Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

L’objectif global de cette méthode est de diriger efficacement la différenciation des cellules souches pluripotentes en cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes en une couche homogène. Cette méthode permet de répondre à des questions dans le domaine de la recherche sur la rétine et l’œil, telles que le développement de la rétine et l’établissement d’un modèle de maladie des cellules souches. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est plus rapide et plus efficace que les méthodes spontanées.

Cette méthode utilise une combinaison de facteurs de croissance et de petites molécules pour diriger la différenciation des cellules souches afin qu’elles deviennent des EPR immatures en 14 jours et des EPR fonctionnelles matures après trois mois. Cassidy Arnold, directrice associée du laboratoire de biologie et d’ingénierie des cellules souches de l’UC Santa Barbara, fera la démonstration de certaines parties de la procédure. Pour commencer cette procédure, cultivez des colonies de cellules souches dans des conditions sans mangeoire et sans sérum jusqu’à environ 80 % de confluence avant le passage.

Ensuite, enduisez une plaque à 12 puits d’hydrogel à base de matrice extracellulaire selon les recommandations du fabricant et laissez-la reposer pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, aliquote le volume de milieu de différenciation rétinienne et de PBS sans calcium ni magnésium nécessaires pour le jour zéro et réchauffez-les dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez les facteurs de croissance au RDM réchauffé et amenez l’EDTA à température ambiante.

Si nécessaire, prélever toutes les colonies différenciées à l’aide d’une pointe de pipette P10 basée sur la morphologie des cellules souches qui seront passées pour la différenciation. Les cellules fibroblastiques entre les colonies ainsi que les cellules opaques à l’intérieur des colonies indiquent les cellules différenciées à éliminer. L’élimination manuelle des cellules est l’une des étapes les plus critiques du protocole, car commencer avec une population de cellules souches complètement indifférenciée permettra un enrichissement plus efficace.

Ensuite, passez un seul puits d’une plaque à six puits dans quatre puits d’une plaque à 12 puits en aspirant le milieu des cellules souches et en lavant les puits une fois avec deux millilitres de PBS préchauffé. Ensuite, aspirez le PBS et rincez chaque puits trois fois avec un millilitre d’EDTA par puits. Ensuite, inclinez doucement la plaque et aspirez l’EDTA.

Ne pas agiter la plaque de quelque manière que ce soit pour éviter de soulever prématurément les cellules. Après le troisième lavage, ajoutez à nouveau un millilitre d’EDTA et incubez la plaque à température ambiante dans la hotte pendant trois à cinq minutes. Ne dérangez pas la plaque pendant cette incubation.

Ensuite, aspirez l’EDTA et ajoutez un millilitre de RDM par puits qui sera en place plus 0,5 millilitre de milieu supplémentaire. Par exemple, laver un puits d’une plaque de six puits avec 4,5 millilitres de RDM pour déposer une plaque sur quatre puits d’une plaque de 12 puits. Ensuite, utilisez un grattoir cellulaire pour détacher doucement les cellules.

Triturez les cellules dans RDM en pipetant cinq fois de haut en bas dans le puits et terminez cette étape rapidement pour éviter de les rattacher à la plaque. Placer dans un tube conique. Dissocier de grands amas de cellules mais ne pas triturer en suspension unicellulaire.

Répartissez les cellules uniformément dans la pipette et terminez cette étape rapidement pour éviter de les rattacher à la plaque. Si vous le souhaitez, utilisez un microscope optique pour observer la taille des amas de cellules. Par la suite, ensemencez les cellules sur des plaques à 12 puits revêtues d’ECM.

Inclinez la plaque d’avant en arrière pour répartir uniformément les cellules dans les puits et placez-la dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 jusqu’au prochain changement de milieu. Dans cette procédure, enduire une plaque à six puits d’une ECM à facteur de croissance réduit selon les recommandations du fabricant. Laissez-le prendre pendant une heure à température ambiante pendant une nuit à quatre degrés Celsius.

Ensuite, aliquotez la quantité de DPBS nécessaire et un millilitre de RDM par puits d’enrichissement et réchauffez-les à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Amenez l’enzyme de type trypsine à température ambiante et réchauffez la quantité requise de milieu de support RPE à 37 degrés Celsius. Après cela, ajoutez un réactif antimicrobien et un inhibiteur de ROCK au RSM pour obtenir une concentration finale de 0,5 fois l’antimicrobien et de 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK.

Utilisez ce milieu pendant les quatre à sept premiers jours pour améliorer l’attachement. Ensuite, aspirez le milieu épuisé de tous les puits et ajoutez un millilitre par puits de RDM préchauffé sans facteurs de croissance. Si nécessaire, disséquez et grattez toutes les cellules non-EPR à l’aide d’une pointe de pipette P10 sous un microscope à dissection.

Après la dissection, aspirez le RDM et tous les débris cellulaires et lavez-les deux fois avec un millilitre de DPBS préchauffé par puits. Par la suite, ajoutez 0,5 millilitre de TDE par puits d’une plaque de 12 puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez un grattoir cellulaire pour retirer délicatement les cellules de la plaque.

Triturez doucement la suspension d’enzymes cellulaires en pipetant de haut en bas trois à quatre fois pour créer une suspension uniforme. Ensuite, diluez la suspension d’enzymes cellulaires dans un rapport de un à 10 dans le RSM préchauffé sans inhibiteur de ROCK. Centrifugez la suspension cellulaire à 173 g pendant cinq minutes à température ambiante.

Après cinq minutes, aspirez le milieu de la pastille cellulaire et remettez les cellules en suspension dans le RSM avec un inhibiteur de ROCK à 10 micromolaires. Ensuite, filtrez les cellules à l’aide d’une passoire à cellules en maille de nylon avec des pores de 40 micromètres. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et calculez la concentration de cellules dans la solution filtrée.

Ensuite, ensemencez les cellules sur les plaques recouvertes d’ECM à facteur de croissance réduit à une fois 10 à cinq cellules par centimètre carré dans quatre millilitres de RSM avec un inhibiteur de ROCK à 10 micromolaires. Remplacer le RSM par un inhibiteur de ROCK à 10 micromolaires 48 heures après l’ensemencement cellulaire et continuer à remplacer le milieu tous les trois à quatre jours. Arrêtez d’ajouter l’inhibiteur de ROCK au RSM après quatre à sept jours.

Laissez les cellules mûrir pendant 28 à 35 jours à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 et continuez à remplacer le RSM tous les trois à quatre jours. On voit ici les cellules souches pluripotentes induites immédiatement avant de passer pour la différenciation. Les cellules souches sont petites et densément emballées à l’intérieur des colonies qui ne semblent pas contenir de cellules différenciées telles que des fibroblastes entre les colonies ou des passages opaques à l’intérieur des colonies.

Voici les cellules RPE immatures au deuxième jour. À ce stade, les cellules doivent encore être sous-confluentes et étendre les projections dans les espaces vides entre les cellules. Ces cellules sont avant la cueillette pour éliminer l’enrichissement le 14e jour.

Les cellules non RPE apparaissent sous forme de taches ou de rubans opaques. La tache ronde contient des cellules à la morphologie fibroblastique alors que les plaques opaques sont considérées comme de la rétine neurale. Ces images montrent l’EPR au passage zéro, un et trois le jour 30.

À chaque passage, les cellules doivent être confluentes et présenter les caractéristiques de la morphologie épithéliale pigmentée de la rétine, notamment des bordures phasebright et une forme polygonale. Une fois maîtrisées, les techniques de passage et d’enrichissement peuvent être réalisées en une à deux heures selon l’échelle de la culture cellulaire. À la suite de cette procédure, des techniques telles que la quantification de gènes ou de protéines et les tests fonctionnels peuvent être utilisées afin de répondre à des questions sur la capacité de l’EPR à sécréter des facteurs de croissance ou à phagocyter les segments externes.

Des articles publiés par Dave Buchholz en 2013 et Lindsay Leach en 2015 détaillent le développement et l’optimisation de cette méthode. Nous avons fourni une démonstration détaillée et approfondie de chaque étape de la procédure afin de la rendre facilement accessible aux chercheurs sur le terrain. Bonne expérimentation.