Hybridation fluorescente In Situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’Amplification de Signal Tyramide

L’objectif global de cette procédure est de détecter les transcrits d’ARN en place dans les cellules et les tissus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie cellulaire et du développement, telles que l’emplacement d’un ARN à l’intérieur d’une cellule, d’un tissu ou d’un embryon. Le principal avantage de cette technique est qu’elle détecte les distributions spatiales de l’ARN avec des niveaux élevés de résolution et de sensibilité et à faible coût par rapport aux autres méthodes.

Nous avons initialement développé ce protocole pour étudier les distributions subcellulaires du plus grand nombre possible d’ARN de la drosophile. Il s’agissait de déterminer l’étendue et la diversité des distributions subcellulaires. Nous avons commencé le projet en travaillant avec des embryons, mais nous avons ensuite adapté et optimisé le protocole afin de pouvoir travailler à haut débit avec des tissus disséqués à partir de larves et de mouches.

L’aspect le plus difficile de la procédure est le nombre d’étapes et le potentiel d’erreur qui en résulte, ainsi que la nécessité de s’assurer de l’absence d’ARN pendant la production de la sonde. Pour faciliter le débit et la rentabilité, les procédures démontrées dans cette vidéo utilisent des plaques de microtitration à 96 puits pour toutes les étapes. Il est également facile d’adapter cette méthode à des membres d’échantillon plus petits en coupant les plaques en bandes de huit ou 12 puits.

Commencez par diluer 10 microlitres d’une culture bactérienne de nuit dans 90 microlitres d’eau double distillée autoclavée dans chaque puits d’une nouvelle plaque PCR de 96 puits. Dénaturez l’ADN à 95 degrés Celsius dans un thermocycleur pendant cinq minutes. Placez immédiatement l’assiette sur de la glace pendant au moins cinq minutes.

Configurez les réactions PCR dans une nouvelle plaque PCR à 96 puits. Utilisez les amorces universelles appropriées et aliquote 48 microlitres du mélange maître PCR dans chaque puits. Ajoutez deux microlitres de chaque matrice d’ADN plasmidique dénaturé par puits.

Effectuez l’amplification dans une machine PCR à 96 puits. Lorsque l’amplification est terminée, précipiter le produit PCR avec un mélange d’éthanol et d’acétate de sodium. Conservez les échantillons pendant 30 minutes à moins 80 degrés Celsius.

Centrifugez la plaque à 96 puits à 2, 250 fois g à quatre degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes. À l’aide d’une pipette à collecteur sous vide à huit canaux dont la structure empêche les pointes d’aller au fond des puits pour aspirer les granulés, retirez soigneusement le surnageant. Laver une fois avec 160 microlitres d’éthanol à froid à 70 %.

Centrifuger à 2, 250 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retournez doucement la plaque de 96 puits sur une serviette en papier pour retirer les dernières gouttes de liquide dans chaque puits et faites sécher les pastilles d’ADN à l’air libre à température ambiante pendant une heure. Remettre en suspension l’ADN précipité dans 25 microlitres d’eau exempte de RNase.

Vérifier la taille et le rendement des produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose. Configurez les réactions de transcription in vitro en ajoutant les composants appropriés à chaque puits dans une nouvelle plaque de PCR à 96 puits. Ajoutez 7,5 microlitres de matrice d’ADN à chaque puits correspondant.

Couvrez la plaque avec du ruban adhésif. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 3 1/2 à quatre heures. Ensuite, ajoutez à chaque puits un mélange maître composé d’eau double distillée traitée au DEPC, d’éthanol à 100 % et d’acétate de sodium à trois molaires.

Conserver à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Centrifugez la plaque et lavez les puits comme indiqué précédemment. Remettre en suspension la sonde précipitée dans 25 microlitres d’eau double distillée traitée au DEPC.

sondes d’ARN antisens nouvellement synthétisées ont été exécutées sur un gel d’agarose à 1 % pour vérifier l’intégrité et le rendement. En fonction de l’intensité de la bande, le rendement peut être caractérisé comme étant à faible rendement, à rendement typique ou à rendement élevé. Après avoir utilisé cinq microlitres de chaque sonde pour l’électrophorèse sur gel d’agarose, mélangez les 20 microlitres restants avec 100 microlitres de solution d’hybridation et stockez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Pour commencer cette procédure, placez 20 à 30 larves dans une boîte de Pétri contenant du PBS froid dans une solution fixe un et réfrigérez sur de la glace pendant deux minutes pour réduire la motilité larvaire. Disséquez les larves sous la lunette de dissection. À l’aide d’une paire de pinces tranchantes, ouvrez soigneusement l’antérieur et pressez les tissus de l’arrière vers l’avant.

Après un maximum de 15 minutes, transférez les tissus disséqués dans un tube de 1,5 millilitre pour la fixation et placez-les sur de la glace. Retirez le PBS et ajoutez 800 microlitres de solution fixe. Incuber sur un mélangeur de paillasse pendant 30 minutes avec d’autres tissus précédemment collectés dans les tissus fixateurs.

Rincez les mouchoirs une fois avec 800 microlitres de PBTT et gardez le tube sur de la glace pendant que des mouchoirs supplémentaires sont prélevés et fixés. Regroupez tous les tissus disséqués dans un seul tube en plastique de 15 millilitres contenant un filet dans le couvercle du tube. Aspirez l’excès de liquide à travers le grillage du couvercle.

Laver avec 10 millilitres de PBTT et rincer avec 10 millilitres de PBS. Pour éteindre l’activité endogène de la peroxydase de raifort, ajoutez cinq millilitres de peroxyde d’hydrogène à 0,3 % dans du PBS et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Laver deux fois avec 10 millilitres de PBTT.

Perméabiliser les tissus en ajoutant 10 millilitres d’acétone à 80 % pré-refroidis et en incubant à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes. Lavez deux fois avec 10 millilitres de PBTT pour réhydrater les tissus. Après avoir lavé les mouchoirs comme décrit dans le protocole de texte, conservez-les dans une solution d’hybridation à moins 20 degrés Celsius.

S’il n’est pas utilisé le lendemain, l’ensemble de filtre doit être remplacé par un capuchon ordinaire. Aliquote d’environ 20 microlitres par puits de tissus dans une plaque PCR de 96 puits sur glace. À l’aide d’une pipette collecteur à huit canaux, prélever la solution d’hybridation des tissus.

Ajoutez 100 microlitres de solution d’hybridation fraîchement dénaturée dans chaque puits et couvrez avec du ruban d’étanchéité. Pré-hybrider les tissus à 56 degrés Celsius à l’aide d’un appareil de chauffage à bain sec contenant des billes de métal pendant au moins 2 1/2 à trois heures. Dénaturez 100 microlitres de la sonde préparée dans une plaque PCR de 96 puits à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Refroidir immédiatement sur de la glace pendant cinq minutes. Retirer la solution de pré-hybridation des tissus et ajouter des sondes spécifiques aux gènes dénaturés à chaque échantillon. Couvrir d’un ruban d’étanchéité en aluminium et hybrider à 56 degrés Celsius sous des billes métalliques dans une unité de chauffage à bain sec pendant 16 à 18 heures pendant la nuit.

Avant de commencer la procédure de détection de la sonde, préchauffez toutes les solutions requises dans l’unité de chauffage à 56 degrés Celsius. Transférez soigneusement les tissus hybridés dans une plaque de 96 puits qui s’adapte à un collecteur à vide à plaques multipuits. Les puits de ces plaques ont des fonds membranaires qui permettent d’évacuer le contenu sous vide.

Retirer les sondes de la plaque à 96 puits et laver les échantillons avec des mélanges de solution d’hybridation et de PBTT selon les étapes indiquées dans ce tableau dans l’unité de chauffage à 56 degrés Celsius. Après le troisième lavage avec du PBTT, retirez la plaque à 96 puits de l’unité de chauffage, retirez la solution de PBTT et bloquez les mouchoirs avec du PBTTB sur un mélangeur de paillasse à température ambiante pendant 20 minutes. Ajoutez 100 microlitres de solution d’anticorps par puits et incubez pendant deux heures sur le mélangeur d’échantillons de paillasse.

Après avoir rincé avec du PBTTB comme décrit dans le protocole de texte, ajoutez 100 microlitres de solution de peroxydase de raifort Streptavidin par puits et incubez à température ambiante pendant 1 heure et demie. Lavez deux fois avec du PBTTB pendant cinq minutes par lavage. Après cela, incubez les tissus avec la solution DAPI comme décrit dans le protocole texte.

Commencez cette procédure en incubant les échantillons avec une solution de Tyramide et incubez les échantillons pendant deux heures sur le mélangeur de paillasse dans l’obscurité. Retirer la solution de tyramide des tissus une fois l’incubation terminée. Après le lavage avec PBT et PBS comme décrit dans le protocole de texte, ajoutez 150 microlitres de support de montage anti-décoloration par puits.

Conservez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour permettre aux tissus de couler au fond du puits ou du tube. Le lendemain, montez les échantillons sur une lame de microscope et scellez-la à l’aide d’une lamelle. Enfin, imagez les échantillons à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Des exemples de résultats obtenus en utilisant cette procédure pour des embryons de drosophile précoces et des embryons de drosophile tardive avec des signaux dans l’amnioserosa, les muscles et le système nerveux central sont présents. Le nom du gène avec lequel la sonde s’est hybridée est affiché dans chaque panneau. Viennent ensuite des exemples de tissus larvaires du troisième stade, de tubules de Malpighian, d’intestin moyen, de glandes salivaires et de muscles.

Enfin, des images représentatives de l’ovaire adulte et des testicules adultes sont présentées. Une fois maîtrisée et si elle est exécutée efficacement, cette technique peut être réalisée en aussi peu que deux jours. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de travailler sur un banc sans RNase avec des pointes, des tubes, des plaques et des solutions sans RNase et d’utiliser des gants.

Si vous travaillez avec un grand nombre d’échantillons ou de sondes, ne vous précipitez pas. Et c’est aussi une bonne idée de trouver des astuces pour ne pas oublier où vous êtes. Lorsque vous suivez cette procédure, vous pouvez également la combiner avec d’autres méthodes telles que la détection de plusieurs sondes, de sondes avec des protéines ou des marqueurs cellulaires.

Grâce à ceux-ci, vous pouvez répondre à des questions supplémentaires telles que les modèles d’expression relatifs, les identités des compartiments cellulaires et subcellulaires et les effets dans différents contextes génétiques ou maladies. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser la plupart des types d’hybridation in situ dans n’importe quel type de tissu ou d’embryon. N’oubliez pas que travailler avec des réactifs comme le formaldéhyde, le peroxyde d’hydrogène et le formamide peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que la manipulation et l’élimination appropriées doivent toujours être prises lors de l’exécution de la procédure.