Name: Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Découvrez une méthode rapide de différenciation des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ce protocole utilise des facteurs de croissance et des petites molécules pour obtenir des cellules immatures en 14 jours et des cellules fonctionnelles matures après trois mois.

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Ce travail a été soutenu par l’Initiative de Garland pour la Vision, le California Institute pour la médecine régénérative (CIRM ; subventions DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 et TG2-01151), The Vermont Community Foundation, la Fondation Breaux, ainsi que la Fondation lutte contre Wynn-Gund programme d’accélération de la recherche translationnelle de la cécité.

1. préparation des réactifs pour jour 0 au jour 14 du protocole <ol><li>préparer les composantes moyennes suivantes : <ol><li>faire 100 mL de différenciation rétinienne moyen (RDM) en ajoutant 1 mL de 100 x N2 supplément, 2 mL de 50 x B27 supplément et 1 mL de 100 x aminoacide non essentiels (NEAA) à 96 mL de Dulbecco &#39; s modifié mélange de médium/nutriments essentiel 9 F12 (DMEM/F12).</li>
		<li>Faire 10 mL de la nicotinamide (NIC) de 1 M par dissolution g 1,221 de NIC dans 8 mL d’eau stérile, Vortex et porter le volume à 10 mL avec de l’eau stérile. La solution du filtre stérile.</li>
	</ol></li> <li>Préparer la suivante des facteurs de croissance et de petites molécules : <ol><li>caboche de souris recombinante de reconstituer, inhibiteur signalisation de voie WNT dickkopf humain 1 (DKK-1) et d’IGF-1 à 100 µg/mL chaque dans 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans une solution tamponnée au phosphate (PBS). Aliquote selon les besoins et les conserver à-20 ° C pendant 3 mois.</li>
		<li>Reconstituer FGF-basic à 10 µg/mL et recombinante humaines/souris/rat activine A à 100 µg/mL chaque BSA de 0,1 % dans du PBS. Aliquote selon les besoins et les conserver à-80 ° C pendant 1 an.</li>
		<li>Reconstituer SU 5402 (inhibiteur de kinase de tyrosine de récepteur spécifique FGF) et CHIR99021 (glycogène synthase kinase 3, GSK-3β, inhibiteur) à 10 mM de chaque dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Aliquote et conserver à-20 ° C jusqu'à 1 an ou 6 mois, respectivement.</li>
	</ol></li> <li>Obtenir ce qui suit pour jour 0 et/ou de la solution d’acide (EDTA) à la x ethylenediaminetetraacetic 14 : 1 jour (0,2 g EDTA par 1 L de PBS), 1 X PBS- / - enzyme de trypsine dissociation (PBS sans calcium ou magnésium, pH 7,4), 1 x (TDE), SPD (Dulbecco &#39; s PBS), RPE soutien médium (RSM) et Y-27632 dihydrochloride (utilisation à 10 µM).</li>
</ol> 2. Jour 0 : Journée de Passage de cellules souches pluripotentes de différenciation <ol><li>Grow colonies de cellules souches dans des conditions sans chargeur et sans sérum pour environ 80 % de confluence avant passage. 
	Remarque : Voir la discussion pour plus d’informations sur l’optimisation de cette étape.</li>
	<li>Recouvrir une plaque de 12 puits avec hydrogel axée sur la matrice extracellulaire (ECMH) selon les recommandations du fabricant. Laisser pour reposer pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Partie aliquote du volume de RDM et PBS- / - nécessaire pour le jour 0 et chaud dans un bain-marie à 37 ° C avant d’ajouter des facteurs de croissance. Ramener l’EDTA à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter des facteurs de croissance nécessaires pour jour 0 de la RDM chauffée avec 10 mM NIC, 50 caboche ng/mL, 10 ng/mL DKK-1 et 10 ng/mL IGF-1. Provenant des stocks décrits à l’étape 1.2, ajouter 100 µL de NIC, 5 µl de caboche, 1 µL de DKK-1 et 1 µL d’IGF-1 dans 10 mL de RDM.</li>
	<li>Choisir de retirer toutes les colonies différenciées fondées sur la morphologie des cellules souches qui vont être repiquées pour la différenciation. Utiliser un embout de pipette de P10 pour supprimer manuellement les cellules différenciées. 
	NOTE : Les cellules fibroblastiques entre colonies ainsi que les cellules opaques au sein de colonies indiquent des cellules différenciées à supprimer. Voir la discussion pour savoir de cellules différenciées.</li>
	<li>Un seul puits d’une plaque de 6 puits le passage vers 4 puits d’une plaque de 12 puits (1:4). 
	Remarque : Voir la discussion pour plus d’informations sur le passage des cellules souches à ce stade.
	<ol><li>Aspirer le moyen de cellules souches des cellules souches et laver les puits une fois avec 2 mL de PBS préchauffé- / -.</li>
		<li>PBS aspirer- / - et rinçage chaque puits trois fois avec 1 mL d’EDTA / puits d’une plaque de 6 puits.</li>
		<li>Délicatement la plaque d’inclinaison et aspirer l’EDTA. Ne pas agiter la plaque en quelque sorte pour éviter la levée prématurément les cellules.</li>
		<li>Après le troisième lavage, ajouter 1 mL d’EDTA et incuber à température ambiante dans la hotte pendant 3-5 min. Ne pas déranger la plaque pendant cette incubation.</li>
		<li>Aspirer l’EDTA et ajouter 1 mL de RDM / puits qui sera amorcé avec 0,5 mL de milieu supplémentaire. Par exemple, laver 1 bien sur une plaque de 6 puits avec 4,5 mL de RDM plaque sur 4 puits d’une plaque de 12 puits.</li>
		<li>Utiliser un grattoir de cellules pour détacher délicatement les cellules. Collecter toutes les cellules dans un tube à fond conique et triturer les cellules en RDM en pipettant également monter et descendre 5 fois. Dissocier les grands amas de cellules, mais triturer pas à suspension cellulaire unique. Distribuer les cellules uniformément dans la pipette. Terminer cette étape rapidement afin d’éviter le rattachement à la plaque.</li>
		<li>Graines de cellules sur les plaques de 12 puits ECM-enduit (1 mL de suspension de cellules / puits).</li>
		<li>Inclinaison de la plaque avant et en arrière pour répartir les cellules uniformément tout au long du puits. Placer délicatement dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5 % de CO 2 jusqu’au prochain changement moyen.</li>
		<li>Noter l’heure exacte. Milieu de changement à la même heure chaque jour.</li>
	</ol></li></ol> 3. Jour 1 à 14 : Addition de facteurs de croissance <ol><li>jour 1 : changer le support sur tous les puits (1 mL / puits) à l’aide de RDM avec la composition de facteur de croissance pour jour 0 (voir étape 2,4).</li>
	<li>Jour 2 : changer le support à l’aide de RDM (1 mL / puits) avec 10 mM NIC, 5 ng/mL FGF-basic, 10 caboche ng/mL, 10 ng/mL DKK-1 et 10 ng/mL de IGF-1. Provenant des stocks décrits à l’étape 1.2, ajouter 100 µL de NIC, 5 µL de FGF-basic, 1 µL de caboche, 1 µL de DKK1 et 1 µL d’IGF1 dans 10 mL de RDM.</li>
	<li>Jour 4 : changer le support à l’aide de RDM (1 mL / puits) avec 100 ng/mL activine A 10 ng/mL DKK-1 et 10 ng/mL de IGF-1. Provenant des stocks décrits à l’étape 1.2, ajouter 10 µL de l’activine A, 1 µL de DKK1 et 1 µL d’IGF-1 dans 10 mL de RDM. 
	Remarque : Observez qu’à ce stade, les cellules sont confluentes.</li>
	<li>Jour 6 : changer le support à l’aide de RDM (1 mL / puits) avec 100 ng/mL activine A et 10 µM SU 5402. Provenant des stocks décrits à l’étape 1.2, ajouter 10 µL de l’activine A et 10 µL de SU 5402 à 10 mL de RDM.</li>
	<li>8, 10 et 12 jours : changer le support à l’aide de RDM (1 mL / puits) avec 3 µM, 10 µM SU 5402 et 100 ng/mL activine A CHIR99021. Provenant des stocks décrits à l’étape 1.2, ajouter 10 µL de l’activine A, 10 µL de SU 5402 et 3 µL de CHIR99021 à 10 mL de RDM.</li>
</ol> 4. Journée d’enrichissement au Passage 0 du pre <ol><li>manteau une plaque 6 puits avec facteur de croissance réduite ECMH selon les recommandations du fabricant. Laisser pour reposer pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Partie aliquote du volume de SPD nécessaires et 1 mL de RDM / puits d’enrichissement et bien au chaud dans un bain-marie à 37 ° C. Placez le TDE à température ambiante et chaud volume nécessaire de RSM, réactif aux antimicrobiens et Y-27632 à 37 ° C.</li>
	<li>Ajouter réactif antimicrobien et Y-27632 obtenir x 0,5 et 10 compositions µM respectivement à RSM. Utiliser ce moyen de communication pour les premiers jours de 4 à 7 pour améliorer attachement.</li>
	<li>Aspiration moyen usé de tous les puits et ajouter 1 mL par puits de RDM préchauffé (pas de facteurs de croissance requis).</li>
	<li>à l’aide d’un microscope à dissection, disséquer et gratter toutes les cellules non-RPE à l’aide d’une pointe de pipette P10 manuellement. 
	Remarque : Voir la section résultats représentatifs pour exemples.</li>
	<li>Après dissection, aspirer RDM et tous les débris de cellules. Laver deux fois avec 1 mL de préchauffé SPD / puits.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de TDE / puits d’une plaque de 12 puits et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Utilisez un grattoir de cellules pour enlever doucement les cellules de la plaque. Utiliser une pipette P1000 pour triturer doucement la suspension cellulaire/TDE en pipettant également haut et en bas de 3 - 4 fois pour créer une suspension uniforme.</li>
	<li>Diluer la suspension cellulaire/TDE 01:10 dans RSM préchauffé, sans Y-27632. Centrifuger la suspension cellulaire à 173 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer le moyen du culot cellulaire et remettre en suspension les cellules de RSM avec 10 µM Y-27632 (enrichi en 1 mL par puits).</li>
	<li>Souche les cellules à l’aide d’une passoire de cellule de maille en nylon avec 40 µm pores. Compter le nombre de cellules dans un volume déterminé à l’aide d’un hémocytomètre et calculer la concentration de cellules dans la solution tendue.</li>
	<li>Cellules de semence sur le facteur de croissance réduite ECM revêtu de plaques à 1 x 10 5 cellules/cm 2 à 4 mL de RSM à 10 µM Y-27632.</li>
	<li>Remplacer le SMR avec 10 µM Y-27632 48 h après l’ensemencement de la cellule et continuer à remplacer le support tous les 3-4 jours (par exemple les lundis et jeudis). Ne remplacez pas les 10 µM Y-27632 après 4 à 7 jours.</li>
	<li>Autoriser les cellules à mûrir pendant 28 à 35 jours à 37 ° C et 5 % de CO 2. Continuer à remplacer le SMR tous les 3-4 jours (par exemple les lundis et jeudis).</li>
</ol> 5. Maturation : Passage 1 et 2 du pre Remarque : volumes sont indiqués pour 1 bien sur une plaque de 6 puits ou une fiole T75, comme il est indiqué entre parenthèses.
<ol><li>Entre les jours 28 à 35 passage 0, recouvrir une plaque de 6 puits (fiole T75) avec ECMH selon les recommandations du fabricant.</li>
	<li>Partie aliquote du volume de SPD et RSM nécessaire et chaud dans un bain-marie à 37 ° C. mettre TDE à température ambiante.</li>
	<li>Aspiration passé moyen des puits et laver chaque bien deux fois avec 2 mL (10 mL) de SPD préchauffé. 
	Remarque : N’utilisez pas de 10 µM Y-27632.</li>
	<li>SPD aspirer et ajouter 1 mL (5 mL) de TDE. Placer dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO 2 pendant 5 min. Après incubation, les cellules de vue sur un microscope inversé pour confirmer les cellules sont contractantes et détacher.</li>
	<li>à l’aide d’un grattoir de cellules Fluxsol, retirez doucement les cellules du fond du puits ou du flacon.</li>
	<li>Utiliser un embout de P1000 (pipette sérologique de 10 mL) à triturer doucement la suspension cellulaire/TDE haut et bas 3 ou 4 fois pour créer une suspension uniforme.</li>
	<li>Diluer cellule suspension 01:10 dans RSM. 2 mL (5 mL) de la réserve du RSM pour rincer le puits/ballon et ajouter à la suspension cellulaire dilué. 
	Remarque : Ne pas laisser des temps d’exposition enzyme dépasser 25 min.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 173 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer le moyen du culot cellulaire et remettre en suspension les cellules de 1 mL (5 mL) de RSM</li>
	<li>Souche les cellules à l’aide d’une passoire de cellule de maille en nylon avec 40 µm pores. Compter le nombre de cellules dans un volume déterminé à l’aide d’un hémocytomètre et calculer la concentration de cellules dans la solution tendue.</li>
	<li>Graines de cellules sur les plaques de revêtement ECMH à 1 x 10 5 cellules/cm 2 à 4 mL (15 mL) de RSM.</li>
	<li>Autoriser les cellules à mûrir pendant 30 jours. Continuer à changer le SMR tous les jours 3-4.</li>
	<li>Répéter la procédure ci-dessus (étape 5.2-5.11) à 30 pour le passage des cellules de passage de 1 à 2 jours.</li>
</ol> 6. Création d’une banque de cellules intermédiaires : cryopréservation de Passage 2 jour pre 3-5 Remarque : cryoconservé cellules alors qu’ils sont sous-confluentes (~ 50 %) et n’ont pas retrouvé de pigment.
<ol><li>Basée sur le nombre de cellules, calculer le volume de milieu de cryoconservation avec 10 % DMSO nécessaire pour remettre en suspension les cellules à une concentration de 3 x 10 6 cellules/mL.</li>
	<li>Suivre les étapes 5,2 à 5,8. Resuspendre le culot dans le milieu de cryoconservation avec 10 % DMSO à 3 x 10 6 cellules/mL et transférer 1 mL de la suspension cellulaire dans flacons cryogéniques de 1,2 mL.</li>
	<li>Placer les fioles cryogéniques dans un récipient gel conçu pour refroidir à-1 ° C/min et placez à-80 ° C durant la nuit. Transfert à l’azote liquide pour le stockage à long terme. 
	Remarque : Ces cellules seront passage 3 après décongélation. La culture des cellules pendant 30 jours avant la caractérisation. Graine de passage 3 RPE à 1,5 x 10 5 cm 2 à la décongélation. 2 , 4 , 6 , 7</li></ol>

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</ol>

M. Clegg est co-fondateur de régénératrice Patch Technologies LLC.

Ce protocole décrit comment produire des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes. La méthode a été optimisée à l’aide de deux des cellules souches pluripotentes embryonnaires et induits par une méthode de culture sans sérum exempt d’engraissement. Depuis l’isolement initial de cellules souches embryonnaires humaines en 1998 et la dérivation des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en 2007, une multitude de culture de cellules souches méthodes ont été mis au point14,15,16, 17. Ces méthodes doivent être suffisantes pour produire des colonies de cellules souches qui sont sensibles à cette différenciation. Il n’y a pas de limitation connue à l’applicabilité de cette méthode pour les cellules souches pluripotentes correctement dérivées et entretenu.
Les étapes plus critiques sont le passage des cellules souches au jour 0 de différenciation (étape 2.5) et la nécessité éventuelle de dissection manuelle au 14e jour du processus (étape 4.5). Lors de la cueillette pour éliminer les cellules différenciées des colonies de cellules souches, voir les images dans le Kent,18. Comme indiqué, les cellules fibroblastiques entre les colonies et les cellules opaques au sein de colonies indiquent des cellules différenciées qui doivent être supprimés avant de commencer ce protocole18. Seules colonies indifférenciées, serrés avec bords définis doivent être repiquées pour la différenciation.
Le nombre de cellules souches ensemencées par puits (étape 2.6.7) est compliqué par le fait que les cellules souches ne peut pas être triturés dans une suspension de cellules du même passage et ne peut pas compter avec précision à l’aide d’un hémocytomètre. Le rapprochement des cellules souches confluentes de 80 % est indiqué pour 1 passage bien d’une plaque de 6 puits en 4 puits d’une plaque de 12 puits. Différences entre les lignées de cellules souches, tels que les taux de croissance, peuvent affecter la rapidité la RPE immature atteignent confluence entre jours 0 à 4. Les cellules souches produit RPE indépendamment de confluence précis, mais le rendement de la cellule sera négativement affecté si les cellules sont trop rares à ce stade. Les cellules immatures de la RPE devraient être environ 40-50 % anastomosé les jours 1 et presque 100 % anastomosé par jour 4. Si les cellules ne produisent pas une monocouche confluente par jour 4 ou 6, le protocole doit être répété à une densité de semis plus élevée au jour 0. Par exemple, si 1 bien sur une plaque de 6 puits a été repiquées sur 4 puits d’une plaque de 12 puits au jour 0 et le RPE immature ne sont pas 100 % anastomosé au jour 4, réduisez l’ensemencement d’un passage de 1 / 3 ou 1 / 2 jour 0 ou permettre les cellules souches devenir plus confluentes avant le passage. Il est essentiel d’établir une densité de semis uniforme lorsqu’on compare plusieurs lignées cellulaires.
L’étape de dissection manuelle au 14e jour est nécessaire uniquement lorsque les cellules non-RPE sont présentes dans la culture (Figure 2). Depuis l’ajout de CHIR99021 au protocole, plusieurs lignées de cellules souches pluripotentes ne nécessitent peu ou aucun dissection manuelle. Certaines préparations ont une incidence plus élevée des patchs neurones et il est essentiel d’éliminer ces cellules. Si le RPE n’est pas viable à passage 0 passage 3, il est possible de répéter le protocole de différenciation prendre suffisamment de temps pour enlever toutes les cellules non-RPE. Ce n’est pas fréquent, mais il est mentionné ici de noter que l’étape de dissection au jour 14 peut être optimisée lorsque nécessaire.
Il existe une variété de protocoles de différenciation RPE qui varient en coût ainsi que les méthodes de culture, efficacité, quantification et évaluation fonctionnelle, laquelle a été examiné soigneusement2. Nous préférons la méthode 14 jours détaillée ici en raison de son efficacité, adaptabilité et l’applicabilité à un large éventail de cell lines4,7,8. L’étape de cryoconservation dans le présent protocole fournit également un atout majeur dans la création d’une banque de cellules intermédiaires pour une utilisation future, en évitant de lot à lot variabilité dans les expériences. À partir de seulement 4 puits d’une plaque de 12 puits, il est possible de développer en plaques 6 puits au passage 0 et T75 flacons au passage 1 et 2. Au passage 2 jours 3 à 5, lorsque les cellules sont encore sont et n’ont pas retrouvé de pigment, il est possible de cryopréserver des dizaines de millions de cellules et décongeler puis le pre mature, désigné passage 30 3 jours, pour vérifier l’expression RNA, expression de la protéine, facteur de croissance sécrétion, phagocytose, etc.. Nous avons également établi des protocoles visant à étendre les RPE pour jusqu'à 13 passages 19.
Impatient, cette méthode sera utile pour iPSC modélisation des maladies oculaires et génération de RPE thérapie cellulaire. En ce qui concerne la modélisation de maladies iPSC, ce protocole est actuellement utilisé en laboratoire pour produire des RPE de lignes CRISPR-corrigé avec contrôles non corrigées chez le même patient. En outre, ce protocole est adaptable aux substrats synthétiques et des conditions sans xeno qui sont utiles pour respecter les bonnes pratiques de fabrication requis pour une thérapie cellulaire.

L’épithélium pigmentaire rétinien est une monocouche de cellules pigmentées qui fournit un soutien crucial pour les photorécepteurs. Cellules épithéliales pigmentaire rétinien (RPE) ont de nombreuses fonctions dans la vision, y compris l’absorption de la lumière, transport des éléments nutritifs et ion, rétinoïdes, cyclisme, phagocytose de photorécepteur de segment externe, et1de la sécrétion de facteur de croissance. Il existe une variété des dystrophies rétiniennes qui affectent la fonction des RPE et entraînent une perte de vision, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge et une rétinite pigmentaire. Génération de RPE de cellules souches pluripotentes peut-être faciliter la recherche pour comprendre ces maladies de l’oeil et peut fournir une source illimitée de RPE pour cellule thérapies2. En fait, plusieurs essais cliniques sont en cours utilisant RPE dérivé de cellules souches pluripotentes3.
Ce protocole de différenciation a été initialement décrite par Buchholz4 et reposait sur la méthode précédemment publiée de Clegg5. La procédure imite le processus de développement normal en vivo directe de cellules souches pluripotentes indifférenciées vers un destin RPE par manipulation des facteurs de croissance insuline (IGF), facteur de croissance basique des fibroblastes (FGF-2 ; FGF-basic), transformant le facteur de croissance bêta (TGF-β) et WNT voies4,5. Le protocole a été considérablement amélioré par l’addition d’un agoniste de la voie WNT tard dans le protocole, qui a donné 97,77 % ± 0,1 % pré-mélanosomes protéine (PMEL) cellules positives et a été adapté aux conditions sans xeno6,7. La RPE qui en résulte ont démontré d’exprimer les marqueurs RPE niveaux transcription et protéines, sécrètent des facteurs de croissance connus RPE avec polarité appropriée, et mener de phagocytose des photorécepteurs segments externes8. Ce protocole est plus rapide et plus fiable que les protocoles « spontanée » de différenciation qui impliquent l’effi cacité du facteur de croissance de fibroblaste de base8. En outre, séquençage RNA, les données montrent que les RPE obtenue à l’aide de ce protocole sont très similaires à ceux obtenus en utilisant le plus commun de l’approche spontanée8. La méthode 14 jours génère RPE qui correspondent à la « 5 P » mentionné par Mazzoni9 (pigmentées, polarisée, phagocytaires, post-mitotiques, polygonale)9. Alors que cette procédure s’est avéré pour être reproductibles dans plusieurs laboratoires, nous tenons à souligner plusieurs méthodes de différenciation dirigée supplémentaires qui ont été publiées au cours des dernières années10,11,12 , 13.

<table><tbody><tr><td>SterilGARD III armoire de biosécurité à flux laminaire</td><td>Baker</td><td>modèle : SG603A-HE, type : A2, classe : 2</td><td>6' Armoire de biosécurité à flux laminaire Baker</td></tr><tr><td>Hotte de dissection Hotte de dissection</td><td>modèle 3970405</td><td></td> microscope de <td>dissection à flux laminaire</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur CO2 à enveloppe d’air à platine</td> chauffée <td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td>37 oC et 5 % de CO2</td></tr><tr><td>microscope à contraste de phase inversé</td><td>Olympus</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Société</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Media Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplément</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplément</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Facteurs de croissance et réactifs </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Caboche de souris recombinante</td><td>R& D systems</td><td>1967-NG-025</td><td></td></tr><tr><td>Humain recombinant DKK-1</td><td>R& D systems</td><td>5439-DK-010</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant IGF-1</td><td>R& D systems</td><td>291-G1-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humain/souris/rat Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>SU5402 Inhibiteur du FGF</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-204308</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td><fort>Commentaires</fort></td></tr><tr><td>Substrates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Membrane Matrix, sans rouge de phénol, sans LDEV</td><td></td><td>356237</td><td>hydrogel à matrice extracellulaire (ECMH)</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualified Matrix, sans LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>facteur de croissance réduit ECMH</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Autres réactifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X Versene (EDTA)</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (sans calcium, sans magnésium)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (dissociation semblable à la trypsine enzyme, TDE)</td><td>Gibco</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 (support RPE)</td><td>Lonza</td><td>BW04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>12-541-0 (1254)</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>BioLife Solutions</td><td>210102 milieu de</td><td>cryoconservation</td></tr><tr><td>1,2 mL Flacon cryogénique</td><td>Corning</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty (contenant de congélation)</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>récipient de congélation</td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-2</td><td>réactif antimicrobien<</td></tr><tr><td>fort>Nom</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Autre équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture 12 puits</td><td>Corning</td><td>CLS3516</td><td>Utilisée lors de la différenciation.</td></tr><tr><td>Fiole T75</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>Utilisée lors de la maturation de l’EPR.</td></tr><tr><td>Plaque de culture à 6 puits</td><td>Corning</td><td>CLS3513</td><td>Utilisée lors de la maturation de l’EPR.</td></tr><tr><td>racleur à cellules</td><td>Corning</td><td>08-771-1A</td><td>Utilisé lors des passages.</td></tr><tr><td>crépine cellulaire</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Utilisé lors des passages avant le comptage cellulaire.</td></tr></tbody></table>

rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Les auteurs décrivent une méthode robuste pour diriger la différenciation des cellules souches pluripotentes dans la rétine des pigments des cellules épithéliales (RPE). Le but de fournir un protocole détaillé et complet est de démontrer clairement chaque étape et à rendre cela accessible aux chercheurs dans le domaine. Ce protocole donne une couche homogène de RPE avec dissection minime ou aucun manuelle nécessaire. La méthode présentée ici s’est avérée être efficace pour induite par les cellules souches pluripotentes (iPSC) et les cellules souches embryonnaires humaines. En outre, nous décrivons des méthodes pour la cryoconservation de banques de cellules intermédiaires qui permettent le stockage à long terme. RPE générée à l’aide de ce protocole pourrait être utile pour la modélisation de la maladie-dans-un-plat iPSC ou application clinique.

Cette méthode se traduit par la production d’une monocouche homogène, pigmentée et cubique de RPE. La chronologie dans la Figure 1 correspond aux images illustrées au tableau 2. Comme le montre la Figure 2 a, les colonies de cellules souches sont serrés avec des bords définis et aucune des cellules fibroblastiques entre colonies ou cellules opaques au sein de colonies. Figure 2 b fournit une représentation de RPE immature qui sont sous-confluentes. Si les cellules sont déjà confluentes à ce stade, ils ne peuvent pas étendre les projections qui sont essentielles pour le processus de différenciation. Les cellules qui sont sévèrement sont ne sera pas en mesure d’établir une monocouche et former des jonctions serrées, caractéristiques de l’épithélium. Détails sur la façon d’optimiser cette confluence sont décrites dans la section « discussion ». La figure 2 montre la morphologie des deux types plus communs de non-RPE survenant au cours de ce processus de différenciation : patchs neurales ou fibroblastiques. Il est important de noter que ces taches neurones apparaissent particulièrement opaques sur un microscope à dissection, tandis que les taches définies, fibroblastique-like sont presque translucides sur un microscope à dissection. Il peut être utile de délimiter ces zones sur une plaque de culture de tissus avec un stylo d’éthanol à l’épreuve de laboratoire pour les identifier plus facilement sur un composé microscope photonique et le microscope à dissection. Personnages 2D-F montrent les frontières brillantes caractéristiques, la morphologie pavées et pigmentation qui indiquent une culture saine, maturation de RPE. La figure 3 est une image de grossissement plus élevée pour montrer l’apparence différente de pleine maturité RPE dépeint par contraste de phase et au microscope à fond clair. Au passage 3 jours 30, les cellules sont prêtes pour la caractérisation qui a été décrite dans des publications antérieures, y compris expression ARN, expression de la protéine, la sécrétion de facteur de croissance et phagocytose2,4,6 ,,7. Ces caractérisations montrent que les cellules représentées dans ces images sont non seulement pigmentées et cubiques, mais également phagocytaires, post-mitotiques et polarisée.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig1.jpg"> 
Figure 1 :. Chronologie de l’addition de facteurs de croissance et de maturation des RPE. Facteurs de croissance sont ajoutés aux plaques de 12 puits de jour 0-14. Maturation des RPE sont cultivées en plaques 6 puits ou T75 flacons de jour d’enrichissement au dégel après 30 jours (passage 30 3 jours). Les flèches indiquent le passage enzymatique cellulaire. (A-E) ci-dessous les échéances correspondent aux images dans la Figure 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig2.jpg"> 
Figure 2 : morphologie représentative et confluence de maturation RPE. Cellules souches pluripotentes induites immédiatement avant le passage de différenciation (A). Immature subconfluent de cellules RPE à jour 2 (B) et avant l’enrichissement pick à enlever le jour 14 ; patchs non-RPE (indiqués par les flèches blanches) apparaissent comme des taches ou opaque « rubans » (C). RPE à passage 0, 1 et 3 sur 30 jours (D, E et F). Echelle = 200 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig3.jpg"> 
Figure 3 : maturité RPE à passage 3 : jour 30 Morphologie cubique dépeint en contraste de phase (A) et la pigmentation dépeinte dans le vif des champs (B). Echelle = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit comment produire les cellules épithéliales pigmentaire rétinien (EPR) de cellules souches pluripotentes. La méthode utilise une combinaison de facteurs de croissance et de petites molécules pour diriger la différenciation des cellules souches en RPE immature en quatorze jours et RPE mature et fonctionnel après trois mois.

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

L'objectif général de cette méthode est de diriger efficacement la différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules épithéliales pigmentaires de la rétine sous forme d'une couche homogène. Cette méthode permet de répondre à des questions dans le domaine de la recherche rétinienne et oculaire, telles que le développement de la rétine et la mise en place d'un modèle de maladie à base de cellules souches. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est plus rapide et plus efficace que les méthodes spontanées.Cette méthode utilise une combinaison de facteurs de croissance et de petites molécules pour orienter la différenciation des cellules souches en cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (RPE) immatures en 14 jours, puis en RPE fonctionnelles matures après trois mois. Cassidy Arnold, directrice adjointe du laboratoire de biologie et d'ingénierie des cellules souches de l'UC Santa Barbara, démontrera certaines étapes de la procédure. Pour commencer cette procédure, cultiver les colonies de cellules souches en conditions sans cellules nourricières et sans sérum jusqu'à une confluence d'environ 80 % avant le passage.Ensuite, recouvrir une plaque de 12 puits d'un hydrogel à base de matrice extracellulaire selon les recommandations du fabricant et laisser durcir pendant une heure à température ambiante ou toute une nuit à quatre degrés Celsius. Puis, prélever le volume de milieu de différenciation rétinienne et de PBS sans calcium ni magnésium nécessaire pour le jour zéro, et les réchauffer au bain-marie à 37 degrés Celsius. Ajouter ensuite les facteurs de croissance au milieu de différenciation rétinienne (RDM) réchauffé et porter l'EDTA à température ambiante.Si nécessaire, retirez toutes les colonies différenciées à l’aide d’une pipette P10 en vous basant sur la morphologie des cellules souches qui seront passagées pour la différenciation. Les cellules de type fibroblaste situées entre les colonies ainsi que les cellules opaques à l’intérieur des colonies indiquent les cellules différenciées à éliminer. Le retrait manuel des cellules constitue l’une des étapes les plus critiques du protocole, car le départ d’une population entièrement indifférenciée de cellules souches permettra un enrichissement plus efficace.Ensuite, passer les cellules d'un puits unique d'une plaque à six puits vers quatre puits d'une plaque à 12 puits en aspirant le milieu des cellules souches et en lavant les puits une fois avec deux millilitres de PBS préchauffé. Ensuite, aspirer le PBS et rincer chaque puits trois fois avec un millilitre d'EDTA par puits. Puis incliner doucement la plaque et aspirer l'EDTA.Ne pas agiter la plaque de quelque manière que ce soit afin d'éviter un détachement prématuré des cellules. Après le troisième lavage, ajouter à nouveau un millilitre d'EDTA et incuber la plaque à température ambiante dans la hotte pendant trois à cinq minutes. Ne pas perturber la plaque pendant cette incubation.Ensuite, aspirez l'EDTA et ajoutez un millilitre de RDM par puits à semer, plus 0,5 millilitre de milieu supplémentaire. Par exemple, lavez un puits d'une plaque à six puits avec 4,5 millilitres de RDM pour ensemencer quatre puits d'une plaque à 12 puits. Puis, utilisez un grattoir à cellules pour détacher délicatement les cellules.Triturez les cellules dans le RDM en aspirant et en expulsant cinq fois dans le puits et effectuez cette étape rapidement pour éviter la ré-attachement à la plaque. Placez dans un tube conique. Dissociez les gros agrégats cellulaires, mais ne triturez pas jusqu'à obtention d'une suspension monocellulaire.Répartir uniformément les cellules dans la pipette et effectuer cette étape rapidement afin d'éviter leur réattachement à la plaque. Si désiré, utiliser un microscope optique pour observer la taille des agrégats cellulaires. Ensuite, ensemencer les cellules sur des plaques de 12 puits revêtues de matrice extracellulaire (ECM).Inclinez la plaque d'avant en arrière pour répartir uniformément les cellules dans les puits et placez-la dans une étuve à cellules à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 jusqu'au prochain changement de milieu. Dans cette procédure, recouvrez une plaque à six puits de matrice extracellulaire (ECM) avec facteurs de croissance réduits conformément aux recommandations du fabricant. Laissez-la prendre pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius.Ensuite, aliquoter la quantité de DPBS nécessaire et un millilitre de RDM par puits d'enrichissement, puis les réchauffer à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Porter l'enzyme de type trypsine à température ambiante et réchauffer la quantité requise de milieu de support RPE à 37 degrés Celsius. Ajouter ensuite un réactif antimicrobien et un inhibiteur de ROCK au RSM afin d'obtenir une concentration finale de 0,5x antimicrobien et 10 micromolaire d'inhibiteur de ROCK.Utilisez ce milieu pendant les quatre à sept premiers jours pour améliorer l'attachement. Ensuite, aspirez le milieu usagé de tous les puits et ajoutez un millilitre par puits de RDM préchauffé sans facteurs de croissance. Si nécessaire, disséquez et grattez toutes les cellules non-RPE à l’aide d’une pointe de pipette P10 sous un microscope stéréo.Après la dissection, aspirez le milieu de culture RDM et tous les débris cellulaires, puis lavez deux fois avec un millilitre de DPBS préchauffé par puits. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de TDE par puits d'une plaque de 12 puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Par la suite, utilisez un grattoir à cellules pour détacher délicatement les cellules de la plaque.Triturez délicatement la suspension cellulaire enzymatique en aspirant et en rejetant la solution trois à quatre fois à l’aide d’une pipette afin d’obtenir une suspension homogène. Ensuite, diluez la suspension cellulaire enzymatique au ratio de un à dix dans le milieu RSM préchauffé, sans inhibiteur de ROCK. Centrifugez la suspension cellulaire à 173g pendant cinq minutes à température ambiante.Après cinq minutes, aspirez le milieu à partir du culot cellulaire et resuspendez les cellules dans du milieu RSM contenant un inhibiteur de la ROCK à 10 micromolaire. Ensuite, filtrez les cellules à l’aide d’un tamis cellulaire en nylon de 40 micromètres de porosité. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et calculez la concentration des cellules dans la solution filtrée.Par la suite, ensemencez les cellules sur des plaques revêtues de matrice extracellulaire et à teneur réduite en facteurs de croissance, à raison de 1 × 10⁵ cellules par centimètre carré, dans 4 millilitres de milieu RSM contenant 10 micromolaire d'inhibiteur de ROCK. Remplacez le milieu RSM contenant 10 micromolaire d'inhibiteur de ROCK 48 heures après l'ensemencement des cellules, puis continuez à renouveler le milieu tous les trois à quatre jours. Cessez d'ajouter l'inhibiteur de ROCK au milieu RSM après quatre à sept jours.Laisser les cellules mûrir pendant 28 à 35 jours à 37 degrés Celsius et 5 % CO₂, et continuer à renouveler le milieu RSM tous les trois à quatre jours. On observe ici les cellules souches pluripotentes induites juste avant leur passage en vue de la différenciation. Les cellules souches sont petites et fortement compactées au sein des colonies, qui ne semblent pas contenir de cellules différenciées telles que des fibroblastes entre les colonies ou des zones opaques à l'intérieur des colonies.Voici les cellules RPE immatures au jour deux. À ce stade, les cellules doivent encore être subconfluentes et étendre des prolongements dans les espaces vides entre les cellules. Ces cellules sont prélevées avant l'enrichissement au jour 14.Les cellules non-RPE apparaissent sous forme de plaques ou de rubans opaques. La plaque ronde contient des cellules ayant une morphologie fibroblastique, tandis que les plaques opaques sont considérées comme étant de la rétine neuronale. Ces images montrent des cellules RPE aux passages zéro, un et trois au jour 30.À chaque passage, les cellules doivent être confluentes et présenter les caractéristiques morphologiques typiques de l'épithélium pigmentaire rétinien, notamment des contours en relief en contraste de phase et une forme polygonale. Une fois maîtrisées, les techniques de passage et d'enrichissement peuvent être réalisées en une à deux heures, selon l'ampleur de la culture cellulaire. Après cette procédure, des techniques telles que la quantification des gènes ou des protéines et des tests fonctionnels peuvent être utilisées afin de répondre à des questions concernant la capacité des cellules RPE à sécréter des facteurs de croissance ou à phagocyter les segments externes.Des articles publiés par Dave Buchholz en 2013 et par Lindsay Leach en 2015 décrivent le développement et l'optimisation de cette méthode. Nous avons fourni une démonstration détaillée et complète de chaque étape du protocole afin de la rendre facilement accessible aux chercheurs du domaine. Bonnes expériences.

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