Name: Microinjection de protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière, Ictalurus punctatus, pour Gene Editing (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 8 s
Description: Apprenez la microinjection de CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière Ictalurus punctatus pour l'édition génique. Cette méthode validée cible les gènes immunitaires TICAM1 et RBL.

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Cette recherche a été financée par prix USDA-NIFA 2015-67015-23488 à Roger Cone. Les auteurs remercient Dr Ronald Phelps pour la description des critères de sélection des stocks géniteurs dans la vidéo. Ahmed Elaswad et Karim Khalil tiens à remercier la culture égyptienne et Educational Bureau à Washington DC pour financer leur recherche de doctorat.

Cette expérience a été menée au poisson Genetics Research Unit, E. W. Shell Fisheries Research Center, Université d’Auburn, Alabama. Tous les protocoles expérimentaux utilisés dans cette expérience ont été approuvées par l’Auburn University Institutional Animal Care et le Comité de l’urbanisme (UA-IACUC) avant le début de l’expérience. Une liste du matériel et des fournitures utilisées dans cette expérience se trouvent dans la Table des matières. Voici les étapes et les procédures de préparation et de la microinjection d’embryons unicellulaire barbue tel qu’illustré à la Figure 1.
1. sélection de titres et de frai de géniteurs
<ol><li>Choisissez saine barbue de géniteurs de la souche ou lignée génétique d’intérêt. Femelles et mâles de barbue devraient montrer bon les caractères sexuels secondaires.</li>
	<li>Sélectionner les mâles qui ont une tête large et musclée qui est plus large que le reste de leur corps avec la papille génitale bien développé. Couleur sombre, de cicatrices et de blessures de ces combats territoriaux sont aussi des signes de préparation sexuelle. Sélectionner les femelles qui ont des têtes qui sont moins larges que le reste de leur corps et ont un abdomen mou, palpable, bien équilibré. Pour une précision et d’éviter soulignant le poisson lors de la première manipulation, cesser de nourrir les femelles 2 ou 3 jours avant d’examiner leur état de préparation pour le frai.</li>
	<li>Effectuer des poissons manutention rapidement, mais avec précaution. Pour réduire le stress de la manipulation, effectuez toutes les procédures nécessitant une manipulation femelles tout en maintenant le poisson fraie sacs (maillage de taille 32 mm).</li>
	<li>Juste avant l’injection d’hormones pour induire l’ovulation, mesurer le poids des femelles.</li>
	<li>Accrocher les sacs de reproduction avec des femelles à l’intérieur d’un flux par le biais de réservoir avec écoulement continu de l’eau et l’aération adéquate.</li>
	<li>Conditions d’asepsie, charger l’implanteur qui a une aiguille de 14 G avec 85 µg/kg de l’hormone lutéinisante implant (LHRHa) analogue de l’hormone. Rincez le site d’injection (musculature dorsale) 0,9 % solution saline stérile avant l’injection. Insérez l’implanteur à un angle de 45° et libérer l’implant. Retirer l’aiguille et le coup du site d’injection avec un tampon d’ouate gonflée dans l’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Place le sac de frai dans le réservoir afin que le poisson soit totalement immergé dans l’eau 15 à 20 cm sous la surface de l’eau. Une aération adéquate (au-dessus de 5 ppm dissous d’oxygène) et bonne qualité d’eau sont importantes pour l’ovulation des oeufs de haute qualité.</li>
	<li>Prédire le moment de l’ovulation basé sur la température de l’eau à l’aide de la relation de degré-heure (h)35. Temps de réponse de degré-h = temps entre l’injection d’hormones et de l’ovulation (h) * température (° C) de l’eau. Par exemple, pour un temps de réponse de degré-h de 900 à 1 000, une femme est censée frayer à 36-40 h de temps d’injection de l’hormone à 25 ° C. Habituellement, la première vérification des oeufs se faite à environ 36 h après l’injection d’hormones, puis à intervalle de 4 h.</li>
	<li>Pour vérifier l’ovulation, soulevez doucement le sac frai au-dessus de la surface de l’eau pendant que vous cherchez les oeufs qui sont fixées à l’intérieur du sac de frai. Voir au moins 10 oeufs indique cette femelle est ovulation et prêt pour le décapage de la main.</li>
</ol>2. préparation de sperme
NOTE : Sperme peut être préparé quelques h avant l’heure prévue de l’ovulation.
<ol><li>Euthanasier les hommes par un percussion coup sur la tête sans anesthésie, car l’anesthésie peut avoir un effet négatif sur la motilité des spermatozoïdes.</li>
	<li>Recueillir les testicules dans une petite casserole de pesage, supprimer n’importe quel tissu et lavez-les avec 50 mL de sérum physiologique 0,9 % pour enlever le sang, si nécessaire. Testicules bien développées sont blanches avec nombreuses projections villiformes ( Figure 2).</li>
	<li>Déterminer le poids des testicules.</li>
	<li>Pour préparer la solution de sperme pour la fécondation de l’ovule, transférer les testicules vers le centre de la maille 100 cm2 100 µm avec une pincette. Plier le maillage avec les testicules à l’intérieur, écraser les testicules et le sperme de filtre dans un tube de prélèvement de 50 mL. Cela peut être fait en appliquant une pression de testicules à l’intérieur de la maille contre le bord de la douille de la collection via le pouce. Solution saline à 0,9 % permet de laver le sperme de la maille dans le tube de prélèvement. Une solution saline peut ajouter jusqu'à 10 mL/g de testicules.</li>
	<li>Déterminer la concentration des spermatozoïdes, vérifier la motilité et la viabilité. Remarque : La Concentration peut être déterminée en comptant les spermatozoïdes dans un volume connu de dilué de laitance utilisant un hémocytomètre. Alternativement, on peut estimer la densité du sperme en évaluant la densité optique de laitance à l’aide d’un spectrophotomètre. Dans cette méthode, l’absorption à la longueur d’onde de 505 nm est comparée à une Charte de contrôle qui a été préalablement préparée pour l’absorption des différentes concentrations de sperme36. La motilité des spermatozoïdes peut être vérifiée au microscope comme le moment de l’activation des spermatozoïdes jusqu'à cessation de sperme mouvement (appelé durée de motilité)37. La viabilité des spermatozoïdes peut être déterminée par le sperme avec des colorants sélectifs tels que le bleu de trypan qui tache de spermatozoïdes seulement non viables, tandis que les spermatozoïdes viables restera sans tache de coloration. Cependant, à ces opérations de microinjection, ce n’est pas nécessaire si les testicules sont bien développés.</li>
	<li>Stocker le sperme dans une solution saline 0,9 % de l’étape de 2,5 à 4 ° C et utiliser dans les 24h après préparation.</li>
</ol>3. collecte et fécondation des oeufs
<ol><li>Appliquez une très fine couche de matière grasse pour une propre et sèche pan de frai de 20 cm de diamètre.</li>
	<li>Placer la femelle dans la solution anesthésique contenant 100 ppm de méthane-sulfonate de tricaïne tamponnée avec du bicarbonate de sodium (pH de la solution finale doit être 7.0) jusqu'à ce que le poisson soit complètement anesthésiés38. ATTENTION : Méthane-sulfonate de tricaïne peut être irritant, s’il est inhalé, ingéré ou absorbé par la peau.</li>
	<li>Avec précaution, retirez le poisson du sac frai et tremper dans une solution saline de 0,9 % à laver la solution anesthésique. Sécher le poisson complètement à l’aide d’une serviette propre, en évitant la suppression de la couche de mucus sur la surface de corps de poisson.</li>
	<li>Appliquer shortening végétal sur la zone autour de l’évent, y compris les nageoires pelviennes, pour éviter la saisie des œufs pendant le stripping de la main.</li>
	<li>Main la bande les oeufs dans la poêle graissée fraie en appliquant une légère pression aux ovaires. Bons oeufs devraient circuler librement, être de couleur jaune doré et très peu ou aucun amas ou des caillots de sang (Figure 2). Éviter tout contact entre les oeufs et l’eau avant la fécondation, car l’eau peut stimuler la fermeture du micropyle.</li>
	<li>Pour fertiliser les oeufs à la microinjection, transférer 200 à 300 œufs dans un plat graissé de frai. Plante en plastique graissé étiquettes peut être utilisées comme une cuillère pour transférer les oeufs dans la poêle graissée fraie. Ajouter 1 à 2 mL de la solution de sperme (de l’étape 2.5) aux œufs et mélanger doucement. Le ratio des spermatozoïdes à le œuf doit être environ 11 000 spermes/ovules.</li>
	<li>Ajouter eau douce aux œufs pour activer le sperme et les ovules. Ajouter assez d’eau pour couvrir légèrement les œufs. Doucement agiter les oeufs pour 30 s. fécondation survient dans 1 à 2 min. Il est important de fertiliser les oeufs qui sont disposées en une seule couche. Oeufs de silure adhèrent les uns aux autres, compliquant la microinject des couches multiples d’embryons.</li>
	<li>Ajouter plus d’eau douce pour les oeufs fécondés et laisser les oeufs à durcir pendant 10 à 15 min.</li>
	<li>Couvrez la casserole fraie contenant les oeufs non fécondés restants par une serviette humide pour éviter le dessèchement et fertiliser pendant quelques heures. La fécondation peut se faire de manière échelonnée, par exemple, un lot de 200 à 300 oeufs peuvent être fécondés toutes les 30 à 60 minutes afin d’assurer un approvisionnement continu des embryons au stade une cellule pour la microinjection et embryons témoins non injectées. Éviter tout contact entre la serviette humide et les oeufs car les œufs peuvent adhérer à la serviette humide rendant difficile de les enlever. Dans ce protocole, oeufs fécondés dans les 2 – 3 h après le décapage ont été efficacement micro et avait un succès similaire comme œufs fécondés immédiatement après le décapage.</li>
</ol>4. l’aiguille en tirant et chargement
<ol><li>Extraire un verre de borosilicate de 1,0 mm OD capillaire dans 2 aiguilles (Figure 3). Rangez les aiguilles dans une boîte de papier avec un morceau d’éponge dans laquelle plusieurs incisions ont été faites. Pour éviter de casser l’aiguille, le diamètre de l’éponge doit être inférieur à la longueur de la tige de l’aiguille.</li>
	<li>Ouvrir l’extrémité de l’aiguille en brisant un petit morceau de région plus mince de l’aiguille à l’aide d’un objet pointu. Vous pouvez également ouvrir l’aiguille en pinçant au large de la région plus mince de la pointe avec une pince au microscope.</li>
	<li>Préparer la solution d’injection en mélangeant gRNA(s) protéine Cas9. Autres types d’ARN ou protéine peuvent aussi être injectés avec la même procédure. Dans ce protocole, gRNAs ont été conçus pour cibler deux des gènes apparentés immunitaire barbue, gène de molécule (TICAM1) adaptateur contenant du domaine du récepteur toll/interleukine 1 et gène de rhamnose binding lectine (RBL) et préparées selon Shah et al.. avec l’utilisation d’une haute fidélité Taq polymérase32,,39. Les cibles génomiques de gRNAs étaient GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' pour TICAM 1 gène (Figure 4) 5' et 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' de l’exon 1 du gène RBL avec motif adjacent de protospacer (PAM) séquence soulignée (Figure 6).<ol>
<li>BLAST guide RNA cibles contre le génome de barbue de séquence et choisissent ceux avec aucun hors-cible des sites potentiels.</li>
		<li>Ajouter rouge de phénol à la couleur de la protéine gRNA/Cas9 mélanger à un tiers du volume total.</li>
		<li>Ajuster la concentration finale de protéine gRNA/Cas9 mélange avec de l’eau libre nucléase afin que chaque embryon est injecté avec le 50 nL contenant environ 2,5 ng gRNA et 7,5 ng Cas9 protéine. Incuber le mélange pendant 10 min sur la glace avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avec un microloader, charger 5 à 10 µL du mélange gRNA/Cas9 dans l’aiguille d’injection en insérant le microloader dans la tige de l’aiguille et expulser le mélange lentement tout en rétractant la pointe de microloader (Figure 3). Ne pas emprisonner de bulles d’air à l’intérieur.</li>
	<li>Fixer l’aiguille à l’exploitant une micropipette et assurer un lien étroit, puis visser le support sur le micromanipulateur. Garantir la libre circulation stable. Appliquer une pression de microinjection en ouvrant la bouteille d’azote et en ajustant le régulateur de pression. Remarque : Le volume d’injection peut être affecté par la pression, le diamètre de l’ouverture de l’aiguille et la durée de l’injection. Pour déterminer le volume à injecter, à injecter dans une goutte d’huile minérale sur un hémocytomètre. Si nécessaire, la pression, la durée de l’injection et le diamètre de l’aiguille peut être ajusté pour augmenter ou diminuer le volume de l’injection. Injecter plusieurs fois dans l’huile minérale pour volume cohérent.</li>
</ol>5. la microinjection d’embryons de poisson-chat
<ol><li>Appliquez une très fine couche de matière grasse pour un plat de Pétri propre de 100 mm.</li>
	<li>À l’aide d’une étiquette de plante en plastique graissé, transfert de 50 à 100 oeufs du bac de la fécondation à la boîte de Pétri et recouvrez-les avec la solution de Holtfreter (Table des matières). Aligner les oeufs uns contre les autres en une seule couche. Cet alignement doit maintenir les oeufs en place au cours du processus de microinjection.</li>
	<li>Placez la boîte de Pétri avec les oeufs sur la scène du microscope et maintenez-le avec une seule main. Piquez l’aiguille avec l’autre main (Figure 3) jusqu'à ce qu’il perce le chorion et le jaune dans un seul mouvement fluide. La pointe de l’aiguille doit être aussi proche que possible de la blastodisc avant de livrer le matériel d’injection.<ol>
<li>Appuyer sur la pédale pour livrer le matériel d’injection dans le jaune. Si le blastodisc n’est pas clairement visible, le matériel d’injection peut se propager dans des lieux différents dans le jaune d’oeuf. Pour ce faire, l’aiguille est insérée à l’extrémité du jaune, puis appuyer sur la pédale et en retirant l’aiguille se font simultanément pour diffuser le matériel d’injection à travers différents domaines du jaune. Jusqu'à 50 microseringues peuvent être injectés dans le jaune de barbue d’embryons, cependant, la quantité de protéines gRNA/Cas9 doit être optimisée pour chaque gène obtenir les meilleurs résultats pour mutation embryon et taux de survie32.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirer l’aiguille en douceur pour éviter d’endommager le œuf. Déplacer la boîte de Pétri pour injecter un autre oeuf avec la même procédure. Éviter tout mouvement de la boîte de Pétri au cours du processus d’injection, car cela pourrait endommager le œuf ou de casser l’aiguille. Retirer les œufs s’est rompues ou endommagés en raison de la microinjection. Injection peut être démarré à 15 – 20 min après la fécondation et continuer aussi longtemps que les embryons sont encore en phase d’une cellule (jusqu'à environ 60 à 90 min après la fécondation).</li>
	<li>Placez les embryons injectées en solution de Holtfreter contenant 10 ppm de doxycycline et continue aération douce pour 6 à 7 jours avant l’éclosion de40. Changez la solution tous les jours et retirer les embryons morts.</li>
</ol>6. détection de mutations
<ol><li>Au hasard, recueillir plusieurs embryons injectées à 72 h après la fécondation, enlevez le jaune et extraire l’ADN génomique. Inclure non injectés de 3 – 5 embryons sous forme de contrôle. Remarque : L’ADN génomique peut être extraites des embryons après enlèvement des coquilles d’oeufs et de matériel de jaune de œuf à l’aide de la digestion de la protéinase K et éthanol précipitation32.</li>
	<li>Amplifier un segment d’ADN flanquant les cibles génomiques pour gRNA de chaque gène, où les mutations sont censées se produire, en utilisant une haute fidélité Taq polymérase32. Pour TICAM 1, les amorces 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (avec impatience) et 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (marche arrière) ont été utilisées pour amplifier un 750 bp alors que pour la RBL, les amorces 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (avec impatience) et 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (marche arrière) ont été utilisées pour amplifier un segment bp 375 du gène de la RBL.<ol>
<li>Utiliser la réaction PCR : jusqu'à 20 µL PCR l’eau de qualité ; 1 x haute fidélité tampon de réaction enzyme Taq avec MgCl2, dNTP 0,2 mM mix, 0,4 µM pour chacun de l’apprêt avant et arrière de la même série, 100-300 ng ADN génomique et 1,25 unité de mélange d’enzyme Taq haute fidélité. Effectuer des conditions cyclisme d’amplification : dénaturation initiale à 94 ° C pendant 3 min ; 35 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 30 s, recuit à 60 ° C pendant 55 s pour TICAM et 40 s pour RBL, extension à 72 ° C pendant 1 min/kb ; et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Détecter les embryons mutants à l’aide d’une méthode de détection de mutation comme le séquençage des amplicons purifiées, test de détection de mutation arpenteur, analyse de mobilité hétéroduplex, perte du site de reconnaissance des enzymes de restriction, ou toute autre méthode de détection de mutation qui est approprié pour la cible. Dans ce protocole, détecter les embryons mutants à l’aide de test de détection de mutation arpenteur pour TICAM 1 et perte d’enzyme de restriction que SAPI couper site mais aussi de séquençage des produits PCR purifiés pour le gène de la RBL.</li>
	<li>Afin d’identifier les allèles mutants, cloner des produits PCR et vecteurs de la séquence des colonies individuelles. Les allèles mutants présentés dans la Figure 4 et Figure 6 provenaient d’embryons injectées. Produits PCR de six micro et embryons de 3 témoins pour chaque gène ont été regroupées dans deux tubes séparés, un pour les embryons microinjectés et l’autre pour les embryons de témoins, rapidement clonés et 86 vecteurs pour TICAM 1 et 48 vecteurs de gènes RBL séquencé, dont 8 le séquençage de réactions de 3 embryons de témoins non injectés pour chaque gène.</li>
	<li>Pour identifier les différents allèles mutants, comparer les séquences d’embryons mutants à la séquence de type sauvage à l’aide de n’importe quel outil d’alignement de séquence ADN comme BLAST ou T-café.</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Un protocole détaillé pour microinjection d’embryons de barbue d’atteindre knock-out du gène a été présenté. Injection de la protéine CRISPR/Cas9 dans le jaune d’oeuf est beaucoup plus simple, fait gagner du temps et ne nécessite pas de formation approfondie par rapport à microinjecting le blastodisc de l’embryon unicellulaire, qui est la technique courante pour la plupart de transfert de gène et gène édition avec poisson 30 , 42. le protocole actuel s’est avérée...

Microinjection est une technique courante de laboratoire utilisée pour livrer une petite quantité d’une substance telle que l’ADN, ARN, protéines et autres macromolécules dans des cellules ou des embryons dans un capillaire de verre1. Microinjection est effectuée à l’aide de la configuration d’équipements spéciaux dont un microinjector micromanipulateur et un microscope2. La technique a été utilisée par les chercheurs de modifier génétiquement les nombreux organismes grâce à la génération de transgénèse, débouchures de gènes et thérapie génique, dans le but de comprendre la dynamique des composants intracellulaires3,4 , 5.
La barbue de rivière (Ictalurus punctatus) est l’espèce de poisson-chat plus populaires dans l’aquaculture et les activités de pêche récréative aux États-Unis. Il y a un besoin croissant pour l’étude génomique fonctionnelle chez la barbue et le séquençage du génome complet du barbue améliore l’utilité des progrès récents en génomique édition outils6,7. Comprendre la fonction du gène n’enrichirait pas seulement la recherche qui est actuellement menée sur le poisson-chat, mais pourrait également conduire à des programmes d’amélioration génétique plus efficaces pour améliorer l’industrie du poisson-chat. Une fois que les gènes critiques pour un trait donné d’intérêt sont identifiés, ils peuvent être utilisés pour améliorer génétiquement production poisson-chat par l’édition de génome pour générer des allèles bénéfiques, sélection pour ces allèles, supprimant les allèles préjudiciables, transfert les allèles avantageux grâce à la transgénèse, ou une combinaison de ces options. Combinant les meilleurs gènes pour différents traits commercialement bénéfiques provenant de différentes espèces dans un poisson améliorerait considérablement la productivité et la rentabilité de poisson production opérations8.
Knock-out du gène est une méthode directe pour étudier les fonctions de gènes in vivo. Mutations au niveau de l’ADN seront héritées par les générations futures qui faciliteront l’étude de leurs effets dans les différentes générations. Outils d’édition différents génomes ont été développés notamment zinc finger nucleases (ZFNs), transcription nucléases activator comme effecteur (TAPS) et groupés régulièrement dois‑je court palindrome répétitions/CRISPR-protéine associée à la 9 (CRISPR/Cas9 ) système9,10,11,12.
Le système CRISPR/Cas9 est un outil puissant et efficace qui a été utilisé pour modifier des séquences d’ADN génomique y compris knock-out du gène chez les poissons à guidage RNA DNA in situ clivage5,13. Le système est constitué d’un ARN guide (gRNA), qui détermine la séquence ciblée dans le génome et une enzyme d’endonucléase ADN, Cas9. Le système CRISPR/Cas9 peut être conçu pour cibler n’importe quelle séquence du génome avec plusieurs avantages par rapport aux ZFNs et TALENs : (1) plus bas coût d’ingénierie (2) plus facile fixation (3) plus spécifique du guide RNA de la séquence cible et réduit les mutations hors cible (4) plusieurs séquences peuvent être ciblées avec différent gRNA à la même vitesse de mutagenèse haute heure (5) dans les gènes qui ne pourrait pas être muté par TALENs et (6) taux de transmission meilleure lignée germinale des mutations pour jusqu'à 6 fois par rapport aux ZFNs et TALENs14, 15,16,17,18.
L’autre principale méthode de microinjection est électroporation, dans lequel les impulsions électriques sont appliquées à des embryons ou des cellules pour augmenter la perméabilité de la membrane et l’absorption des molécules biologiques19,20. Plusieurs poissons transgéniques ont été générés en utilisant l’électroporation comme medaka (Oryzias latipes), poisson zèbre (Danio rerio), le saumon chinook (Oncorhynchus tshawytscha), barbue, la dorade (Sparus sarba), et commune la carpe (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.
Électroporation a été utilisée pour fournir des protéines ADN, d’ARN et Cas9 de plasmide pour knock-out du gène. Dans les cellules de mammifères, Cas9/gRNA plasmid DNA, Cas9 ARNm/gRNA et des complexes de protéine/gRNA Cas9 ont été livrés à l’aide d’électroporation et les taux de mutagenèse étaient plus élevés utilisant des complexes de protéine/gRNA Cas9 pour la plupart électroporation conditions testées27. Les chordés ascidies (Ciona intestinalis), TALENs exprimant les constructions étaient électroporation dans des oeufs fécondés pour induire la knockout de multiples gènes28. ZFNs exprimant le plasmide constructions étaient électroporation pour assommer l’hormone lutéinisante dans barbue29. Cependant, une fois introduit dans la cellule, des constructions de plasmide devra être transcrit à l’ARN et traduit en protéines fonctionnelles avant qu’ils peuvent cibler la séquence d’ADN désirée, ce qui retarderait probablement le temps de la mutagénèse par rapport à la microinjection d’ARN / protéine. Telle qu’un embryon se développe, mutagenèse retard augmente le mosaïcisme des fondateurs injectées. En outre, l’expression transgénique est peu susceptible d’atteindre le niveau d’expression possible avec microinjection, abaissant l’efficacité de la mutagénèse.
Comme un moyen pour introduire des outils d’édition du génome dans les cellules, microinjection présente plusieurs avantages sur électroporation. Génome, édition de molécules peut être fiable introduit dans des cellules ou des embryons par microinjection30. Moins de matériel injection est nécessaire. Il est facile de déterminer les quantités de matériau injecté. Mutation plus élevée avec faible mosaïcisme chez les poissons du fondateur, les taux peuvent être réalisés qui améliorerait la transmission de la lignée germinale des mutations à F1. Moins de poissons fondateur doivent être analysées pour produire la première génération, en raison du taux de mutation plus élevé. Dans l’électroporation, plus de poisson fondateur doivent être analysées qui augmentera les coûts. Cependant, la survie des embryons de barbue micro est inférieure à électroporation ceux, même si cela peut être surmonté en injectant plus embryons31,32. Barbue de rivière, la survie des embryons de jaune d’oeuf-micro varie de 16 à 55 % selon les gènes ciblés et le dosage de la protéine gRNA/Cas932.
Microinjection régulière des embryons de poisson-chat est techniquement difficile et chronophage, cependant, un protocole de microinjection de protéine CRISPR/Cas9 rapid et efficace est présenté pour les embryons de barbue. Ce protocole requiert moins de temps et expertise, puisque la solution protéique CRISPR/Cas9 est injectée dans le jaune d’un embryons de cellule. Des centaines d’oeufs fécondés peuvent être injectés en 1 h (environ le temps nécessaire à la première division cellulaire se produire). Pour valider le protocole, deux gènes reliés à la susceptibilité de la maladie ont été éliminés barbue, le gène molécule (TICAM1) adaptateur sans frais/interleukine 1 récepteur contenant du domaine et le gène de lectine (RBL) de liaison de rhamnose. 1 TICAM est impliqué dans la voie de signalisation initiée par récepteur toll-like (TLR) 3. Chez la barbue, TICAM 1 a considérablement augmenté suite à un tacle bactérien avec Edwardsiella ictaluri, alors qu’il était diminuée dans le poisson-chat bleu, une espèce résistante à ictaluri E.33. RBL joue un rôle important dans l’infection précoce avec celui de Flavobacterium, l’agent causal de la maladie columnaris, où aiguë et upregulation robuste a été enregistrée chez une souche de barbue columnaris-sensible par rapport à un souche résistante à columnaris34.

<table><tbody><tr><td>Implant Reproboost</td><td>Centre de biotechnologie</td><td></td> marine <td>Analogue de l’hormone de libération de l’hormone lutéinisante (LHRHa) pour l’induction de l’ovulation chez les femelles de poisson-chat de rivière</td></tr><tr><td>TRICAINE-S</td><td>Western Chemical. Inc.</td><td></td><td>Pour la sédation des poissons géniteurs lors de l’injection d’hormones et de l’épilation des œufs.</td></tr><tr><td>Rouge de phénol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>0,5 %, filtre stérile</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Olympus</td><td>213709</td><td>Pour visualiser les œufs lors de la micro-injection</td></tr><tr><td>Micro-injecteur</td><td>ASI-Applied Scientific Instrumentation&nbsp ;</td><td>Modèle MPPI-3</td><td>Pour l’administration du matériel d’injection dans les embryons</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>ASI-Applied Scientific Instrumentation&nbsp ;</td><td>Modèle MM33&nbsp ;</td><td>Pour tenir et contrôler le mouvement de l’aiguille d’injection.</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Pour le chargement de la solution d’injection dans les aiguilles de microinjection.</td></tr><tr><td>Extracteur d’aiguille vertical</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modèle 720</td><td>Pour tirer les aiguilles de micro-injection</td></tr><tr><td>Protéine Cas9</td><td>PNA Bio Inc.</td><td>CP01</td><td>Protéine recombinante Cas9 de Streptococcus pyrogenes.</td></tr><tr><td>Expand Système PCR High FidelityPLUS</td><td>&nbsp ; Roche Diagnostics, États-Unis</td><td></td><td>Pour la PCR et l’amplification de matrices d’ADN à utiliser dans la préparation d’ARNg</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Diamètre extérieur (OD) de 1 mm, pour la fabrication d’aiguilles de micro-injection.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>Pour maintenir les embryons pendant la micro-injection.</td></tr><tr><td>Crisco</td><td>The J.M. Smucker Company</td><td></td><td>Shortening végétal pour enrober les frayères et les boîtes de Pétri</td></tr>.La <tr><td>solution de Holtfreter</td><td>Made Home 59</td><td></td><td>mM de NaCl, 0,67 mM de KCl, 2,4 mM de NaHCO3, 0,76 mM de CaCl2, 1,67 mM de MgSO4 pour incuber les embryons micro-injectés jusqu’à l’éclosion.</td></tr><tr><td>Hyclate de doxycycline USP (monohydrate)</td><td>Letco Medical</td><td>690904</td><td>Antibiotique ajouté à la solution de Holtfreter à 10 ppm pour prévenir les infections bactériennes.</td></tr></tbody></table>

microinjection de protéine crispr/cas9 dans des embryons de barbue de rivière, ictalurus punctatus, pour gene editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Le génome complet de la barbue de rivière, Ictalurus punctatus, a été séquencé, menant à plus grandes possibilités pour l’étude de la fonction du gène barbue. Knock-out du gène a été utilisé pour étudier ces fonctions de gènes in vivo. Le cluster régulièrement entrecoupées de protéine de courtes répétitions/CRISPR palindromique associé 9 (CRISPR/Cas9) système est un outil puissant permettant de modifier les séquences d’ADN génomique pour altérer la fonction du gène. Alors que l’approche traditionnelle a été d’introduire CRISPR/Cas9 ARNm dans des embryons de cellule unique entre la microinjection, cela peut être un processus lent et inefficace dans le poisson-chat. Ici, un protocole détaillé pour microinjection des embryons de barbue avec CRISPR/Cas9 protéine est décrite. Brièvement, œufs et du sperme ont été recueillie et puis artificielle fécondation effectuée. Les œufs fécondés sont transférés à une boîte de Pétri contenant la solution de Holtfreter. Volume d’injection a été étalonné et ensuite guider RNAs/Cas9 ciblant le gène de la molécule (1 TICAM) adaptateur contenant du domaine récepteur péage/interleukine 1 et gène de rhamnose binding lectine (RBL) ont été microinjected dans le jaune d’embryons unicellulaire. Le coup de grâce de gène a réussi comme indels ont été confirmés par le séquençage de l’ADN. Les altérations de séquence de protéine en raison de ces mutations inclus déphasage et tronquée de protéine en raison de codons stop prématurés.

Pour démontrer l’efficacité du protocole microinjection, gRNAs conçus pour cibler le barbue sans frais/interleukine 1 gène du récepteur contenant du domaine adaptateur molécule (TICAM1) et la rhamnose binding lectine (RBL) gène étaient micro.
TICAM 1 Séquençage de l’ADN des vecteurs de colonies individuelles de produits PCR regroupées, clonés a révélé les indel mutations induites dans le gène TICAM 1. Le taux...

Un protocole de microinjection simple et efficace pour l’édition de gène dans des embryons de barbue en utilisant le système CRISPR/Cas9 est présenté. À ce protocole, le guide des ARN et protéine Cas9 étaient micro dans le jaune d’embryons unicellulaire. Ce protocole a été validé par assommant deux gènes immunitaires de barbue.

Microinjection de protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière, Ictalurus punctatus, pour Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Micro-injection de la protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de poisson-chat de rivière, Ictalurus punctatus pour l’édition de gènes. Le développement d’un protocole fiable et efficace d’édition génomique ciblée chez le poisson-chat de rivière est crucial pour l’étude de la génomique fonctionnelle. Surtout après que les ressources génomiques aient été enrichies par le séquençage du génome du poisson-chat de rivière.Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’édition du génome CRISPR/Cas9 chez le poisson-chat de rivière. Ce protocole a été développé et validé en ciblant deux gènes liés au système immunitaire du poisson-chat. La molécule adaptatrice contenant le domaine du récepteur Toll/interleukine-1, ou gène TICAM1, et la lectine de liaison au rhamnose ou le gène RBL.Toutes les procédures ont été effectuées à l’unité de recherche sur la génétique des poissons du Centre de recherche sur les pêcheries de coquillages EW de l’Université d’Auburn en Alabama. Sélection des stocks de géniteurs et ponte. Choisissez un stock de géniteur de poisson-chat de canal sain à partir d’une souche ou d’une lignée génétique que vous aimeriez modifier.Les mâles et les femelles du poisson-chat de rivière doivent présenter de bonnes caractéristiques sexuelles secondaires. Choisissez des mâles qui ont une tête musclée large et plus large que le reste de leur corps avec une papille génitale bien développée. La couleur sombre et les cicatrices des combats territoriaux sont également des signes de préparation sexuelle.Choisissez des femelles qui ont la tête plus étroite que le reste de leur corps et qui ont un abdomen doux, palpable et bien arrondi. Par souci de précision et pour éviter de stresser les poissons lors de la manipulation initiale, arrêtez de nourrir les femelles deux à trois jours avant d’examiner si elles sont prêtes à frayer. La manipulation du poisson doit être effectuée rapidement, mais avec soin, afin de réduire le stress lié à la manipulation.Toutes les procédures qui nécessitent la manipulation des femelles doivent être effectuées pendant que les poissons sont gardés dans des sacs de frai. Juste avant l’injection d’hormones, obtenez le poids corporel des femelles. Les sacs de reproduction avec des femelles à l’intérieur peuvent ensuite être suspendus dans un réservoir à écoulement continu avec un débit d’eau continu et une aération adéquate.Chargez aseptiquement l’implanteur doté d’une aiguille de calibre 14 avec 85 microgrammes par kilogramme d’analogue de l’hormone de libération de l’hormone lutéinisante. LHRHA. Rincer le site d’injection et la musculature dorsale avec une solution saline stérile à 0,9 % avant l’injection. Insérez l’implanteur à un angle de 45 degrés et relâchez l’implant.Retirez l’aiguille et essuyez le site d’injection avec un coton préalablement imbibé d’éthanol à 70 %. Placez le sac de reproduction dans le réservoir de rétention de manière à ce que le poisson soit complètement immergé dans l’eau à 15 à 20 centimètres sous la surface de l’eau. Une aération adéquate comprenant cinq parties par million ou plus d’oxygène dissous, une bonne qualité de l’eau sont importantes pour l’ovulation d’ovules de haute qualité.Prédisez le temps d’ovulation en fonction de la température de l’eau en utilisant la relation degrés-heures. Habituellement, la première vérification des ovules est effectuée environ 36 heures après l’injection d’hormones, puis à quatre heures d’intervalle. Pour vérifier l’ovulation, soulevez doucement le sac de ponte au-dessus de la surface de l’eau pendant que vous recherchez les œufs qui sont attachés à l’intérieur du sac.Lorsque vous voyez au moins 10 œufs, cette femelle ovule et est prête à être épilée à la main. Préparation du sperme. Les spermatozoïdes peuvent être préparés quelques heures avant l’heure d’ovulation prévue.Les poissons mâles sont euthanasiés et les testicules sont recueillis dans une petite balance. Déterminez le poids des testicules. Retirez tout mouchoir et lavez les testicules avec une solution saline à 0,9 % pour éliminer le sang si nécessaire.Les testicules bien développés sont blancs avec de nombreuses projections villiformes. Écrasez les testicules et filtrez les spermatozoïdes à l’aide d’une maille de 100 microns. Utilisez une solution saline à 0,9 % pour laver le sperme du grillage dans un tube de 50 millilitres.Une solution saline peut être ajoutée jusqu’à 10 millilitres par gramme de testicules. Déterminez la concentration des spermatozoïdes. Vérifiez la motilité et la viabilité.Cependant, pour ces procédures, cela n’est pas nécessaire si les testicules sont bien développés. Le sperme peut alors être stocké à quatre degrés C et doit être utilisé dans les 24 heures suivant la préparation. Collecte des ovules et fécondation.Appliquez une très fine couche de shortening végétal dans une frayère propre et sèche de 20 centimètres de diamètre. Placez la femelle dans une solution anesthésique contenant 100 parties par million de méthanesulfonate de tricaïne tamponné avec du bicarbonate de sodium jusqu’à ce que le poisson soit complètement anesthésié. Retirez délicatement le poisson de la poche de ponte et trempez-le dans une solution saline à 0,9 % pour éliminer l’anesthésique.Séchez complètement le poisson à l’aide d’une serviette propre en évitant d’enlever la couche de mucus à la surface du corps du poisson. Appliquez du shortening végétal sur la zone autour de l’évent, y compris les nageoires pelviennes, pour présenter la fixation des œufs pendant le décapage à la main. Retirez les œufs à la main dans la fraye graissée en appliquant une légère pression sur les ovaires.Les bons œufs doivent couler librement, être de couleur jaune doré et avoir peu ou pas de grumeaux ou de caillots sanguins. Évitez tout contact entre les œufs et l’eau avant la fécondation car l’eau peut retarder la fermeture du micropyle. Pour féconder les œufs pour la micro-injection, transférez à 200-300 œufs dans une frayère graissée.Ajoutez un à deux millilitres de solution pour spermatozoïdes aux ovules et mélangez doucement. Ajoutez de l’eau fraîche aux ovules pour activer les spermatozoïdes et les ovules. Il faut ajouter suffisamment d’eau pour couvrir légèrement les œufs.Faites remuer doucement les œufs pendant 30 secondes. La fécondation devrait se produire en une à deux minutes. Il est important de féconder les ovules en une seule couche.Les œufs de poisson-chat adhèrent les uns aux autres, ce qui rend difficile la micro-injection de plusieurs couches d’embryons. Ajoutez plus d’eau fraîche aux œufs fécondés et laissez les œufs durcir pendant 10 à 15 minutes. Les œufs non fécondés restants peuvent être recouverts d’une serviette humide pour éviter le dessèchement et peuvent être fécondés en quelques heures.La fertilisation peut se faire de manière échelonnée. Un lot de deux à 300 ovules peut être fécondé toutes les 30 à 60 minutes pour assurer l’approvisionnement continu en embryons au stade d’une cellule pour la micro-injection et contrôler les embryons non injectés. Tirage et chargement de l’aiguille.Tirez un capillaire en verre borosilicaté d’un millimètre de diamètre extérieur en deux aiguilles. Rangez les aiguilles dans une boîte en papier avec un morceau d’éponge dans laquelle plusieurs incisions ont été pratiquées. Pour éviter de casser l’aiguille, le diamètre de l’éponge doit être inférieur à la longueur de la tige de l’aiguille.La pointe de l’aiguille peut ensuite être ouverte en cassant un petit morceau de l’aiguille dans la région la plus fine à l’aide d’un objet pointu. Alternativement, l’aiguille peut être ouverte en pinçant la région la plus fine de la pointe avec une paire de pinces sous le microscope. Préparez la solution d’injection en mélangeant les ARN guides avec la protéine Cas9.Le rouge de phénol peut être ajouté pour colorer le mélange de protéines d’ARN guide Cas9, le rouge de phénol constituant jusqu’à un tiers du volume total. Le mélange est ensuite incubé pendant 10 minutes sur de la glace avant d’être utilisé. À l’aide d’un micro-chargeur, chargez 5 à 10 microlitres du mélange d’ARN guide Cas9 dans l’aiguille d’injection.En insérant le micro chargeur dans la tige de l’aiguille et en expulsant lentement le mélange tout en rétractant la pointe du micro chargeur. Évitez de piéger des bulles d’air à l’intérieur. Fixez l’aiguille au porte-micro-pipette et assurez-vous d’une connexion étanche.Et puis fixez le support au micro-manipulateur. Assurez une liberté de mouvement et une stabilité. Appliquez une pression pour la micro-injection en ouvrant la bouteille d’azote et en ajustant le régulateur de pression.Le volume d’injection peut être affecté par la pression, le diamètre de l’ouverture de l’aiguille et la durée de l’injection. Pour déterminer le volume que vous souhaitez injecter, injectez dans une goutte d’huile minérale placée sur un hémocytomètre. Si nécessaire, la pression et le diamètre de l’aiguille peuvent être ajustés pour augmenter ou diminuer le volume de l’injection.Injectez plusieurs fois dans l’huile minérale pour assurer un volume constant. Micro-injection d’embryons de silure. Appliquez une très fine couche de shortening végétal sur une boîte de Pétri propre de 100 millimètres.Transférez 50 à 100 œufs de la casserole de fécondation dans la boîte de Pétri et couvrez-les de la solution de Holtfreter. Les œufs doivent être alignés les uns contre les autres en une seule couche. Cet alignement devrait maintenir les œufs en place pendant le processus de micro-injection.Placez la boîte de Pétri avec les œufs sur la platine du microscope et tenez-la d’une main. Abaissez l’aiguille avec l’autre main jusqu’à ce qu’elle perce le chorion et le jaune d’un seul mouvement fluide. La pointe de l’aiguille doit être aussi proche que possible du blastodisque avant de délivrer le matériau d’injection.Appuyez sur la pédale et versez le matériau d’injection dans le jaune. Si le blastodisque n’est pas clairement visible, le matériau d’injection peut être répandu à différents endroits dans le jaune. Pour ce faire, l’aiguille est insérée à l’extrémité du jaune.Appuyez ensuite sur la pédale et retirez l’aiguille simultanément. Cela répartit le matériau d’injection à différents endroits dans le jaune. 50 nanolitres contenant 2,5 nanogrammes d’ARN guide et 7,5 nanogrammes de protéine Cas9 peuvent être injectés sans problème dans le jaune.Rétractez l’aiguille en douceur pour ne pas endommager l’œuf. Déplacez ensuite la boîte de Pétri pour injecter un autre œuf avec la même procédure. Évitez de bouger la boîte de Pétri pendant le processus d’injection, car cela pourrait endommager l’œuf ou casser l’aiguille.Retirez les ovules qui sont rompus ou endommagés à cause de la micro-injection. L’injection peut être commencée 15 à 20 minutes après la fécondation et se poursuivre tant que les embryons sont encore au stade d’une cellule. Les embryons injectés sont remis dans la solution de Holtfreter avec 10 PPM de doxycycline et une aération continue pendant six à sept jours jusqu’à l’éclosion.La solution est changée tous les jours et les embryons morts sont retirés. Résultats. Cette figure montre les mutations induites par CRISPR/Cas9 dans le gène TICAM1 du poisson-chat de rivière. La séquence bleue représente le motif adjacent au protospacer ou PAM, tandis que la séquence verte représente la cible de l’ARN guidé.On s’attendait à ce qu’une cassure double brin induite par la protéine Cas9 se produise à l’endroit des deux triangles rouges. Les mutations de délétion sont représentées par une ligne pointillée, dans laquelle chaque tiret correspond à un nucléotide qui a été supprimé. Les séquences rouges sont des insertions tandis que le violet représente une mutation de substitution.Les fractions de 78 représentent le nombre d’allèles mutés dans 78 réactions de séquençage. Par exemple, 3/78 signifie qu’un allèle a été détecté dans trois réactions de séquençage sur un total de 78 réactions. Le taux de mutation était de 79,2 % chez 24 individus analysés.Les mutations ont entraîné l’élimination d’un peu trop d’acides aminés de la protéine, modifiant le cadre de lecture en aval et mettant fin prématurément à la traduction. Dans la plupart des mutations, plus de 80 % de la séquence protéique prédite par TICAM1 a été tronquée en raison d’un codon stop prématuré. Cette figure montre les mutations induites par CRISPR/Cas9 dans le gène RBL du poisson-chat de rivière.Les suites exoniques sont des majuscules tandis que les suites introniques sont des lettres minuscules. Les séquences bleues représentent le motif adjacent au protospacer tandis que la séquence verte représente la cible de l’ARN guidé. On s’attendait à ce qu’une cassure double brin induite par la protéine Cas9 se produise à l’endroit des deux triangles rouges.Les mutations de délétion sont représentées par une ligne pointillée dans laquelle chaque tiret correspond à un nucléotide qui a été supprimé. Les séquences rouges sont des insertions. Les fractions de 40 représentent le nombre d’allèles mutés dans 40 réactions de séquençage.Par exemple, 2/40 signifie qu’un allèle a été détecté dans deux réactions de séquençage sur un total de 40 réactions. Le taux de mutation était de 87,5 % chez 40 individus analysés. Les suppressions vont de cinq paires de bases à 183 paires de bases, tandis que jusqu’à 20 paires de bases ont été insérées.Plus de 70 % des indels ont donné une protéine tronquée de 10 % ou moins de la longueur de la protéine de type sauvage. Dans cette vidéo, nous avons montré comment micro-injecter la protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de poisson-chat à un canal cellulaire. Les procédures décrites sont simples, rapides et efficaces.Et a réussi à inactiver deux gènes de poisson-chat de canal. TICAM1 et RBL. En fonction de ce qui est injecté, le protocole peut être modifié pour inclure d’autres substances biologiquement actives.Il peut également être modifié pour micro-injecter d’autres espèces de poissons-chats ou d’autres espèces de poissons qui ont une structure et une composition d’œufs similaires.

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Genetics

Génétique

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Apprenez la microinjection de CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière Ictalurus punctatus pour l'édition génique. Cette méthode validée cible les gènes immunitaires TICAM1 et RBL.

Microinjection de protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière, Ictalurus punctatus, pour Gene Editing

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