Personnalisés de microéchantillons de peptides pour la détection des allo-anticorps HLA dans la Transplantation d’organes

L’objectif global de cette méthode de détection d’allo-anticorps est de délimiter les épitopes humains de l’antigène leucocytaire ou HLA dans la transplantation d’organes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la transplantation d’organes sur les épitopes immunitaires spécifiques impliqués dans le rejet de greffe. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est entièrement personnalisable, ce qui permet d’incorporer des ensembles d’antigènes personnalisés qui peuvent refléter les séquences HLA de chaque donneur d’organes.

La technique a le potentiel de détecter des épitopes HLA spécifiques pour les allo-anticorps. Pour récupérer des séquences de la base de données du projet d’antigène leucocytaire humain de l’International Immunogenetics Project, dans la page des combinaisons d’allèles ambigus, ouvrez le formulaire de requête d’allèles de la base de données et entrez le nom du premier allèle du sujet dans la case de recherche. Cliquez sur Rechercher des allèles maintenant et localisez le nom de l’allèle correspondant affiché à l’écran.

Cliquez sur Allèle et copiez et collez la séquence protéique dans un document texte sous une ligne d’en-tête de nom d’allèle pour organiser le nom de l’allèle en séquence dans un format FATA. Une fois que toutes les séquences ont été identifiées, copiez et collez les séquences du format FASTA dans la case Entrez vos séquences d’entrée sur le site Web du Cluster Omega et cliquez sur Soumettre votre tâche en utilisant les paramètres standard. Cliquez ensuite sur Soumettre.

Un alignement des séquences s’affiche. Pour marquer les incohérences spécifiques au donneur, copiez et collez le texte d’alignement dans un nouveau document texte et utilisez une couleur de police distinctive pour marquer chaque résidu spécifique au donneur non compatible dans les séquences alignées qui appartiennent uniquement au donneur. Soulignez toutes les lettres des séquences donneuses qui étendent 14 résidus vers le haut et en aval des mésappariements spécifiques au donneur marqués et utilisez les séquences soulignées comme modèles pour dériver séquentiellement de courtes séquences de 15 acides aminés dans une série qui se chevauchent de quatre résidus entre deux séquences immédiatement adjacentes de la série.

Copiez et collez ces 15 séquences d’acides aminés dans une feuille de calcul sous forme de colonne, accompagnée de colonnes de notation qui incluent les noms correspondants des allèles donneurs. Pour concevoir une disposition de tableau personnalisée, générez une feuille de calcul de séquences peptidiques avec des appels d’allèles correspondants avec 20 lignes et 30 colonnes. Ensuite, entrez les séquences dans chacune des cellules du réseau et utilisez le synthétiseur ponctuel pour exécuter une synthèse automatisée de réseau de peptides.

Lors de la conception d’une puce, il est essentiel d’utiliser les séquences HLA de donneurs individuels comme modèle pour dériver l’ensemble d’antigènes. Lorsque les matrices ont été synthétisées, bloquez les membranes avec 20 millilitres de lait écrémé à 5 % dissous dans une solution saline tamponnée au Tris avec 0,1 % d’entretoise 20 ou de TBST pendant la période d’incubation appropriée avec balancement. Ensuite, lavez la membrane trois fois avec 20 millilitres de TBST frais pendant cinq minutes par lavage, suivie d’une incubation avec 20 microlitres de sérum receveur brut dans du lait à 2,5 % dans du TBST pendant deux à trois heures à température ambiante.

À la fin de l’incubation, laver la membrane trois fois pendant 10 minutes par lavage et incuber les membranes avec l’anticorps secondaire IgG conjugué à la peroxydase de raifort de chèvre pendant deux heures. Retirez l’anticorps secondaire non lié avec trois lavages de 10 minutes dans du TBST et développez les membranes dans cinq millilitres de solution de luminol fraîchement préparée plus cinq millilitres de solution de peroxyde. Au bout d’une minute, visualisez les signaux de chimiluminescence améliorés sur un imageur approprié.

Après avoir enregistré les images développées, incubez les membranes avec 20 millilitres de tampon de décapage commercial à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes, suivi de trois lavages de 10 minutes dans du TBST. Ensuite, bloquez, sondez à nouveau et visualisez les membranes comme cela vient d’être démontré avec un échantillon de sérum du même patient obtenu à un moment différent. Pour annoter manuellement les peptides antigéniques positifs, localisez les points avec des signaux d’anticorps positifs dans les fichiers d’image développés enregistrés et déterminez chacune de leurs positions sur la grille.

Récupérez ensuite les séquences peptidiques de la feuille de travail principale pour identifier les séquences d’épitopes potentiellement partagées en fonction de leurs segments de peptides réactifs qui se chevauchent. Pour modéliser structurellement les épitopes d’antigènes, obtenez des prototypes de structures cristallines HLA à partir de la banque de données protéiques et affichez le prototype de structure HLA dans Pymol. Mettez en évidence les séquences peptidiques réactives pour cartographier les épitopes anti-donneurs découverts avec les structures 3D du prototype HLA.

Cliquez ensuite sur Affichage et arrière-plan et sélectionnez Blanc, en enregistrant les données sous forme de fichier PNG. Après avoir séquencé plusieurs alignements des allèles représentatifs de ce patient donneur représentatif comme nous venons de le démontrer, un fichier d’alignement a été obtenu pour chacun des allèles. Les séquences modèles du donneur qui étaient suffisamment longues pour couvrir tous les résidus non appariés ont ensuite été identifiées et soulignées, et trois séries de peptides 15-mères ont été dérivées pour le premier allèle.

Après l’analyse de tous les allèles du donneur, un total de 202 peptides ont été chargés dans un réseau pour le sondage spécifique du sérum post-greffe du donneur. La comparaison des résultats avec ceux obtenus à partir d’un nouveau sondage ultérieur du sérum pré-transplantation du donneur a révélé les signaux d’anticorps associés à l’échantillon post-transplantation, dont plusieurs résidus spécifiques du donneur non compatibles avec le receveur semblaient être impliqués dans l’incitation à la réactivité des anticorps. Lorsque les épitopes réactifs aux anticorps sur HLA-DQA1 et DQB1 ont été modélisés à une structure hétérodimère cocristalline, un segment proéminent de la structure connu sous le nom de brin bêta un a été identifié comme un point chaud qui avait beaucoup plus de chances d’être ciblé par des allo-anticorps parmi les sujets transplantés dans une cohorte représentative de cinq cas.

Une fois maîtrisée, la technique peut être complétée en sept à huit heures si elle est exécutée correctement. Après sa mise au point, la technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du rejet de greffe pour explorer la détection personnalisée d’alloanticorps spécifiques au donneur.