Name: In Vivo Suivi des humains dérivés adipeux cellules souches mésenchymateuses dans un modèle de l’arthrose du genou de Rat avec un colorant Fluorescent Membrane lipophiles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Découvrez le suivi in vivo des cellules souches mésenchymateuses humaines dérivées du tissu adipeux dans un modèle d'arthrose du genou chez le rat en utilisant le marquage fluorescent DiD. Cette méthode permet d'évaluer la persistance et la biodistribution cellulaire.

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L’étude actuelle a été soutenue par Shanghai Innovation financement (1402H 294300) parrainé par la Science et la technologie Commission de Shanghai municipalité (CN) à m. Wen Wang. Nous tenons à remercier m. Guangdong Zhou (National Tissue Engineering Centre de la Chine) pour son assistance technique et des conseils scientifiques pour ce manuscrit. Nous tenons également à remercier M. Huitang Xia (hôpital du peuple de Shanghai neuvième) pour son aide en matière de bien-être animal.

procédures portant sur des sujets animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique et de locaux institutionnels animalier avec un effort pour minimiser les souffrances animales. Le protocole suivant a été approuvé par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à Shanghai neuvième personnes &#8217; s hôpital affilié à Shanghai JiaoTong University School of Medicine avec le protocole numéro [2017] 063.
 1. mise en place d’un modèle de l’arthrose du genou Surgically-Induced Rat <ol><li>pour cette intervention chirurgicale, utilisation 8-12 semaines vieux rats Sprague Dawley (SD) mâles pesant entre 250 et 300 g.</li>
	<li>Anesthésier les animaux avec 40 mg/kg tiletamine et zolazepam 40 mg/kg par injection intramusculaire.</li>
	<li>Placer l’animal dans une position latérale gauche sur une platine chauffante. Raser complètement le genou droit avec un rasoir. Désinfecter la zone chirurgicale avec solution 10 % providone-iode, suivie de l’éthanol à 70 %, répéter deux fois et puis peindre avec une solution providone-iode 10 % et couvre la zone non chirurgical avec un tampon chirurgical.</li>
	<li>à l’aide d’un bistouri, pratiquer une incision de 2 cm latéralement le long du tendon rotulien pour exposer le jointcapsules.</li>
	<li>Utiliser un bistouri pour le ligament collatéral médial du transect. Reflètent le ménisque vers le fémur.</li>
	<li>Goutte de solution de chlorure de sodium 0,9 % stérile sur la surface du cartilage articulaire pendant l’opération afin d’éviter le cartilage ne se dessèchent pas.</li>
	<li>Prenez le ménisque interne avec une pince et couper à travers le ménisque au niveau du col de la fixation tibiale avec un scalpel ( Figure 1 a). Ne pas blesser le cartilage.</li>
	<li>Fermer la capsule articulaire avec une suture résorbable 4-0.</li>
	<li>Suivre les rats chirurgicales jusqu'à ce qu’ils reprennent conscience.</li>
	<li>Injecter 20 mg/kg de gentamicine pour prévenir l’infection et la buprénorphine de 0,05 mg/kg par voie intramusculaire pour soulager la douleur après la chirurgie.</li>
	<li>Maintenir le rat dans une animalerie température contrôlée suivant un cycle de lumière/obscurité de 12 h pendant 3 à 8 semaines et l’apparition KOA. Animaux continue de recevoir des médicaments contre la douleur, y compris mais non limité à la buprénorphine (0,05 mg/kg, i.m.) et de la gentamicine (20 mg/kg, i.m.), si les symptômes persistent.</li>
</ol> 2. Histologie du Rat KOA modèle d’évaluation des <ol><li>sacrifier les rats avec l’inhalation excessive de 2 CO (ajouter un taux de remplissage d’environ 30 % du volume par minute avec le dioxyde de carbone de l’air existant dans la chambre de chambre pour faire l’inconscience animale dans 2-3 min. débit de CO2 de maintenir pendant un minimum de 1 min après la respiration cesse.) à indiqué points dans le temps (représentant résultats figurent à 8 semaines d’induction de KOA allant de 3 à 8 semaines) après la chirurgie.</li> <li>disséquer la peau et des muscles autour des articulations du genou et coupée de l’articulation du genou avec un scalpel.</li>
	<li>Fixer les articulations de genou à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) pour 3 jours à température ambiante. Par la suite, détartre les échantillons à 20 % d’acide tétraacétique (EDTA) pendant environ 4 semaines à 4 ° C et changer tous les 3 jours de l’EDTA. 
	ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique, usure approprié équipement de protection individuelle (EPI), comme des gants et des lunettes.</li>
	<li>Déshydrater les échantillons à l’aide d’un processeur de tissu automatique. Définissez le menu pour lancer un cycle de chasse comme suit : l’éthanol à 70 % pendant 1 h ; puis l’éthanol à 80 % et 95 % d’éthanol pendant 1 h respectivement ; suivie de 2 cycles d’éthanol à 100 % pendant 1 h ; par la suite, xylène deux fois pendant 1 h chaque fois et chaque fois de paraffine 3 fois à 58 ° C pendant 1 h. 
	ATTENTION : Xylène est toxique, donc porter les EPI approprié, tels que des gants et des lunettes. 
	Remarque : Utilisez Coplin Jars pour déshydratation manuelle avec la même mise en place du traitement des tissus automatique.</li>
	<li>Poser la face médiale de la face commune intacte et incorporez-le dans le bloc de paraffine avec mouchoir incorporé dans le centre de. 
	Remarque : Utilisez pince pour incorporer les échantillons dans le bloc de paraffine manuellement.</li>
	<li>Commence à diminuer de 5 µm coupes sagittales de la marge médiale de l’articulation des intervalles de 30 µm avec 2 coupes sériées par microtome à.</li>
	<li>Monter sections sur lames de verre et Déparaffiner les diapositives dans le xylène. Entre les 2 coupes sériées, détachant une diapositive avec l’hématoxyline &#38; éosine (H &#38; E) coloration : 0,1 % hématoxyline pendant 15 min, 1 % Solution pour 10 s et 0,5 % d’acide acétique éosine pendant 10 min. Et tacher les autres diapositives avec coloration de safranine O/Fast Green : 0,1 % hématoxyline pendant 15 min, 0,02 % Fast Green pendant 3 min, 1 % Solution d’acide acétique pour 10 s et 0,1 % safranine O pendant 3 min. 
	ATTENTION : Xylène est toxique, porter les EPI approprié, tels que des gants, lunettes.</li>
	<li>Score les teinté de diapositives à Osteoarthritis Research Society International (OARSI) Histopathologie du système d’évaluation rats 6.</li>
</ol> 3. Étiquetage des humain cellules souches mésenchymateuses avec le colorant Fluorescent n’a <ol><li>préparer n’a pas de solution de marquage cellulaire dans l’éthanol à 100 % à une concentration de 1 mM. Protéger la solution de marquage cellulaire de la lumière et conserver à température ambiante pendant 6 mois.</li>
	<li>Grow haMSCs avec les méthodes de culture cellulaire standard en Dulbecco &#39; s modified Eagle &#39; s de moyenne (DMEM) additionné de 1 % la pénicilline et de streptomycine et de 10 % sérum de veau foetal (FCS) dans un plat de Pétri de 10 cm.</li>
	<li>Détacher haMSCs avec de la trypsine 0,25 % 2 mL avec confluence de préalable à environ 80 % EDTA 1 mM.</li>
	<li>Neutraliser la trypsine avec 4 mL de milieu de culture et de faire tourner les cellules à 800 g pendant 3 min à température ambiante.</li>
	<li>Suspendre les cellules à une densité de 1 x 10 6 cellules/mL dans le milieu de culture sans sérum 5 mL.</li>
	<li>Label les cellules en ajoutant 50 µL a solution de marquage cellulaire dans le milieu de culture sans sérum de 5 mL à 37 ° C pendant 50 min.</li>
	<li>Faire tourner les cellules marquées à 800 g pendant 3 min.</li>
	<li>Laver les cellules deux fois avec 5 mL phosphate tampon salin (PBS) à 800 g pendant 3 min chaque.</li>
	<li>Vérifier la haMSCs marquée à l’aide d’un microscope à fluorescence avec un jeu de filtres Cy5.</li>
	<li>Compter les cellules avec une coloration bleu trypan et obtenir 2,5 x 10 6 cellules viables dans 100 µL de PBS pour injection.</li>
</ol> 4. In Vivo Fluorescent d’imagerie à la piste haMSCs <ol><li>huit semaines après la chirurgie (étape 1), anesthésier les rats KOA par injection intramusculaire de tiletamine 25 mg/kg et de 25 mg/kg zolazepam.</li>
	<li>Raser complètement le genou droit avec un rasoir pour exposer la zone mixte. Désinfecter la zone du joint avec l’éthanol à 70 %.</li>
	<li>à l’aide d’une aiguille de seringue 26 G, injecter 2,5 x 10 6 marqués de cellules en suspension dans 100 µL PBS au centre de l’aire du triangle formé par la partie médiane du ligament rotulien, le condyle fémoral et le condyle tibial médial ( figure 1 b).</li>
	<li>Ouvrez le logiciel d’imagerie et d’initialiser la bioluminescence in vivo, système d’imagerie.</li>
	<li>Position rats dans le supin position dans la scène centrale du système d’imagerie et fermer la porte de la chambre de.</li>
	<li>Vérifier la &#34; fluorescent &#34; case et sélectionnez filtre fluorescent ensembles de 640 nm pour l’excitation et 680 nm pour l’émission ( Figure 2 a).</li>
	<li>Select de champ à la valeur de D. pixel binning au milieu (8), F/Stop pour l’exposition et 2 fois pour auto. Maintenir l’optimal temps d’exposition cohérente afin d’obtenir des résultats comparables dans l’ensemble de l’étude ( Figure 2 a).</li>
	<li>Retirer l’animal de la scène et le moniteur pour la récupération de l’anesthésie. 
	NOTE : Place animal sur un coussin chauffant recouvert de 2 ou 3 couches de tissu éponge.</li>
	<li>Choisir les unités d’efficacité radiante pour la mesure de la fluorescence ( Figure 2 b). Sélectionnez les régions d’intérêt (ROI) pour analyse et quantifier des signaux fluorescents de chaque image ( Figure 2).</li>
	<li>Répéter la procédure de l’imagerie in vivo pour chaque rat séquentiellement étudier haMSCs rétention longitudinal dans le joint. 
	NOTE : Nous vous suggérons d’imagerie des animaux &#39; signaux fluorescents par un appareil d’imagerie in vivo une fois tous les deux jours pendant la première semaine après l’injection et une fois par semaine jusqu'à ce que le signal ne peut pas être détecté.</li>
</ol>

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</ol>

Meng Li, Hao Ming et Wang Wen sont employés actuels et les détenteurs de stock-options de groupe de biomédecine cellulaire (Nasdaq : CBMG). Les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Normes de sécurité et les études de biodistribution de thérapie de cellules souches sont urgent avant que nous pouvons apporter le traitement régénérateur des cellules souches pour KOA à l’audience au chevet du malade. Cependant, l’environnement pathologique de la maladie joue un rôle important dans la persistance et la biodistribution des transplantés haMSCs10. Récemment, notre groupe a démontré que les injections intra-articulaires de haMSCs a persisté plus dans un environnement de KOA pathologi...

L’arthrose du genou (KOA) est une affection dégénérative résultant de la perte du cartilage articulaire et de l’inflammation progressive, qui est devenu une maladie chronique importante chez les personnes âgées autour du monde1. Toutefois, les traitements actuels à l’aide d’anti-inflammatoires non stéroïdiens, les suppléments physiques et interventions chirurgicales ne peuvent fournir un soulagement temporaire pour douleur symptomatique2.
Dérivé d’adipeux mésenchymateuses des cellules souches humaines (haMSCs) sont devenus un remède prometteur régénératrice pour l’arthrose du genou, en raison de leur potentiel de régénération du cartilage et de propriétés immunomodulatrices3, la différenciation multipotente 4. Par rapport aux routes pharmacologiques pour étudier les mécanismes d’action, en vivo, suivi haMSCs vivants dans des modèles animaux de petit KOA est actuellement instructif d’établir la raison d’être et de la faisabilité du traitement haMSC avant l’application clinique. Pour les essais précliniques, méniscectomie interne (MM) déstabilise la charge mécanique de l’articulation pour induire KOA chez les rats, qui fournit un modèle relativement faisable avec reproductibilité conforme5. L’apparition de KOA induite par MM est antérieure à la résection du ligament seule ou combinée avec une méniscectomie interne partielle6. Par conséquent, les interactions à long terme entre haMSCs injecté avec le microenvironnement pathologique de KOA sont souvent évaluées chez les rats induits par MM7,8.
Bien que l’efficacité thérapeutique de haMSCs a été largement rapportés, les connaissances sur la persistance en vivo de haMSCs implantés par injection intra-articulaire de (IA) est rare9,10. Par conséquent, différentes méthodes de marquage cellulaires ont été développés, y compris l’immunohistologie11,12de la luciférase, transfection13 protéine fluorescente verte, oxyde de fer d’étiquetage pour l’imagerie par résonance magnétique (IRM)14 et de nombreuses cellules fluorescentes colorants8,15,16. Par rapport aux analyses histologiques à forte main-d'oeuvre, in vivo imagerie non invasive emploie des dispositifs optiques pour détecter la distribution en temps réel et la dynamique de cellules marquées avec signaux fluorescents10,17. Pour l’imagerie de cellules vivantes fonctionnelle, cytocompatible marquage fluorescent est une technique de suivi sophistiqué radioactifs exempt de révéler des activités cellulaires après transplantation de cellules souches18. En outre, multicolores fluorochromes lipophiles possèdent des avantages par rapport aux colorants hydrophiles amino-réactifs ou des protéines fluorescentes, y compris leur perméabilité cellulaire améliorée et la fluorescence accrue de rendements quantiques19.
Ainsi, les protocoles inclus ici utilisent un rouge laser pour exciter des cellules marquées avec carbocyanines lipophiles a fait (DilC18(5)), qui est un rouge sombre fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analogique20. Les spectres d’excitation et d’émission décalée vers le rouge des évite les interférences auto-fluorescente et permet aux tissus profonds d’imagerie sur une longue période de temps dans les animaux vivants8. Cette méthode de suivi des cellules en vivo étiqueté avec est valide pour la surveillance des cellules souches transplantées, tels que haMSCs, dans des modèles animaux, qui est essentiel pour comprendre et améliorer l’actuel thérapie régénératrice des cellules souches.

<table><tbody><tr><td>Matrx VMR système d’anesthésie animale</td><td>Midmark</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>4-0 suture</td><td>Shanghai Jinhuan</td><td>KC439</td><td></td></tr><tr><td>Rasoir</td><td>Pritech</td><td>LD-9987</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.</td><td>Aucun</td><td></td></tr><tr><td>Solution de chlorure de sodium à 0,9 %</td><td>Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td><td></td>H43020455</tr><tr><td>Pénicilline</td><td>Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td> Buprénorphine <td></td></tr><tr><td></td><td>Institut de recherche pharmaceutique de Tianjin Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>Aucun</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>Dilué à la concentration finale de 10 % dans du PBS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Dilué à la concentration finale de 20 % dans une solution d’hématoxyline PBS</td></tr><tr><td>à 0,1 %, Mayer' s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>0,5 % Eosin Y solution, alcoolique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8884</td><td></td></tr><tr><td>Fast</td><td>Green Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor</td><td>Thermo Fisher</td><td>A78400006</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Histocentre&trade ; 3 Tissue Embedding Centre</td><td>Thermo Fisher</td><td>B64100010</td><td></td></tr><tr><td>Microtome rotatif entièrement automatisé</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Sondes moléculaires, Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM High Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 10 cm</td><td>Centrifugeuse Corning</td><td>V118877</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>Optima MAX-TL</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % Trypan Blue solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Titetamme</td><td>Virbac (Zoletil 50)</td><td>1000000188</td><td></td></tr><tr><td>Zolazepam</td><td>Virbac (Zoletil 50)</td><td>1000000188</td><td></td></tr><tr><td>Seringue hyposermique stérile à usage unique 26G</td><td>Shanghai Misawa Medical Industry</td><td>Aucun</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum Système d’imagerie in vivo</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging 4.0 logiciel</td><td>PerkinElmer</td><td>Aucun</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo suivi des humains dérivés adipeux cellules souches mésenchymateuses dans un modèle de l’arthrose du genou de rat avec un colorant fluorescent membrane lipophiles

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Afin de soutenir l’application clinique de thérapie dérivée adipeux mésenchymateuses cellules souches humaines (haMSC) pour l’arthrose du genou (KOA), nous avons examiné l’efficacité de la persistance de cellules et de biodistribution des haMSCs dans des modèles animaux. Nous avons démontré une méthode pour étiqueter la membrane cellulaire de haMSCs avec un colorant fluorescent lipophile. Par la suite, une injection intra-articulaire des cellules marquées chez les rats avec KOA induite chirurgicalement surveillait dynamiquement par un in vivo système d’imagerie. Nous avons utilisé les lipophiles carbocyanines (DilC18 (5)), un analogue de Dil (dialkylcarbocyanines) fluorescent rouge sombre, qui utilise un laser rouge pour éviter l’excitation de l’autofluorescence verte naturelle des tissus environnants. Par ailleurs, les spectres d’émission décalée vers le rouge d’autorisé imagerie profonde des tissus animaux vivants et la procédure d’étiquetage ne causé aucun effets cytotoxiques ou des dommages fonctionnel à haMSCs. Cette approche s’est avérée être une méthode de suivi efficace pour haMSCs dans un modèle de rat KOA. L’application de cette méthode pourrait également être utilisée pour déterminer l’itinéraire optimal d’administration et la posologie de MSCs provenant d’autres sources dans des études précliniques.

Afin d’inciter le modèle KOA, MM a été réalisée dans l’articulation du genou droit de rats SD (Figure 3). Huit semaines après la chirurgie, des rats ont été sacrifiés et les coupes sériées de l’articulation du genou ont été évalués avec les deux H &#38; E et safranine O/Fast Green coloration (Figure 4). H &#38; E coloration, la surface du cartilage articulaire présentait des frontières plus rude dans les genoux de chirurgie à l’a...

Ce protocole décrit un moyen efficace de contrôler la persistance de la cellule et la biodistribution des dérivés adipeux mésenchymateuses des cellules souches humaines (haMSCs) par fluorescence rouge sombre étiquetage dans un modèle de l’arthrose (KOA) de genou de rat par injection intra-articulaire de (IA).

In Vivo Suivi des humains dérivés adipeux cellules souches mésenchymateuses dans un modèle de l’arthrose du genou de Rat avec un colorant Fluorescent Membrane lipophiles

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer l'efficacité de la persistance cellulaire et de la biodistribution de cellules souches mésenchymateuses dérivées de tissu adipeux humain dans un modèle de rat atteint d'arthrite du genou, ou modèle de KOA, à l'aide d'une imagerie fluorescente in vivo. Le suivi in vivo des cellules souches peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative concernant l'irritation et la distribution des cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain dans des modèles animaux de KOA. Le principal avantage de l'utilisation de DiD est que son spectre d'émission décalé vers le rouge permet une imagerie en profondeur des tissus chez des animaux vivants, sans effets cytotoxiques ni dommages fonctionnels sur les cellules marquées par le colorant.Commencez par placer un rat mâle Sprague Dawley anesthésié pesant entre 250 et 300 grammes et âgé de huit à douze semaines en position latérale gauche sur un tapis chauffant. Utilisez un rasoir pour raser complètement le genou droit, puis désinfectez la zone chirurgicale avec une solution de povidone-iodée à 10 % et de l’éthanol à 70 %. Recouvrez la zone non chirurgicale avec un champ opératoire.Et utilisez un scalpel pour faire une incision de deux centimètres de long selon le tendon rotulien afin d’exposer les capsules articulaires. Ensuite, utilisez un scalpel chirurgical pour sectionner le ligament collatéral médial, déplacez le ménisque vers le fémur, puis saisissez le ménisque médial avec une pince. Utilisez un scalpel pour couper le ménisque à son point le plus étroit, à partir de son insertion tibiale.Pour obtenir un début de KOA fiable et réalisable, le côté fémoral du ménisque doit être complètement sectionné chez chaque animal expérimental. Ensuite, refermer la capsule articulaire avec un point de suture résorbable 4/0 et surveiller le rat jusqu’à ce qu’il soit complètement récupéré. Huit semaines après la chirurgie, détacher des cellules mésenchymateuses dérivées de tissu adipeux humain d’une culture à 80 % de confluence à l’aide de deux millilitres de trypsine-EDTA pendant trois minutes à 37 degrés celsius.Après quelques minutes, neutralisez la trypsine avec quatre millilitres de milieu de culture complet et recueillez les cellules par centrifugation. Resuspendez le culot à une concentration de un fois dix puissance six cellules par millilitre dans cinq millilitres de milieu de culture sans sérum. Incubez les cellules avec 50 microlitres de solution de marquage DiD pendant 50 minutes à 37 degrés Celsius.À la fin de l'incubation, recueillir les cellules par centrifugation et les laver deux fois dans cinq millilitres de PBS par lavage. Après la dernière centrifugation, diluer les cellules à une concentration de 2,5 × 10⁶ cellules viables par 100 microlitres de PBS, puis charger les cellules dans une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 26. Ensuite, raser à nouveau le genou arthritique du premier animal expérimental afin d'exposer la zone articulaire, et désinfecter la peau exposée avec de l'éthanol à 70 %.Injectez les cellules marquées au centre du triangle formé par le côté médial du ligament patellaire, le condyle fémoral médial et le condyle tibial médial, puis ouvrez le logiciel d'imagerie. Initialisez le système d'imagerie bioluminescente in vivo et placez les animaux en position dorsale sur la plateforme centrale du système d'imagerie. Une fois la porte de la chambre fermée, vérifiez la boîte fluorescente et sélectionnez les jeux de filtres appropriés pour l'excitation et l'émission fluorescente.Régler le champ de vision sur D, la courbure des pixels sur huit, le diaphragme sur deux et le temps d'exposition sur automatique. Après avoir obtenu les images, laisser les animaux se remettre sur un tapis chauffant avec surveillance jusqu'à récupération complète. Ensuite, dans le logiciel d'analyse d'image approprié, sélectionner les unités d'efficacité radiante pour la mesure de la fluorescence ainsi que les régions d'intérêt à analyser, puis quantifier les signaux fluorescents provenant de chaque image.Dans cette expérience représentative, des sections sériées de l'articulation du genou d'un rat ayant un genou ostéoarthritique ont été évaluées par coloration H&E et safranin O/vert rapide huit semaines après la chirurgie. L'épaisseur du cartilage articulaire est plus faible dans les genoux arthritiques que dans les articulations contralatérales non opérées, comme observé sur les coupes colorées à l'H&E. De plus, la protéoglycane est diminuée et le collagène fibrillé est accru dans l'articulation arthrosique, tel que visualisé par la coloration au safranin O/vert rapide, indiquant la progression du phénotype ostéoarthritique dégénératif induit par la chirurgie.Une heure après la coloration, les cellules mésenchymateuses humaines dérivées du tissu adipeux marquées au DiD présentent une forme arrondie in vitro. Après 24 heures, les cellules mésenchymateuses marquées au DiD en culture montrent une forme allongée en fuseau, ce qui confirme que le DiD n'altère pas la capacité d'adhérence des cellules. L'imagerie des genoux des animaux atteints d'ostéoarthrite huit semaines après la chirurgie révèle la présence des cellules marquées au DiD depuis le jour zéro jusqu'au jour 70 suivant l'injection.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie par cellules souches pour déterminer le protocole et la posologie optimaux permettant une injection sûre et réalisable de cellules souches mésenchymateuses dans le traitement de l'ostéoarthrite du genou chez les animaux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment marquer des cellules souches mésenchymateuses humaines avec du DiD pour l'injection et le suivi in vivo dans un modèle de rat KOA induit chirurgicalement.

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Cette vidéo montre des techniques pour l'étiquetage des cellules souches embryonnaires humaines et des cellules souches mésenchymateuses avec des colorants fluorescents. Cette technique peut être utilisée pour un suivi in ​​vivo des cellules souches transplantées avec l'imagerie optique et des corrélations histopathologiques avec la microscopie à fluorescence.

Étiquetage des cellules souches avec des colorants fluorescents pour les non-invasive de détection avec l&#39;imagerie optique

Suivi dynamique de prise de greffe musculaire chez les petits animaux par des In Vivo Fluorescent Imaging

Nous décrivons un multi-angle de rotation du système optique d'imagerie (Maroi) pour la quantification in vivo d'un marqueur fluorescent émis par la saposine C (SAPC), dioléoylphosphatidylsérine (DOPS) nanovésicules. En utilisant des modèles murins de cancer et l'arthrite, nous montrons comment la Maroi analyse de la courbe du signal peut être utilisé pour la cartographie et la caractérisation biologique précis des processus pathologiques.

In Vivo L&#39;imagerie optique de tumeurs cérébrales et l&#39;arthrite Utilisation fluorescent SAPC-DOPS nanovésicules

Les monocytes sont des régulateurs clés de l’immunité innée et jouent un rôle critique dans le renouvellement du système phagocytaire mononucléaire périphérique et en cas d’inflammation. Ce manuscrit décrit la procédure d’imagerie en temps réel de la moelle osseuse de la calvaria de souris pour étudier le mécanisme de mobilisation des monocytes.

Suivi moelle osseuse de souris monocytes<em&gt; In Vivo</em

Ce protocole décrit le radiomarquage des cellules souches mésenchymateuses équines et leur implantation dans les lésions tendineuses chez le cheval afin de déterminer la survie cellulaire et la distribution tissulaire à l’aide de la scintigraphie gamma.

Imagerie in vivo et le suivi de technétium 99m Étiqueté moelle osseuse Cellules souches mésenchymateuses dans Tendinopathie Hippique

Le protocole décrit un nouveau modèle de chambre fenêtre du fémur murin qui peut être utilisé pour suivre le mouvement des cellules dans la moelle osseuse fémorale in vivo. La microscopie à fluorescence multiphotonique intravitale est utilisée pour imager trois composants de la moelle osseuse fémorale (système vasculaire, matrice de collagène et neutrophiles) au fil du temps.

Fémur Fenêtre Chambre Modèle pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des cellules dans la moelle osseuse murine

Murines études sur des modèles d’inflammation du côlon ont montré qu’un faible pourcentage (1-5 %) des cellules souches mésenchymateuses (CSM) injecté par voie intraveineuse ou par voie intrapéritonéale à domicile à l’inflammation du côlon1,2. Cette étude montre que guidée par échographie intracardiaques injections de MSCs entraîner localisation accrue à l’intestin.

Guidée par échographie intracardiaque Injection des cellules souches mésenchymateuses d’augmenter le retour vers l’intestin pour une utilisation dans des modèles murins de maladies intestinales inflammatoires expérimentale

Les méthodes traditionnelles d’évaluation de la différenciation adipocytaire sont bon marché et facile à utiliser, mais ne sont pas spécifiques aux changements dans l’expression des gènes. Nous avons développé un test afin de quantifier la différenciation des cellules mésenchymateuses en adipocytes matures à l’aide d’un marqueur spécifique de la lignée. Ce dosage a diverses applications dans la recherche fondamentale et de la médecine clinique.

Visualisation et la Quantification du potentiel de différenciation des cellules mésenchymateuses adipocytaire avec un marqueur spécifique de la lignée

Ici, nous décrivons un protocole pour isoler, cultiver et phénotyper des cellules endothéliales microvasculaires à partir de tissu adipeux sous-cutané humain (hSATMVECs). De plus, nous décrivons un modèle expérimental de diaphonie hSATMVEC-adipocyte.

Étude de la diaphonie entre les cellules endothéliales adipeuses adipeuses et les adipocytes dans le tissu adipeux sous-cutané humain

En utilisant un modèle explant ex vivo , de petits morceaux de la portion rostrale du tissu adipeux blanc viscéral provenant de souris maigres sont cultivés pendant 7 à 10 jours, permettant l’induction et l’étude de l’inflammation du tissu adipeux lors de l’alimentation riche en graisses.

Un modèle murin ex vivo pour l’inflammation du tissu adipeux riche en graisses

Découvrez le suivi in vivo des cellules souches mésenchymateuses humaines dérivées du tissu adipeux dans un modèle d'arthrose du genou chez le rat en utilisant le marquage fluorescent DiD. Cette méthode permet d'évaluer la persistance et la biodistribution cellulaire.

In Vivo Suivi des humains dérivés adipeux cellules souches mésenchymateuses dans un modèle de l’arthrose du genou de Rat avec un colorant Fluorescent Membrane lipophiles (Vidéo) | JoVE Journal

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