Un protocole universel pour à grande échelle gRNA bibliothèque Production provenant de toute Source d’ADN

L’objectif global de cette méthode est de construire des banques d’ARN guides complètes à partir d’ADN purifié provenant de n’importe quelle source. Les banques d’ARNg sont des collections de plasmides utilisées dans les cribles basés sur CRISPR. La méthode CORALINA utilise la digestion enzymatique de l’ADN purifié pour cloner les fragments résultants dans un squelette de banque d’ARN guide.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle produit tous les ARN guides possibles à partir de la séquence d’entrée et qu’elle est très rentable. Bien que cette vidéo démontre la protection d’une banque CORALINA contre un chromosome artificiel bactérien, cette méthode peut en principe être appliquée à tout type d’ADN d’entrée de n’importe quel organisme. Une optimisation de la digestion des nucléases micrococciques doit être effectuée pour chaque nouveau lot de nucléases micrococciques.

Configurez les éléments suivants pour chaque réaction. Un microlitre de 10 tampons de nucléases micrococciques, 1 d’albumine sérique bovine, un microgramme d’ADN cible, un microlitre de nucléase micrococcique et de l’eau pour 10 microlitres. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Inactiver immédiatement l’enzyme en ajoutant un microlitre d’EGTA de 500 millimolaires. Ajoutez un tampon d’échantillon avec un colorant de chargement de gel aux échantillons d’ADN et chargez un microgramme d’ADN par puits dans un gel de polyacrylamide à 20 %. Chargez une échelle d’ADN appropriée pour le dimensionnement.

Faites fonctionner le gel dans 1 tampon de fonctionnement TBE à 150 volts pendant environ 1,5 heure ou jusqu’à ce que la face inférieure du colorant atteigne l’extrémité inférieure du gel. Teindre le gel à l’aide d’un colorant d’acide nucléique ultrasensible et visualiser sous la lumière UV. Dans cet exemple, la concentration optimale de nucléase micrococcique pour digérer l’ADN jusqu’à une taille de 20 à 30 paires de bases était de 10 unités.

Utilisez cette concentration optimale de nucléase micrococcique pour digérer 10 à 12 microgrammes d’ADN cible de la même manière que pour les réactions d’optimisation. Après avoir séparé les fragments d’ADN par PAGE, utilisez un scalpel stérile pour couper le gel à côté de la bande de marqueur et colorez uniquement la partie du gel contenant l’échelle avec un tampon de coulage frais 1x TBE contenant une coloration d’acide nucléique ultrasensible. Visualisez l’échelle d’ADN et utilisez une lame de rasoir pour exciser des fragments d’ADN digérés par des nucléases micrococciques dont la taille se situe entre environ 18 et 30 paires de bases.

Transférez la tranche de gel dans un tube de microcentrifugation. Teignez le reste du gel avec une coloration à l’acide nucléique comme indiqué précédemment. Exposez le gel à la lumière UV et acquérez une image comme enregistrement de l’étape d’excision du gel.

Commencez cette procédure en utilisant une pointe de pipette stérile pour écraser la tranche de gel excisée contre la paroi du tube de microcentrifugation. Ajouter deux volumes de gel de tampon de solubilisation PAGE et incuber à 37 degrés Celsius sur une plate-forme rotative pendant 16 heures. Le lendemain, centrifugez l’échantillon dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant une minute.

Transférez les surnageants dans un nouveau tube de microcentrifugation en prenant soin de ne pas transférer de morceaux de gel écrasés. Ajouter 0,5 volume de tampon de solubilisation PAGE à la pastille de gel, vortex et répéter la centrifugation. Combinez les surnageants et extrayez les fragments d’ADN à l’aide d’une méthode d’extraction standard au phénol-chloroforme, telle que décrite dans le protocole textuel.

Parallèlement à l’isolement des fragments d’ADN, amplifiez les linkers du vecteur d’expression de l’ARN guide à l’aide de la PCR standard. Pour assurer le clonage directionnel, les linkers sont ensuite digérés avec les enzymes de restriction appropriées, comme décrit dans le protocole textuel. Exécutez la digestion de l’enzyme de restriction des agents de liaison sur un gel d’agarose à un pour cent.

Excisez les bandes correctes et purifiez l’ADN des morceaux de gel excisés à l’aide d’un kit d’extraction de gel. Un kit d’émoussement de l’ADN est utilisé pour la réaction de réparation finale. Ajoutez ce qui suit dans un tube de microfuge.

10 microlitres d’ADN purifié, 1,5 microlitres de tampon 10x émoussé, 1,5 microlitres d’un mélange millimolaire de dNTP, 1,4 microlitre d’eau et 0,6 microlitre d’enzyme émoussée. Incuber à 22 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis chauffer et activer l’enzyme par incubation à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajoutez 85 microlitres d’eau et effectuez un nettoyage par réaction comme décrit dans le protocole textuel.

Mettez en place une réaction de ligature de 14 microlitres en utilisant des quantités molaires égales de nucléases micrococciques digérées et réparées et des séquences de liaison comme décrit dans le protocole de texte. Après la traduction de l’entaille, le produit de ligature est amplifié par PCR. Pour séparer les fragments de nucléases micrococciques avec les cinq premiers et trois premiers correctement attachés des fragments avec deux cinq premiers ou deux trois premiers linkers, combinez les réactions PCR à 15 cycles, ajoutez un colorant de chargement d’ADN et exécutez sur un gel d’agarose à 0,8 %.

Exciser la bande proéminente à 869 paires de bases et purifier l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction de gel. Quantifiez la quantité d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Par la suite, clonez les fragments amplifiés par PCR dans le vecteur d’expression de l’ARN guide par assemblage Gibson, comme détaillé dans le protocole texte.

Pour commencer cette procédure, l’insertion de vecteur purifié aliquote est construite dans des tubes PCR stériles et pré-refroidis et conserve-la sur de la glace. Réfrigérer les cuvettes d’électroporation à un millimètre d’écart sur de la glace. Ajoutez 25 microlitres de cellules TG1 fraîchement préparées directement à une aliquote d’ADN et transférez immédiatement le mélange dans une cuvette d’électroporation.

Effleurez ou tapotez la cuvette pour vous assurer que le mélange de cellules et d’ADN est réparti sur toute la longueur de la chambre de la cuvette sans aucun air ni bulle emprisonné. Placez la cuvette dans la chambre à glissière et lancez le programme d’électroporation approprié. Ajoutez immédiatement 475 microlitres de 2TY à température ambiante dans la cuvette.

Transférez les bactéries électroporées dans un tube de 50 millilitres. Répétez les électroporations individuelles, rassemblez toutes les cellules transformées avec une seule bibliothèque dans un tube de 50 millilitres et documentez le volume total. Pour estimer le nombre total de colonies pour l’ensemble de la bibliothèque, mettez en boîte une petite quantité définie de bactéries transformées avec la bibliothèque sur une plaque de gélose de 10 centimètres avec la sélection d’antibiotiques appropriée.

Pour réduire le volume du reste des bactéries, centrifuger à environ 4 000 g pendant 10 minutes ou jusqu’à ce qu’une palette visible se soit formée et que le surnageant apparaisse clair. Retirez tout le surnageant, à l’exception de quelques millilitres, et remettez les cellules en suspension. Déposer les bactéries dans des boîtes d’essai biologique enrobées d’agar 2TY contenant la sélection d’antibiotiques appropriée.

Étalez un volume approprié de la réaction d’électroporation du témoin pUC19 sur une boîte de gélose supplémentaire de 10 centimètres avec une sélection d’antibiotiques appropriée. Incuber les plaques d’agar à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, comptez le nombre de colonies sur les plaques contrôlées pour estimer l’unité formant une colonie par microgramme d’ADN pour les bactéries ainsi que la complexité de la bibliothèque.

Enfin, grattez les bactéries de la plaque pour l’extraction de l’ADN plasmidique. Après la purification du gel, 1/6 des fragments de nucléases micrococciques purifiés ont été chargés sur un gel 20 %PAGE pour confirmer la sélection de la taille et la purification. Les amplicons de liaison ont été digérés avec des enzymes de restriction pour s’assurer que les agents de liaison sont ligaturés sur les fragments de nucléase micrococcique digérés dans la bonne orientation.

Le côté gauche de cette image de gel représentative montre cinq premiers et trois premiers liants avant et après digestion avec HindIII et SacII respectivement, indiquant une digestion complète des liants aux 637 paires de bases prédictives et 295 paires de bases. Le côté droit de l’image du gel documente l’excision des fragments de liaison digérés. La ligature réussie des agents de liaison aux fragments d’ADN a été analysée par PCR avec un nombre accru de cycles de PCR.

Les contrôles inclus étaient un contrôle sans modèle utilisant le contrôle sans modèle de l’étape précédente de traduction de pseudo comme entrée et un contrôle sans fragment de nucléase micrococcique. Seuls les échantillons dans lesquels des fragments de nucléases micrococciques ont été combinés avec de l’ADN de liaison ont produit l’amplicon attendu de 869 paires de bases. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq jours si elle est bien faite.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de maintenir la complexité de la bibliothèque et d’effectuer d’autres réactions de contrôle. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la façon de générer une bibliothèque d’ARN guide pour les écrans basés sur CRISPR en découpant l’ADN en petits morceaux et en les clonant dans le squelette vectoriel de la bibliothèque.