Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

L'objectif général de cette méthode est de diriger efficacement la différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules épithéliales pigmentaires de la rétine sous forme d'une couche homogène. Cette méthode permet de répondre à des questions dans le domaine de la recherche rétinienne et oculaire, telles que le développement de la rétine et la mise en place d'un modèle de maladie à base de cellules souches. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est plus rapide et plus efficace que les méthodes spontanées.

Cette méthode utilise une combinaison de facteurs de croissance et de petites molécules pour orienter la différenciation des cellules souches en cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (RPE) immatures en 14 jours, puis en RPE fonctionnelles matures après trois mois. Cassidy Arnold, directrice adjointe du laboratoire de biologie et d'ingénierie des cellules souches de l'UC Santa Barbara, démontrera certaines étapes de la procédure. Pour commencer cette procédure, cultiver les colonies de cellules souches en conditions sans cellules nourricières et sans sérum jusqu'à une confluence d'environ 80 % avant le passage.

Ensuite, recouvrir une plaque de 12 puits d'un hydrogel à base de matrice extracellulaire selon les recommandations du fabricant et laisser durcir pendant une heure à température ambiante ou toute une nuit à quatre degrés Celsius. Puis, prélever le volume de milieu de différenciation rétinienne et de PBS sans calcium ni magnésium nécessaire pour le jour zéro, et les réchauffer au bain-marie à 37 degrés Celsius. Ajouter ensuite les facteurs de croissance au milieu de différenciation rétinienne (RDM) réchauffé et porter l'EDTA à température ambiante.

Si nécessaire, retirez toutes les colonies différenciées à l’aide d’une pipette P10 en vous basant sur la morphologie des cellules souches qui seront passagées pour la différenciation. Les cellules de type fibroblaste situées entre les colonies ainsi que les cellules opaques à l’intérieur des colonies indiquent les cellules différenciées à éliminer. Le retrait manuel des cellules constitue l’une des étapes les plus critiques du protocole, car le départ d’une population entièrement indifférenciée de cellules souches permettra un enrichissement plus efficace.

Ensuite, passer les cellules d'un puits unique d'une plaque à six puits vers quatre puits d'une plaque à 12 puits en aspirant le milieu des cellules souches et en lavant les puits une fois avec deux millilitres de PBS préchauffé. Ensuite, aspirer le PBS et rincer chaque puits trois fois avec un millilitre d'EDTA par puits. Puis incliner doucement la plaque et aspirer l'EDTA.

Ne pas agiter la plaque de quelque manière que ce soit afin d'éviter un détachement prématuré des cellules. Après le troisième lavage, ajouter à nouveau un millilitre d'EDTA et incuber la plaque à température ambiante dans la hotte pendant trois à cinq minutes. Ne pas perturber la plaque pendant cette incubation.

Ensuite, aspirez l'EDTA et ajoutez un millilitre de RDM par puits à semer, plus 0,5 millilitre de milieu supplémentaire. Par exemple, lavez un puits d'une plaque à six puits avec 4,5 millilitres de RDM pour ensemencer quatre puits d'une plaque à 12 puits. Puis, utilisez un grattoir à cellules pour détacher délicatement les cellules.

Triturez les cellules dans le RDM en aspirant et en expulsant cinq fois dans le puits et effectuez cette étape rapidement pour éviter la ré-attachement à la plaque. Placez dans un tube conique. Dissociez les gros agrégats cellulaires, mais ne triturez pas jusqu'à obtention d'une suspension monocellulaire.

Répartir uniformément les cellules dans la pipette et effectuer cette étape rapidement afin d'éviter leur réattachement à la plaque. Si désiré, utiliser un microscope optique pour observer la taille des agrégats cellulaires. Ensuite, ensemencer les cellules sur des plaques de 12 puits revêtues de matrice extracellulaire (ECM).

Inclinez la plaque d'avant en arrière pour répartir uniformément les cellules dans les puits et placez-la dans une étuve à cellules à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 jusqu'au prochain changement de milieu. Dans cette procédure, recouvrez une plaque à six puits de matrice extracellulaire (ECM) avec facteurs de croissance réduits conformément aux recommandations du fabricant. Laissez-la prendre pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Ensuite, aliquoter la quantité de DPBS nécessaire et un millilitre de RDM par puits d'enrichissement, puis les réchauffer à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Porter l'enzyme de type trypsine à température ambiante et réchauffer la quantité requise de milieu de support RPE à 37 degrés Celsius. Ajouter ensuite un réactif antimicrobien et un inhibiteur de ROCK au RSM afin d'obtenir une concentration finale de 0,5x antimicrobien et 10 micromolaire d'inhibiteur de ROCK.

Utilisez ce milieu pendant les quatre à sept premiers jours pour améliorer l'attachement. Ensuite, aspirez le milieu usagé de tous les puits et ajoutez un millilitre par puits de RDM préchauffé sans facteurs de croissance. Si nécessaire, disséquez et grattez toutes les cellules non-RPE à l’aide d’une pointe de pipette P10 sous un microscope stéréo.

Après la dissection, aspirez le milieu de culture RDM et tous les débris cellulaires, puis lavez deux fois avec un millilitre de DPBS préchauffé par puits. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de TDE par puits d'une plaque de 12 puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Par la suite, utilisez un grattoir à cellules pour détacher délicatement les cellules de la plaque.

Triturez délicatement la suspension cellulaire enzymatique en aspirant et en rejetant la solution trois à quatre fois à l’aide d’une pipette afin d’obtenir une suspension homogène. Ensuite, diluez la suspension cellulaire enzymatique au ratio de un à dix dans le milieu RSM préchauffé, sans inhibiteur de ROCK. Centrifugez la suspension cellulaire à 173g pendant cinq minutes à température ambiante.

Après cinq minutes, aspirez le milieu à partir du culot cellulaire et resuspendez les cellules dans du milieu RSM contenant un inhibiteur de la ROCK à 10 micromolaire. Ensuite, filtrez les cellules à l’aide d’un tamis cellulaire en nylon de 40 micromètres de porosité. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et calculez la concentration des cellules dans la solution filtrée.

Par la suite, ensemencez les cellules sur des plaques revêtues de matrice extracellulaire et à teneur réduite en facteurs de croissance, à raison de 1 × 10⁵ cellules par centimètre carré, dans 4 millilitres de milieu RSM contenant 10 micromolaire d'inhibiteur de ROCK. Remplacez le milieu RSM contenant 10 micromolaire d'inhibiteur de ROCK 48 heures après l'ensemencement des cellules, puis continuez à renouveler le milieu tous les trois à quatre jours. Cessez d'ajouter l'inhibiteur de ROCK au milieu RSM après quatre à sept jours.

Laisser les cellules mûrir pendant 28 à 35 jours à 37 degrés Celsius et 5 % CO₂, et continuer à renouveler le milieu RSM tous les trois à quatre jours. On observe ici les cellules souches pluripotentes induites juste avant leur passage en vue de la différenciation. Les cellules souches sont petites et fortement compactées au sein des colonies, qui ne semblent pas contenir de cellules différenciées telles que des fibroblastes entre les colonies ou des zones opaques à l'intérieur des colonies.

Voici les cellules RPE immatures au jour deux. À ce stade, les cellules doivent encore être subconfluentes et étendre des prolongements dans les espaces vides entre les cellules. Ces cellules sont prélevées avant l'enrichissement au jour 14.

Les cellules non-RPE apparaissent sous forme de plaques ou de rubans opaques. La plaque ronde contient des cellules ayant une morphologie fibroblastique, tandis que les plaques opaques sont considérées comme étant de la rétine neuronale. Ces images montrent des cellules RPE aux passages zéro, un et trois au jour 30.

À chaque passage, les cellules doivent être confluentes et présenter les caractéristiques morphologiques typiques de l'épithélium pigmentaire rétinien, notamment des contours en relief en contraste de phase et une forme polygonale. Une fois maîtrisées, les techniques de passage et d'enrichissement peuvent être réalisées en une à deux heures, selon l'ampleur de la culture cellulaire. Après cette procédure, des techniques telles que la quantification des gènes ou des protéines et des tests fonctionnels peuvent être utilisées afin de répondre à des questions concernant la capacité des cellules RPE à sécréter des facteurs de croissance ou à phagocyter les segments externes.

Des articles publiés par Dave Buchholz en 2013 et par Lindsay Leach en 2015 décrivent le développement et l'optimisation de cette méthode. Nous avons fourni une démonstration détaillée et complète de chaque étape du protocole afin de la rendre facilement accessible aux chercheurs du domaine. Bonnes expériences.