Construction et évaluation d’un modèle murin ostéolyse substance par l’exposition aux particules CoCrMo descellement aseptique
17 février 2018
Ce manuscrit décrit un modèle murin ostéolyse substance par l’exposition aux particules CoCrMo, qui constitue un modèle animal idéal pour évaluer les interactions entre particules d’usure et de diverses cellules de descellement aseptique.
L'objectif général de cette procédure est de construire et d'évaluer le modèle d'ostéolyse calvariale murine par exposition à des nanoparticules de cobalt-chrome-molybdène. L'ostéolyse induite par les particules d'usure est une cause majeure de descellement aseptique dans l'échec des arthroplasties, mais les mécanismes sous-jacents restent mal compris. En raison de la longue durée de suivi et de l'apparition sporadique, il est difficile d'explorer la pathogenèse du descellement aseptique dans les cas cliniques.
Par conséquent, un modèle animal de usure est nécessaire pour poursuivre les études. Dans notre laboratoire, un modèle d'ostéolyse calvariale murine induite par des particules d'alliage de cobalt constitue un modèle efficace pour étudier la pathogenèse du relâchement aseptique. Cette approche consiste d'abord à générer des particules nanométriques de chrome-cobalt-molybdène à partir de prothèses en alliage de cobalt, puis à les resuspendre dans une solution saline tamponnée au phosphate à une concentration de 15 milligrammes par millilitre.
L'étape suivante consiste à identifier la position de l'incision sur une ligne située entre les deux points médians entre les yeux et les oreilles, respectivement. Ensuite, retirez le périoste crânien du calvarium par dissection par choc. Puis, prélevez 50 microlitres de la solution mère de nanoparticules d'alliage de cobalt et incorporez-les dans la suture médiane du calvarium.
Après deux semaines de maintien, sacrifier certaines souris et prélever les calvaria pour l'évaluation de l'ostéolyse. L'ostéolyse est évidente chez les souris traitées avec des nanoparticules d'alliage de cobalt, tant sur les images de micro-TDM que sur les colorations HES. Obtenir de l'alliage de cobalt-chrome-molybdène à partir d'une prothèse en alliage de cobalt, puis obtenir des particules de cobalt-chrome-molybdène à partir de l'alliage de cobalt-chrome-molybdène par courant continu triélectrode sous vide élevé.
Afin de quantifier le diamètre moyen des particules de chrome cobalt molybdène, prélevez un milligramme de particules dans 1,5 millilitre d'éthanol anhydre et mettez-les en suspension par agitation ultrasonique. Appliquez une goutte, environ 20 microlitres, de la suspension sur la platine de la microscopie électronique en transmission et acquérez une série d'images. Utilisez le logiciel fourni pour calculer le diamètre moyen et la distribution de la taille des particules sur les images de MET.
Voici des images représentatives de MET dans le panneau de gauche, tandis que celui de droite montre la distribution de la taille des nanoparticules d'alliage cobalt-chrome-molybdène calculée à l'aide de notre logiciel commercial. Le diamètre moyen est d'environ 50 nanomètres. Stériliser les particules en autoclave pendant 15 minutes afin d'éliminer les endotoxines.
Ensuite, les resuspendre dans du sérum physiologique tamponné au phosphate à une concentration de 15 milligrammes par millilitre comme solution mère. L'étape suivante consiste à construire le modèle d'ostéolyse calvarienne. Sélectionner et anesthésier des souris âgées de six semaines : six souris par groupe.
Placer les animaux en position idéale. Retirer le pelage et désinfecter la peau du crâne avec de l'éthanol à 75 pour cent. Pour l'incision, repérer les deux points médians entre les deux yeux et les deux oreilles, respectivement, puis inciser la peau le long de la ligne les reliant.
Retirer soigneusement et complètement le périoste crânien de la voûte crânienne par dissection par choc. Une dissection claire du périoste intensifie les interactions entre les particules de la voûte crânienne. La suture est réalisée soigneusement aux deux extrémités de l'incision en points séparés simples.
En général, trois points de suture sont nécessaires pour une suture complète. Pour la dernière étape, passez le fil de suture à travers l'incision sans faire de nœud, en tenant les deux extrémités du fil. Prélevez 15 microlitres de solution mère de nanoparticules d'alliage de cobalt et incorporez-les dans le point de suture médian de la calvaria.
Faire un nœud sur le dernier point de suture simple interrompu. Maintenir les souris encore deux semaines. Deux semaines plus tard, sacrifier l’animal et prélever le crâne.
Retirer délicatement tous les tissus mous des échantillons de calvaria à l’aide de pinces, puis fixer le tissu dans du paraformaldéhyde à quatre pour cent à quatre degrés Celsius. Pour l’évaluation de l’ostéolyse dans le modèle induit par des nanoparticules de chrome-cobalt-molybdène, effectuer une micro-TDM à haute résolution 24 heures avant le balayage en micro-TDM. Transférer les échantillons de calvaria dans du tampon salin phosphate à partir du paraformaldéhyde.
Le jour de l'analyse par micro-TDM, prélevez des spécimens de calvaria dans du chlorure de sodium tamponné au phosphate et fixez-les sur un support associé à un instrument. Analysez les calvarias à l'aide d'un instrument de micro-TDM. Réalisez une reconstruction tridimensionnelle à l'aide de logiciels variés.
La coloration H et E est un autre outil pour évaluer l'ostéolyse dans un modèle induit par des nanoparticules. Décalcifier les échantillons de calvaria dans du tampon salin phosphate contenant 15 pour cent d'acide éthylènediaminetétraacétique pendant trois semaines à quatre degrés Celsius. Inclure la calvaria décalcifiée dans la paraffine et la sectionner en tranches de deux micromètres dans la zone de dépôt des particules.
Colorer les coupes avec de l'hématoxyline et l'éosine. Observer le morphisme global et au microscope optique, puis acquérir des microphotographies. Voici des images représentatives de micro-CT.
Des images de reconstruction tridimensionnelle des données de micro-TDM sont présentées dans le panneau de gauche. Des images de sections transversales provenant de souris du groupe témoin, du groupe soumis à une opération factice et du groupe traité avec des nanoparticules sont présentées dans le panneau de droite. L'ostéolyse est évidente dans le groupe traité avec des nanoparticules.
Voici une analyse quantitative de photographies de micro-TDM effectuée à l'aide du logiciel associé à l'instrument. Les mesures comprennent la densité minérale osseuse, le volume osseux ou le rapport de volume total, le pourcentage de porosité totale, le nombre trabéculaire, l'épaisseur trabéculaire et la séparation ou espacement trabéculaire. Les souris traitées avec des nanoparticules d'alliage de cobalt présentent une densité minérale osseuse et un volume osseux significativement plus faibles, ainsi qu'un pourcentage de porosité totale plus élevé par rapport aux animaux témoins.
Voici des images représentatives de colorations H et E de prélèvements de calvaria provenant de souris contrôles, d'un groupe témoin ayant subi une opération fictive et d'un groupe traité par des nanoparticules. L'ostéolyse est également évidente dans le groupe traité par des nanoparticules. Le modèle murin d'ostéolyse calvarienne induit par des nanoparticules d'alliage de cobalt présente un taux de réussite élevé pour modéliser l'ostéolyse induite par des particules d'usure.
Voici plusieurs facteurs clés. Premièrement, les nanoparticules en alliage de cobalt renforcent l'interaction entre les particules d'usure et la calvaria. Deuxièmement, une exposition adéquate de la calvaria et une dissection précise du périoste rendent l'interaction entre les particules et la calvaria plus intense.
En troisième lieu, les mesures quantitatives de la perte osseuse par micro-TDM facilitent l'évaluation des différences de résorption osseuse entre divers traitements, nous fournissant une preuve solide d'ostéolyse comparée à l'histomorphométrie osseuse traditionnelle. Le modèle d'ostéolyse de la calvaria induit par des particules d'alliage de cobalt constitue un modèle idéal pour étudier l'interaction entre les particules d'usure et différents types cellulaires dans le relâchement aseptique, tels que les macrophages, les fibroblastes, les ostéoclastes et les ostéoblastes.
Nous espérons que notre modèle sera utile pour l'étude du descellement asptique à l'avenir.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Ce manuscrit décrit un modèle murin d'ostéolyse du crâne induite par l'exposition à des nanoparticules de cobalt-chrome-molybdène, qui constitue un modèle animal idéal pour évaluer les interactions entre les particules d'usure et diverses cellules dans le relâchement septique. Ce modèle est essentiel pour comprendre la pathogenèse de l'ostéolyse liée à l'échec d'une arthroplastie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Orthopédie
Contexte
- La lyse osseuse induite par les particules est une cause importante de descellement aseptique des prothèses articulaires.
- Les mécanismes mécaniques sous-jacents à ce processus restent mal compris.
- Les études cliniques rencontrent des difficultés dues aux longues périodes de suivi et à la survenue sporadique des cas.
- Un modèle animal fiable est essentiel pour approfondir les recherches.
Objectif de l'étude
- Construire et évaluer un modèle murin d'ostéolyse calvarienne.
- Étudier les interactions entre les particules de cobalt-chrome-molybdène et diverses cellules.
- Approfondir la compréhension de la pathogenèse du relâchement aseptique.
Méthodes utilisées
- Génération de particules nanométriques de chrome-cobalt-molybdène à partir d'une prothèse en alliage de cobalt.
- Resuspension des particules dans du sérum physiologique tamponné au phosphate à une concentration de 15 mg/mL.
- Exposition du tissu calvarial murin aux particules.
- Évaluation des interactions cellulaires et des réponses ostéolytiques.
Résultats principaux
- Le modèle murin imite efficacement l'ostéolyse induite par les particules d'usure.
- Les interactions entre les particules et les cellules ont été évaluées avec succès.
- Les résultats contribuent à la compréhension des mécanismes du relâchement aseptique.
- Ce modèle peut être utilisé pour des études futures sur l'échec de l'arthroplastie.
Conclusions
- Le modèle de lyse ostéolytique calvarienne chez la souris est un outil précieux pour la recherche.
- Il permet d'obtenir des informations sur la pathogenèse de la lyse ostéolytique.
- Ce modèle peut aider à élaborer des stratégies visant à atténuer le relâchement asétique.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La lésion ostéolytique induite par les particules reste une cause majeure de descellement aseptique dans l'échec des prothèses articulaires, bien que la compréhension mécanistique soit limitée par les contraintes des études cliniques. Le modèle murin de calvaria offre un système rapide et quantifiable pour évaluer les interactions particules-cellules, permettant une détection précoce des risques liés aux biomatériaux et aux conceptions d'implants en phase préclinique. Cela soutient la validation des cibles thérapeutiques et renforce la confiance prédictive dans les filières de recherche et développement orthopédiques en phase initiale.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques concernant les interactions entre les particules d'usure et les macrophages, les fibroblastes, les ostéoblastes et les ostéoclastes.
- Valeur opérationnelle : Facilite la réduction des risques biologiques grâce à une évaluation quantitative de la perte osseuse par micro-tomodensitométrie (micro-CT) et histomorphométrie.
- Valeur prédictive : Soutient le tri du portefeuille en modélisant les réponses ostéolytiques afin d'orienter le choix des matériaux d'implants.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l'emploi du test : Génère des résultats biologiques standardisés (densité minérale osseuse, paramètres trabéculaires) pour l'évaluation de composés ou de revêtements.
- Reproductibilité : Un taux de réussite élevé et une faible variabilité permettent un criblage à grande échelle de modifications de particules.
- Utilité de la plateforme : Compatible avec des modèles transgéniques ou knock-out afin d'élucider les voies mécanistiques de l'ostéolyse.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise la pathogenèse du descellement aseptique afin de relier la découverte à la validation préclinique.
- Réduction des risques mécanistiques : Clarifie les voies cellulaires et moléculaires responsables de l'ostéolyse, permettant ainsi une priorisation des cibles.
- Continuité translationnelle : Fournit des paramètres quantitatifs (volume osseux, porosité) prédictifs du comportement in vivo des implants.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le modèle s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique, permettant la vérification d'hypothèses en phase de découverte précoce, le développement de tests pour le criblage, et l'évaluation mécanistique avant l'identification d'un composé candidat.
- Biologie du décryptage : Soutient le test d'hypothèses sur les voies inflammatoires et ostéolytiques induites par les particules.
- Évaluation : Fournit des mesures quantitatives normalisées (paramètres osseux au micro-CT) pour une évaluation fiable de composés ou de biomatériaux.
- Analytique : Génère des données mesurables (densité minérale osseuse, épaisseur trabéculaire, porosité) permettant de comparer différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Relie l'exposition aux particules aux résultats ostéolytiques, éclairant ainsi les décisions d'orientation vers le stade préclinique.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme réutilisable pour l'évaluation de diverses particules d'usure et de revêtements d'implants.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique liée à l'ostéolyse induite par les particules.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité grâce à des protocoles définis d'exposition aux particules et d'évaluation quantitative.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en fournissant une évaluation biologique précoce des risques associés aux matériaux d'implants.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des biomatériaux en fonction de leur potentiel ostéolytique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en chirurgie murine, en manipulation de particules et en imagerie micro-CT.
- Dépend des instruments destinés à la génération de particules (électrode CC sous vide élevé), à la préparation de suspensions et à la quantification de l'ostéolyse.
- Exige une standardisation interéquipes pour le dosage des particules, la technique chirurgicale et les flux de travail d'analyse.
- Les considérations d'adaptation incluent l'adéquation du modèle pour l'évaluation de la chronicité et les études de charge mécanique.
- Limite pratique : ne permet pas d'évaluer les effets des forces mécaniques ou l'exposition chronique à long terme aux particules selon le matériau source.
