In Vivo Suivi des humains dérivés adipeux cellules souches mésenchymateuses dans un modèle de l’arthrose du genou de Rat avec un colorant Fluorescent Membrane lipophiles

Ce protocole décrit un moyen efficace de contrôler la persistance de la cellule et la biodistribution des dérivés adipeux mésenchymateuses des cellules souches humaines (haMSCs) par fluorescence rouge sombre étiquetage dans un modèle de l’arthrose (KOA) de genou de rat par injection intra-articulaire de (IA).

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer l’efficacité de la persistance cellulaire et de la biodistribution des cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain dans un modèle d’ostéarisation du genou de rat, ou un modèle KOA, à l’aide de l’imagerie fluorescente in vivo. Le suivi des cellules souches in vivo peut aider à répondre à une question clé dans le domaine des mathématiques régénératives sur l’irritation et la distribution de l’adipeux humain dérivé dans les cellules souches mésenchymateuses dans les modèles animaux KOA. Le principal avantage de l’utilisation du DiD est que son spectre d’émission décalé par le rat permet l’imagerie des tissus profonds chez les animaux vivants sans effets cytotiques ni dommages fonctionnels aux cellules marquées au colorant.

Commencez par placer un rat Sprague Dawley mâle anesthésié de 250 à 300 grammes, âgé de huit à 12 semaines, en position latérale gauche sur un coussin chauffant. Utilisez un rasoir pour raser soigneusement le genou droit et désinfectez la zone chirurgicale avec une solution de povidone iodée à 10 % et de l’éthanol à 70 %. Couvrez la zone non chirurgicale avec un tampon chirurgical.

Et utilisez un scalpel pour faire une incision latérale de deux centimètres le long du tendon rotulien pour exposer les capsules articulaires. Ensuite, utilisez un scalpel chirurgical pour transecter le ligament collatéral médial, reflétant le ménisque vers le fémur, et saisissez le ménisque médial avec une pince. À l’aide d’un scalpel, vous coupez le ménisque à son point le plus étroit à partir de l’attache tibiale.

Pour obtenir un début fiable et réalisable de l’AOK, le côté fémur du ménisque doit être complètement coupé chez chaque animal de laboratoire. Ensuite, fermez la capsule articulaire avec une suture observable à quatre O et surveillez le rat jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli. Huit semaines après l’opération, détachez des cellules mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain d’une culture confluente à 80 % avec deux millilitres de trypsine et d’EDTA pendant trois minutes à 37 degrés Celsius.

Après quelques minutes, neutralisez la trypsine avec quatre millilitres de milieu de culture complet et récupérez les cellules par centrifugation. Remettez la pastille en suspension à une concentration de 10 à six cellules par millilitre dans cinq millilitres de milieu de culture sans sérum. Et étiquetez les cellules avec 50 microlitres de solution de marquage cellulaire DiD pendant 50 minutes à 37 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, récupérez les cellules par centrifugation et lavez-les deux fois dans cinq millilitres de PBS par lavage. Après la dernière centrifugation, diluez les cellules à 2,5 fois 10 au sixième cellules viables par 100 microlitres de concentration de PBS et chargez les cellules dans une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 26. Ensuite, rasez à nouveau le genou arthritique du premier animal de laboratoire à exposer la zone articulaire et désinfectez la peau exposée avec de l’éthanol à 70 %.

Injectez les cellules marquées au centre du triangle formé par le côté médial du ligament rotulien, le condyle fémoral médial et le condyle tibial médial, et ouvrez le logiciel d’imagerie. Initialisez le système d’imagerie par bioluminescence in vivo et positionnez les animaux en position couchée dans l’étage central du système d’imagerie. Avec la porte de la chambre fermée, vérifiez la boîte fluorescente et sélectionnez les jeux de filtres fluorescents d’excitation et d’émission appropriés.

Réglez le champ de vision sur D, la courbure des pixels sur huit, le diaphragme F sur deux et le temps d’exposition sur auto. Après avoir obtenu les images, laissez les animaux récupérer sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à récupération complète. Ensuite, dans le logiciel d’analyse d’images approprié, sélectionnez les unités d’efficacité radiante pour la mesure de la fluorescence et les régions d’intérêt pour l’analyse et quantifiez les signaux fluorescents de chaque image.

Dans cette expérience représentative, des coupes en série de l’articulation du genou d’un rat induit par l’arthrose du genou ont été évaluées par coloration H&E et safranine O/Fast Green huit semaines après la chirurgie. L’épaisseur du cartilage articulaire est plus mince dans les genoux arthritiques que dans les articulations controlatérales sans chirurgie, comme observé dans les sections colorées H&E. De plus, le protéoglycane est diminué et le collagène fibrillé est augmenté dans l’articulation arthritique, comme le montre la coloration à la safranine O/Fast Green, indiquant la progression du phénotype dégénératif de l’arthrose du genou induit par la chirurgie.

Une heure après la coloration, les cellules mésenchymateuses humaines dérivées du tissu adipeux marquées au DiD présentent une forme ronde in vitro. Après 24 heures, les cellules mésenchymateuses cultivées marquées au DiD présentent une forme de long fuseau, confirmant que le DiD ne modifie pas la capacité d’adhérence des cellules. L’imagerie des genoux des animaux arthrosiques huit semaines après la chirurgie révèle la présence des cellules marquées au DiD du jour zéro au jour 70 après l’injection.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie par cellules souches pour déterminer la routine et le dosage optimaux pour l’injection sûre et réalisable de cellules souches mésenchymateuses pour le traitement de l’arthrose du genou chez les animaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer les cellules souches mésenchymateuses humaines avec DiD pour l’injection et le suivi in vivo dans le modèle KOA de rat induit chirurgicalement.