces (p. ex. microbiomes) ou "obtenus expérimentalement entrée), si différentes endonucléases CRISPR sont combinés ou saturer l’analyse est effectuée sur un locus court et défini (par exemple représenté par BACs).

L’adaptation du système CRISPR/Cas9 bactérienne comme un outil de ciblage moléculaire causé la révolution plus récente en biologie moléculaire. Jamais auparavant il n’a été aussi facile de manipuler la chromatine aux emplacements définis de génomiques. Applications communes de CRISPR incluent des mutations de gènes ciblés1, ingénierie du génome2, épigénome édition3, activation de la transcription et4de silençage génique. Un avantage particulier du système CRISPR est que ses applications ne se limitent pas aux sites de candidats bien étudiés, comme gRNA bibliothèques permettent moins biaisées écrans. Ces amendements facilitent la découverte des loci fonctionnelles du génome sans aucune connaissance préalable expérimentale. Cependant, construction de bibliothèque gRNA repose actuellement principalement sur la synthèse des oligo-nucléotides et il y a des options limitées pour acheter gRNA bibliothèques qui ne sont pas des humains ou régions origine ou cible de souris en dehors des cadres de lecture ouverts. Ainsi, bien que CRISPR écrans sont déjà avérées incroyablement puissants5,6,7,8, leur plein potentiel n'a pas encore été exploitée.
Pour surmonter la limitation des stratégies de deux méthodes gRNA classique de production ont récemment été mis au point. Deux sont basés sur contrôlé digestion enzymatique de l’ADN cible plutôt que de compter sur la synthèse d’oligonucléotides personnalisée. Tandis que CORALINA9 emploie une nucléase micrococcique, la méthode alternative actuellement disponible uniquement, mangeur de CRISPR10, fait appel à des enzymes de restriction (HpaII, ScrFje, BfaI et Mmej’ai). Ce qui est important, les deux techniques peuvent être appliquées à n’importe quel ADN d’entrée, qui sert de source de gRNA protospacer séquences. Alors que la méthode CRISPR-manger emploie une stratégie visant à diminuer le nombre de gRNAs clonés dont ciblant les sites ne sont pas respectées par le PAM de S.pyogenes requis (motif adjacent de protospacer), il génère seulement une petite fraction de tous les possibles gRNAs fonctionnels pour une région donnée. CORALINA, en revanche, est capable de générer tous les gRNAs potentiels pour la séquence source, mais intègre également une fraction plus élevée des guides non fonctionnel. génération de bibliothèque gRNA par activité nucléasique contrôlé permet de produire des bibliothèques gRNA complet pour toute espèce, n’importe quel système Cas9-protéine ou - effecteur de manière simple et rentable. En outre, CORALINA est adaptable à la personnalisation, choix d’entrée et vecteurs appropriés définissent le type de bibliothèque, la taille et le contenu. Ici, un protocole détaillé est présenté qui peut être utilisé pour la génération de bibliothèques complètes gRNA provenant de diverses sources de l’ADN (Figure 1), y compris les chromosomes artificiels bactériens (bac) ou l’ADN génomique9. Les résultats représentatifs qui accompagne ce protocole ont été obtenues en appliquant le protocole CORALINA à ADN.

<table><tbody><tr><td>500 mM EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03777-10G</td><td>1.4., Inactivation du tampon d’échantillon Mnase</td></tr><tr><td>Novex Hi-Density TBE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6678</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg ; Gels TBE, 20 %, 10 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6315BOX</td><td>2.1., gel PAGE préfabriqué 20 %</td></tr><tr><td>O’RangeRuler 5 bp Échelle d’ADN,</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1303</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg ; TBE Running Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6675</td><td>2.1., PAGE gel running buffer</td></tr><tr><td>Scalpel jetable, stérile</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>233-5363&nbsp ;</td><td>2.3, d’autres réactifs équivalents peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Coloration à l’acide nucléique SYBR Green I (concentré 1000x dans DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td> S9430</td><td>2.3. +2.5., également disponible chez Thermo Fisher Scientific (S7563)</td></tr><tr><td>Phénol ultrapur :Chloroforme :Alcool isoamylique (25:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593-031</td><td>3.6.1. + 4.3., d’autres réactifs équivalents peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Sigma</td><td>10901393001</td><td>3.6.4., d’autres réactifs équivalents peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>3M Acétate de sodium, pH5.2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp ; R1181</td><td>3.6.4., d’autres réactifs équivalents peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td></td><td></td><td>3.6.4. + 9.1.8., grade biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Kit d’émoussement rapide&nbsp ;</td><td>Biolabs de la Nouvelle-Angleterre</td><td>E1201</td><td>4.1.</td></tr><tr><td>acétate d’ammomium</td><td>Sigma</td><td> A1542</td><td>3.1., d’autres réactifs équivalents peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>acétate de magnésium</td><td>Sigma</td><td> M5661</td><td>3.1., d’autres réactifs équivalents peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>VWR</td><td>&nbsp ; MOLEM37465520 (ou Promega V4231)</td><td>2.2. + 3.1., d’autres réactifs équivalents peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>billes Beckman</td><td>Coulter A63881</td><td>5.3. + 6.5.</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>5.7.+ 7.1. +8.4., d’autres réactifs équivalents peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>concentrés T4 ADN ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp ; M0202T</td><td>6.1.+ 8.1.2.</td></tr><tr><td>Long Amp Taq 2X Master Mix&nbsp ;</td><td>Biolabs de la Nouvelle-Angleterre</td><td>M0287S</td><td>6.3.</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix avec tampon HF</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>5.1. + 6.6., d’autres réactifs équivalents peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>5.4.1.&nbsp ;</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>5.4.2.</td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td>8.2.1.</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>2M MgCl</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>TNT</td><td>Sigam</td><td> DTT-RO</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>PEG-8000° ;</td><td>Sigma</td><td> P5413</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma</td><td> N6522</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>Exonucléase T5</td><td>New England Biolabs</td><td>M0363S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Phusion ADN polymérase&nbsp ;</td><td>Biolabs de la Nouvelle-Angleterre</td><td>M0530S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Taq ADN ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208L</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>rSAP</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>8.3.1.</td></tr><tr><td>Cellules compétentes TG1</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td>9.1.</td></tr><tr><td>Cuvettes d’électroporation à espace de 1 mm&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>732-2267&nbsp ;</td><td>10.2.Boîte</td></tr> <tr><td>de dosage biologique (polystyrène, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DIS-988-010M&nbsp ;</td><td>9.4.NaCl</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>S7653&nbsp ;</td><td></td></tr><tr>9.3.Bacto-tryptone<td></td> <td>BD</td><td>211705</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>BD</td><td>212750</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td> A1296</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td> G5516</td><td>9.17.</td></tr><tr><td>MNAse</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>1.1.</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>dans tout</td></tr><tr><td>Micropulseur</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>Cuvettes d’électroporation</td><td>Biorad</td><td>732-2267&nbsp ;</td>Tubes à centrifuger de <td>10.2.250</td></tr> <tr><td>ml</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>9.1-9.9.</td></tr></tbody></table>

un protocole universel pour à grande échelle grna bibliothèque production provenant de toute source d’adn

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

La popularité du système CRISPR/Cas9 pour génome et génie de l’épigénome découle de sa simplicité et son adaptabilité. Un effecteur (la nucléase Cas9 ou une protéine de fusion dCas9 nucléase-morts) est destiné à un site spécifique dans le génome par un petit ARN synthétique appelé le guide RNA ou gRNA. Le caractère biparti du système CRISPR permet son utilisation dans le dépistage des approches depuis les bibliothèques de plasmide des cassettes d’expression contenant des milliers de gRNAs individuel peuvent être utilisés pour interroger de nombreux sites différents dans une seule expérience.
A ce jour, gRNA séquences pour la construction de bibliothèques ont été presque exclusivement générés par la synthèse d’oligonucléotides, qui limite la complexité réalisable de séquences dans la bibliothèque et est relativement coûteux. Ici, un détail le protocole pour CORALINA (génération de bibliothèque gRNA globale par activité nucléasique contrôlé), un simple et méthode rentable pour la génération de bibliothèques gRNA hautement complexe issu de la digestion enzymatique de l’entrée de l’ADN, est décrite. Étant donné que les bibliothèques CORALINA peuvent provenir de n’importe quelle source d’ADN, beaucoup d’options pour la personnalisation existent, permettant une grande variété d’écrans CRISPR-basé.

En utilisant le protocole à portée de main, bibliothèques gRNA CORALINA ont été générés de l’homme, de l’ADN génomique souris9 et ADN (Figure 1). Pour produire des fragments d’ADN d’entrée approprié pour le clonage dans des vecteurs d’expression gRNA, des conditions optimales pour la digestion nucléasique contrôlé doivent être déterminés. Un résultat typique pour l’optimisation de la digestion de la nucléase micrococcique est représenté dans la Figure 2 a. Une quantité insuffisante de la nucléase (0,1, 2, 3, 4, 4.5 ou 5 unités) produit aucun produit perceptible dans la gamme de taille requise (bp 10-100) et 5,5 et 7,5 unités produites encore fragments qui sont en moyenne trop long. Plus grande quantité d’enzyme (50 unités) conduire à une dégradation excessive des entrée ADN après 10 min. Par conséquent, un montant intermédiaire a été choisi (10 unités). Le recueil a été intensifié pour produire suffisamment digéré fragments pour purification ultérieure et le clonage (Figure 2 b). Alors qu’il est recommandé de choisir aveuglément des fragments d’ADN de taille et ne compter que sur l’échelle de l’ADN pour l’orientation minimiser l’exposition des fragments d’ADN à la lumière UV, gels peuvent être colorés par la suite pour le contrôle de la qualité de la digestion et de coupe. Figure 2 b montre un exemple représentatif d’un gel de la PAGE de quel ADN fragments entre 20 et 30 bp ont été excisées. Gel purifié MNase fragments ont été chargés sur un 20 % gel de PAGE pour vérifier la sélection réussie selon la taille et la purification des fragments digérés MNase (Figure 2). Le protocole à portée de main est compatible avec l’utilisation de séquences personnalisées de l’éditeur de liens, ce qui permet de cloner des fragments digérés MNase en gRNA vecteurs d’expression de choix. Ici, gRNA-PLKO9 a été utilisé comme épine dorsale. Les linkers sont amplifiés du vecteur d’expression gRNA par PCR standard. Figure 2D représente un exemple représentatif des séquences amplifiées linker dépourvue de supplémentaires, incorrect ou aucun modèle amplicons. Ensuite, linker amplicons sont digérés par des enzymes de restriction pour assurer les linkers sont ligaturés sur les fragments digérés MNase dans le bon sens. Figure 2D montre des gels d’agarose de linkers 5' et 3' avant et après la digestion avec HindIII et SacII respectivement, indiquant une digestion complète des linkers à 637 prédites et 295 bp. La partie droite de l’image de gel documente l’excision des fragments digérés linker. Qui suit gel extraction des linkers digérées, l’étape suivante dans le protocole est la ligature des linkers aux fragments digérés MNase réparé à la fin. Parce que les séquences de l’éditeur de liens sont générées par PCR avec des amorces lieu, individu-ligature de linkers ne devrait pas se produire. Seulement les fragments d’ADN digéré MNase fin-réparé fournissent les groupes phosphates nécessaires pour la ligature. Après nick translation, le produit de la ligature est amplifié par PCR. Afin d’éviter les biais d’amplification PCR excessive qui pourrait biaiser la représentation sous forme de séquences de gRNA dans la bibliothèque, l’amplification est limitée à moins de 20 cycles au total. Après les PCR, les produits d’amplification sont difficiles à visualiser sur gels d’agarose. PCRs de commande séparé avec 32 cycles sont donc effectuées pour détecter les produits (mais ne sont pas utilisés pour la préparation de la bibliothèque). Les résultats de ce contrôle PCR sont indiquées dans Figure 2E. Cela permet d’optimiser les réactions de la ligature et à assurer des réactions sont dépourvues d’artefacts PCR, qui parfois se produisent dans « pas de contrôles de fragments » (NFC). 2E de la figure montre l’amplicon désiré (fragment d’ADN, éditeur de liens 5' + 3' linker, longueur : 869 bp) suite à l’amplification des réactions de ligature à l’aide des taux équimolaires (1:1) entre les fragments et les séquences de l’éditeur de liens.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> Figure 1 : A suggéré la chronologie pour la préparation d’une bibliothèque de gRNA. CORALINA propose une stratégie simple et rentable pour la génération de bibliothèques gRNA complète d’une pléthore de différentes sources d’ADN de n’importe quel organisme. Le protocole à portée de main peut être amené à l’achèvement au cours d’une semaine de travail. Génération de l’éditeur de liens peut être effectuée en parallèle avec la fin-réparation de l’ADN. Préparation de bactéries electrocompetent dure deux jours et comprend une étape de croissance durant la nuit et doit donc être démarrée avant l’Assemblée, les réactions sont mises en place. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> Figure 2 : Des étapes cruciales au cours du protocole. (A) contrôlées digestion de l’ADN permet la génération de fragments de tailles différentes. L’optimisation de la digestion MNase est présentée ici. L’ADN purifié BAC a été traité avec différentes quantités de MNase pour 10 min. 10 U de MNase générer des fragments d’ADN de la longueur désirée (20-30 bp). (B) taille de sélection des fragments entre 20 et 30 bp à l’aide de l’excision des gels de polyacrylamide. L’ADN purifié BAC a été traité avec 10 U de MNase pendant 10 min. L’image a été enregistrée suite à l’excision. (C) contrôle de la qualité des fragments purifiés par gel. Après purification de gel, 1/6ème de la MNase purifiée fragments a été chargé sur un 20 % gel de PAGE pour vérifier la sélection réussie selon la taille et la purification. (D) Amplification de séquences d’éditeur de liens pour l’Assemblée et l’enzyme de restriction digestion des linkers pour clonage directionnel. 5' et 3' linkers furent amplifiés et couper avec HindIII et SacII, respectivement. Contrôles non-modèle (NTC) ont été inclus au contrôle pour les artefacts PCR et d’ADN contaminant. Gauche : demande échantillon analytique ; droite : Echantillons préparative. Image a été enregistrée après le gel de l’excision. (E) ligature réussie des lieurs de fragments d’ADN peut être analysée par PCR avec un augmentation du nombre de cycles de PCR (32) et contrôlée par n’effectuer aucun contrôle de modèle avec H2O (NTC) ou à l’aide de la CNT de l’étape précédente de traduction nick comme entrée (CNE NT)). Il est important de n’inclure un aucun fragment contrôle (NFC), qui est une amplification d’une ligature et la réaction de translation de nick d'où les fragments MNase ont été omis. Seulement les échantillons dans laquelle MNase fragments ont été combinées avec l’éditeur de liens ADN produisent l’amplicon attendu (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Méthodes pour générer des bibliothèques gRNA à grande échelle devraient être simple, efficace et rentable. Les auteurs décrivent un protocole pour la production de bibliothèques gRNA issu de la digestion enzymatique de l’ADN cible. Cette méthode, CORALINA (génération de bibliothèque gRNA globale par activité nucléasique contrôlé) présente une alternative à la synthèse d’oligonucléotides personnalisée coûteux.

Un protocole universel pour à grande échelle gRNA bibliothèque Production provenant de toute Source d’ADN

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

L'objectif général de cette méthode est de construire des bibliothèques complètes d'ARN guides à partir d'ADN purifié provenant de n'importe quelle source. Les bibliothèques d'ARN guides sont des collections de plasmides utilisées dans les criblages basés sur CRISPR. La méthode CORALINA utilise une digestion enzymatique de l'ADN purifié pour cloner les fragments résultants dans un vecteur de bibliothèque d'ARN guide.Le principal avantage de cette technique est qu'elle produit tous les ARN guides possibles à partir de la séquence d'entrée et qu'elle est très rentable. Bien que cette vidéo démontre la protection d'une bibliothèque CORALINA à partir d'un chromosome artificiel bactérien, cette méthode peut en principe être appliquée à tout type d'ADN d'entrée provenant de n'importe quel organisme. Une optimisation de la digestion par la nucléase micrococquique doit être réalisée pour chaque nouvelle série de nucléase micrococquique.Préparer les éléments suivants pour chaque réaction : un microlitre de tampon 10x nucléase micrococcale, de l'albumine sérique bovine à 1x, un microgramme d'ADN cible, un microlitre de nucléase micrococcale et de l'eau jusqu'à un volume total de 10 microlitres. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.Inactiver immédiatement l'enzyme en ajoutant un microlitre d'EGTA à 500 millimolaire. Ajouter le tampon d'échantillonnage contenant le colorant de charge au gel aux échantillons d'ADN et charger un microgramme d'ADN par puits dans un gel de polyacrylamide à 20 %. Charger une échelle d'ADN appropriée pour la détermination de la taille.Faites migrer le gel dans du tampon de migration TBE 1x à 150 volts pendant environ 1,5 heure ou jusqu'à ce que le front inférieur du colorant atteigne l'extrémité inférieure du gel. Révélez le gel à l'aide d'un colorant ultrasensible pour acides nucléiques et visualisez sous lumière UV. Dans cet exemple, la concentration optimale de nucléase micrococquique pour digérer l'ADN jusqu'à une taille de 20 à 30 paires de bases était de 10 unités.Utilisez cette concentration optimale de nucléase micrococcale pour digérer de 10 à 12 microgrammes d'ADN cible de la même manière que démontré pour les réactions d'optimisation. Après séparation des fragments d'ADN par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE), utilisez un scalpel stérile pour découper le gel à côté de la voie du marqueur et colorer uniquement la partie du gel contenant l'échelle avec un tampon de migration TBE 1x frais contenant un colorant ultrasensible pour acides nucléiques. Visualisez l'échelle d'ADN et utilisez une lame de rasoir pour exciser les fragments d'ADN digérés par la nucléase micrococcale dont la taille se situe approximativement entre 18 et 30 paires de bases.Transférez le morceau de gel dans un tube de microcentrifugeuse. Coloriez le reste du gel avec un colorant pour acides nucléiques comme indiqué précédemment. Exposez le gel à la lumière UV et acquérez une image afin de documenter l'étape de découpe du gel.Commencez cette procédure en utilisant une pointe de pipette stérile pour broyer le morceau de gel excisé contre la paroi du tube de microcentrifugation. Ajoutez deux volumes de gel de tampon de solubilisation PAGE et incubez à 37 degrés Celsius sur une plateforme rotative pendant 16 heures. Le jour suivant, centrifugez l'échantillon dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant une minute.Transférez les surnageants dans un nouveau tube de microcentrifugeuse en prenant soin de ne pas transférer de morceaux de gel broyés. Ajoutez 0,5 volume de tampon de solubilisation PAGE au culot de gel, vortexez et répétez la centrifugation. Combinez les surnageants et extrayez les fragments d'ADN en utilisant une méthode d'extraction standard au phénol-chloroforme, telle que décrite dans le protocole écrit.En parallèle avec l'isolement des fragments d'ADN, amplifier les linkers à partir du vecteur d'expression d'ARN guide en utilisant une PCR standard. Pour assurer un clonage directionnel, les linkers sont ensuite digérés avec les enzymes de restriction appropriées, comme décrit dans le protocole textuel. Faire migrer la digestion enzymatique des linkers sur un gel d'agarose à un pour cent.Excisez les bandes appropriées et purifiez l'ADN à partir des morceaux de gel excisés à l'aide d'un kit d'extraction de gel. Un kit d'aplatissement de l'ADN est utilisé pour la réaction de réparation des extrémités. Ajoutez les éléments suivants dans un tube de microcentrifugation.10 microlitres d’ADN purifié, 1,5 microlitre de tampon de nivellement 10x, 1,5 microlitre de mélange de dNTP à un millimolaire, 1,4 microlitre d’eau et 0,6 microlitre d’enzyme de nivellement. Incuber à 22 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis inactiver l’enzyme par une incubation à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajouter 85 microlitres d’eau et effectuer un nettoyage de la réaction tel que décrit dans le protocole écrit.Préparer une réaction de ligation de 14 microlitres en utilisant des quantités équimolaires de fragments digérés et réparés par la nucléase micrococcale et de séquences d'adaptateur, comme décrit dans le protocole écrit. Après la traduction des nicks, le produit de ligation est amplifié par PCR. Pour séparer les fragments de nucléase micrococcale portant correctement l'adaptateur 5' et l'adaptateur 3' de ceux possédant deux adaptateurs 5' ou deux adaptateurs 3', combiner toutes les réactions PCR de 15 cycles, ajouter le colorant de charge pour ADN et faire migrer sur un gel d'agarose à 0,8 %.Excisez la bande marquée à 869 paires de bases et purifiez l'ADN à l'aide d'un kit d'extraction sur gel. Quantifiez la quantité d'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre. Ensuite, clonez les fragments amplifiés par PCR dans le vecteur d'expression d'ARN guide par assemblage Gibson, comme décrit dans le protocole textuel.Pour commencer cette procédure, aliquoter le vecteur purifié contenant l'insert dans des tubes PCR stériles et prérefroidis, puis maintenir sur glace. Refroidir des cuvettes d'électroporation à intervalle de 1 millimètre sur glace. Ajouter 25 microlitres de cellules TG1 fraîchement préparées directement à un aliquot d'ADN et transférer immédiatement le mélange dans une cuvette d'électroporation.Faites légèrement vibrer ou touchez la cuvette pour vous assurer que le mélange de cellules et d'ADN est réparti sur toute la longueur de la chambre de la cuvette, sans bulle d'air piégée. Placez la cuvette dans la chambre du support et lancez le programme d'électroporation approprié. Ajoutez immédiatement 475 microlitres de 2TY à température ambiante dans la cuvette.Transférez les bactéries électroporées dans un tube de 50 millilitres. Répétez les électroporations individuelles, rassemblez toutes les cellules transformées avec une même bibliothèque dans un seul tube de 50 millilitres et documentez le volume total. Pour estimer le nombre total de colonies pour l'ensemble de la bibliothèque, étalez une petite quantité définie de bactéries transformées avec la bibliothèque sur une boîte de Pétri en agar de 10 centimètres contenant l'antibiotique de sélection approprié.Pour réduire le volume du résidu bactérien, centrifuger à environ 4 000 g pendant 10 minutes ou jusqu'à la formation d'un culot visible et à l'obtention d'un surnageant clair. Éliminer tout le surnageant sauf quelques millilitres, puis resuspendre les cellules. Ensemencer les bactéries sur des boîtes de bioessai recouvertes d'agar 2TY contenant l'antibiotique de sélection approprié.Étaler un volume approprié de la réaction de électroporation témoin pUC19 sur une boîte de gélose supplémentaire de 10 centimètres avec une sélection par antibiotique adaptée. Incuber les boîtes de gélose à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, compter le nombre de colonies sur les boîtes témoins afin d'estimer le nombre d'unités formant colonies par microgramme d'ADN pour les bactéries ainsi que la complexité de la banque.Enfin, prélevez les bactéries à partir de la boîte pour l'extraction de l'ADN plasmidique. Après la purification sur gel, 1/6 des fragments de nucléase micrococcale purifiés a été chargée sur un gel de PAGE à 20 % afin de confirmer la sélection de taille et la purification réussies. Les amplicons de connecteurs ont été digérés avec des enzymes de restriction pour s'assurer que les connecteurs sont ligaturés aux fragments digérés par la nucléase micrococcale dans l'orientation correcte.Le côté gauche de cette image représentative de gel montre les linkers 5' et 3' avant et après digestion par HindIII et SacII respectivement, indiquant une digestion complète des linkers en fragments prévus de 637 paires de bases et 295 paires de bases. Le côté droit de l'image de gel documente l'excision des fragments de linkers digérés. La ligature réussie des linkers aux fragments d'ADN a été analysée par PCR en augmentant le nombre de cycles de PCR.Les contrôles inclus étaient un témoin sans matrice utilisant le témoin sans matrice de l'étape précédente de traduction des cassures comme entrée, et un témoin sans fragment de nucléase micrococcale. Seuls les échantillons dans lesquels les fragments de nucléase micrococcale avaient été associés à l'ADN de liaison ont produit l'amplicon attendu de 869 paires de bases. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq jours si elle est correctement exécutée.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de préserver la complexité de la bibliothèque et d'effectuer d'autres réactions témoins. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez désormais bien comprendre comment générer une bibliothèque d'ARN guide pour des criblages basés sur CRISPR, en découpant l'ADN en petits fragments et en les clonant dans le vecteur d'origine de la bibliothèque.

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