Name: Hybridation fluorescente In Situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’Amplification de Signal Tyramide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Apprenez l'hybridation fluorescente in situ haute résolution dans des embryons et tissus de Drosophila par amplification de signal tyramide. Cette méthode permet une détection d'ARN sensible et peu coûteuse.

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Soutien pour ce projet a été financé par une subvention de HMK par les instituts de recherche en santé (subvention 133473 MOP).

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li>
<li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li>
<li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
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<li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li>
<li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilk%2C+R+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22">Current Protocols Essential Laboratory Techniques</a>. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).</li>
<li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li>
<li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li>
<li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li>
</ol>

Auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Le protocole décrit fournit une méthode hautement reproductible, sensible et économique pour la détection d’ARN la plupart dans des embryons de drosophile fixe ou les tissus. Bien qu’un peu plus compliqué que plus traditionnellement utilisé de méthode de phosphatase alcaline de détection de la sonde, la résolution obtenue par les poissons est beaucoup plus grande et la sensibilité est comparable ou meilleure 7,8. En utilisant tout ou partie des microplaques, les protocoles peuvent être utilisés pour des analyses à grande échelle ou limités de gènes d’intérêt. Il est à noter que les sondes générées peuvent détecter tous ou plusieurs épissure de transcription fait à moins que les sondes sont conçus plus spécifiquement (c'est-à-dire, seul exons). Bien que nous avons testé aussi petits que 200 nucléotides avec un succès raisonnable des sondes, sondes plus petites ont tendance à être moins efficace et peuvent être moins précis. De toute évidence, ce protocole n’est pas approprié pour la détection de petits introns, exons, ni transformées microARN.
Bien que cette approche utilise une étape enzymatique pour booster la force des signaux, intensité du signal semble être proportionnel à l’expression des gènes cible dans une gamme relativement large et linéaire des niveaux d’expression. Un grossissement plus élevé, le signal est considéré comme punctums ou mouchetures dans les cellules et les tissus. Relativement rares transcriptions seulement quelques examen minuscules sont considérés. Comme transcription abondance augmente, celles-ci croissent en nombre et en taille. Comme avec molécules simples poissons (smFISH), seul petit examen peut également correspondre à RNAs unique et doit également être facilement quantifiée à l’aide de logiciels d’imagerie et d’informatique. Comparaisons d’images publiées obtenues à l’aide de smFISH avec les images que nous avons organisée pour les mêmes objectifs suggèrent que la globalement, la sensibilité et la résolution des deux méthodes sont relativement similaires, même si cela doit être testé par des comparaisons plus rigoureuses. Compte tenu de la dépense beaucoup plus élevée de smFISH, la méthode proposée ici devrait donner des résultats similaires à une fraction du coût. Toutefois, si l’objectif est de détecter les petites transcriptions, ou des parties distinctes de transcriptions, smFISH est recommandé.
En raison de la petite taille de certaines sondes FISH, cette méthode peut également être meilleure en pénétrant les tissus qui sont grandes ou présentent des obstacles importants. Cependant, notre utilisation des niveaux plus élevés de détergent et tissus fixation et perméabilisation des réglages semblent avoir résolu ce problème. Enfin, bien que mis au point pour des tissus de drosophile , les tampons de détergent hautes décrites ici pour tissus disséqués devraient aussi fonctionner pour les tissus ainsi que plupart des autres organismes et des embryons de drosophile .

Nouvelles méthodes de détection de RNA pangénomique tels que RNA-seq ont considérablement élargi notre connaissance de quand et où les gènes sont exprimés, et à quels niveaux1. Cependant, ceux-ci fournissent relativement faible résolution spatiale et temporelle. RNA hybridation in situ permet la distribution spatiale des transcriptions à observer visuellement en tissus fixés, révélant ainsi les détails de localisation cellulaire et subcellulaire2. En utilisant l’hybridation in situ fluorescente (FISH) permet une résolution spatiale encore plus car il permet l’utilisation des techniques de microscopie puissant, comme la feuille confocale et lumière microscopie3. Des marqueurs fluorescents comme DAPI permet également d’établir des relations subcellulaire4. POISSON facilite également l’observation des multiples des ARN et des protéines en même temps que des indications claires des chevauchements au niveau subcellulaire. Réactifs uniques et les étapes requises pour le marquage double se trouvent dans les références suivantes3,5.
Les procédures décrites ici utilisent microplaques 96 puits pour toutes les étapes, y compris la production de modèle de cDNA (PCR sur colonie), production de sonde d’ARN (à l’aide de la transcription de ruissellement dépendante polymérase T7, T3 ou SP6), hybridation in situ , et développement de signal fluorescent. Un nombre suffisant d’embryons ou de tissus est ajouté à chaque puits de la plaque à 96 puits pour permettre une évaluation de la cohérence et de la variabilité. Eh bien, chacun reçoit une sonde différente. Après le développement du signal, des embryons ou des tissus provenant de chaque puits sont rangés sur lames de microscope individuels pour analyse microscopique.
L’utilisation d’amplification de signal tyramide (TSA) pour la détection de la sonde produit des signaux robustes avec une résolution exceptionnelle subcellulaire 5,6,7,8. La localisation subcellulaire des ARN est un mécanisme important de régulation 9 qui semble se produire avec pratiquement tous les ARN 4,10,11. Ces analyses ont également montré que les nombreuses transcriptions qui ne sont pas détectées par RNA-seq sont facilement détectées par poisson 8. L’adaptation de l’hybridation in situ RNA pour plaques 96 puits permet l’analyse de jusqu'à 96 gènes d’intérêt à la fois (plaques plus si supplémentaires sont utilisées), permettant l’analyse des grands ensembles de données. En découpant les plaques en plus petites sections, la méthode est également facilement adaptée aux quelques échantillons. Le protocole fourni est approprié pour l’analyse des distributions de RNA dans la plupart des types de tissus. Bien que non représenté, il est adaptable aux non - tissus dedrosophile ainsi.

<table><tbody><tr><td>15 ml Tubes à centrifuger coniques en polypropylène</td><td>Frogga Bio</td><td>TB15-500</td><td>Certifié sans DNase et RNase</td></tr><tr><td>2x Master Mix PCR avec colorant (Ambiogene)</td><td>Biomart (Canada)</td><td>141106-1K</td><td>Certifié sans DNase et RNase</td></tr><tr><td>50 ml Tubes à centrifuger coniques en polypropylène</td><td>Frogga Bio</td><td>TB50-500</td><td>Certifié DNase et RNase Plaque de filtration à 96 puits sans DNase et RNase</td></tr><tr><td>(1,2 um, PVDF hydrophile membrane</td><td>EMD MILLIPORE</td><td>MSBVS1210</td><td>Utilisé pour retirer le liguid du fond de la plaque avec des tissus flottants</td></tr><tr><td>Plaque PCR à 96 puits (200 &mu ; l)</td><td>Denville</td><td>C18096-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue Acrodisc (0.2 u)</td><td>PALL</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue Acrodisc (0.45 u)</td><td>PALL</td><td>PN4614</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>AXYGEN Plaques de stockage pour test à 96 puits</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P96-450V-C</td><td>Pour stocker les stocks de glycérol bactérien</td></tr><tr><td>AXYGEN Aluminium Joints de plaques</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-PCR-AS-200</td><td>Pour sceller les plaques</td></tr><tr><td>AXYGEN Embouts larges (200 ul)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-T205-WB-C</td><td>Pour transférer des échantillons</td></tr><tr><td>Biotin-SP (espaceur long) Fraction d’IgG Souris monoclonale Anti-digoxine</td><td>Jackson ImmunoResearch Lab</td><td>200062156</td><td>Anticorps primaire pour in situ (conc. de base 1 mg/ml, conc. de travail 2,5 &mu ; g/ml ou dilution 1/400.</td></tr><tr><td>MARQUE Collecteur à 8 canaux (autoclavable)</td><td>BrandTech Scientific Inc.</td><td>704526</td><td>Pour éliminer les liquides du haut des plaques de PCR à 96 puits</td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C1919</td><td>Concentration de stock 34 mg/ml dissous et 0,2 mu ; m filtré à 100 % EtOH (à utiliser comme 1/1000)</td></tr><tr><td>Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA)</td><td>Fait maison Peut</td><td></td><td>être commandé chez Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D2522</td><td>Réactif anti-décoloration dans le milieu de montage</td></tr><tr><td>Digoxigénine-11-uridine-5'-triphosphate</td><td>Roche</td><td>11-209-256-910</td><td></td></tr><tr><td>Cage de collecte d’embryons</td><td>Home Fabriqué</td><td>N/A</td><td>Taille : 75 cm X 75 cm X 75 cm Fabriqué avec du méthacrylate de méthyle</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Eppendorf 5804</td><td>Modèle Eppendorf</td><td>5804</td><td>Centrifugeuse pour plaques à 96 puits sur rotor A-Z-DWP</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Bioshop</td><td>FOR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td></td><td>Bioshop GLY002.4</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.500</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>Stock : 50 mg/ml. Concentration de travail 1 mg/ml dans la solution d’hybridation</td></tr> Lab <tr><td>Armor Beads</td><td>DiaMed</td><td>LAA42370-001</td><td>Unité de chauffage</td></tr><tr><td>de remplissage Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-347</td><td>Mélange d’échantillons</td></tr><tr><td>Mesh - 100 micons</td><td>FlyStuff</td><td>57-103</td><td>Pour la collecte d’embryons</td></tr><tr><td>Mesh - 800 microns</td><td>SEFAR - Nytex</td><td>06-780/53</td><td>Pour attraper les tissus lâches / peut être utilisé pour un tube spécial sur la figure 4.</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>Taille : 22 X 22 mm</td></tr><tr><td>Micro slides, frstd</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Taille : 25 X 75 mm</td></tr><tr><td>Multi-Well Plate Vacuum Manifold</td><td>Pall Corporation</td><td>P/N 5017</td><td>Retirer le liquide du fond de la plaque filtrante à 96 puits</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Bioshop</td><td>PAR070.500</td><td>Fixation</td></tr><tr><td>PCR Machine</td><td>Bio-Rad</td><td>Modèle : DNA Engine PTC-200</td><td>Plaque à 96 puits PCR et dénaturation par sonde</td></tr><tr><td>Solution d’acide picrique</td><td>Sigma-aldrich</td><td>80456</td><td>Pour la fixation tissulaire Solution</td></tr><tr><td>I Chlorure de potassium (KCL)</td><td>Bioshop</td><td>POC308</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle PP pour plaques à 96 puits, 100/caisse</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P-LID-PP</td><td>Couvercle pour le stockage</td></tr><tr><td>des plaques Réservoirs de réactifs jetables Progene (50 ml, stériles)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>825-1-50-5S Manipulation de</td><td>liquides</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium perçable Progene</td><td>UltiDent Scientific</td><td>87-CFILM-AL</td><td>Seal Plaque à 96 puits, sans DNase ni RNase</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2308- 5MG</td><td>Perméabilisation embryonnaire</td></tr><tr><td>RiboLock Inhibiteur de la ribonucléobase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 Unit/ul</td></tr><tr><td>Ribonucléoside triphosphate (NTP) set</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td>Synthèses de sonde d’ARN</td></tr><tr><td>RNase d’eau libre</td><td>GIBCO</td><td>10977015-500ml</td><td>Sythèse de sonde d’ARN</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>Supprimer la contamination RNase</td></tr><tr><td>ADN simple brin des testicules de saumon</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9156</td><td>Pour solution d’hybridation</td></tr><tr><td>Lait écrémé (pouvoir écrémé)</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td>La concentration de travail est de 1 % dans 1 X PBT ou PBTT en tant que réactif bloquant</td></tr><tr><td>Acétate de sodium (NaOAc) 3 M, pH=5,2 (sans RNase)</td><td>Bioshop</td><td>SAA333</td><td>La concentration de travail est de 10 % (v/v) pour la précipitation de l’ADN ou de l’ARN</td></tr><tr><td>SP6 ARN polymérase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td>20 unités/ul</td></tr><tr><td>Grenaille d’acier inoxydable pour bain de sable</td><td>VWR</td><td>13259-274.</td><td>Pour remplir l’unité de chauffage</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope & source lumineuse en col de cygne</td><td>Leica</td><td>Modèle : MZ6</td><td>Dissection et montage tissulaire</td></tr><tr><td>Streptavidine, conjugué de la peroxydase de raifort (HRP)</td><td>Sondes moléculaires</td><td>S911</td><td>Stock d’anticorps secondaires : 1 mg/ml, utiliser une dilution 1/1000 (1 &mu ; g/ml) pour in situ.</td></tr><tr><td>T3 ARN polymérase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td>20 Unité/ul</td></tr><tr><td>T7 ARN polymérase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td>20 unités/ul</td></tr><tr><td>Station d’embouts (10 ul)</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK-S</td><td>Certifié DNase et RNase</td></tr><tr><td>Station d’embouts (200 ul)</td><td>Sorbio</td><td>27770T</td><td>Certifié DNase et RNase</td></tr><tr><td>( 1ml)</td><td>Sorbio</td><td>10200</td><td>Certified Sans DNase ni RNase</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td>La concentration de travail est de 0,3 % dans 1 X PBT pour les tissus in situ</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td>La concentration de travail est de 0,1 % dans 1 X PBT pour l’embryon in situ</td></tr><tr><td>Papier filtre qualitatif Whatman, grade 3</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHA1003917</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td>Preparation</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycérol anti-décoloration</td><td></td><td></td><td>DABCO (1,25 g), Glycérol (35 ml ou v/v 70 %) et 1 X PBS (15 ml, ou v/v 30 %). Gardez l’obscurité et le rock dans une chambre froide. Conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>1 X PBT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS avec 1 ml de Tween 20 (0,1 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS avec 1 ml de Tween 20 (0,1 %) et 3 ml de Triton-X-100 (0,3 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % Lait écrémé dans 1 X PBT</td></tr><tr><td>1 X PBTTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % Lait écrémé dans 1 X PBTT</td></tr></tbody></table>

hybridation fluorescente in situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’amplification de signal tyramide

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Dans nos efforts pour déterminer les modes d’expression et la localisation sous-cellulaire des Drosophila RNAs l’échelle du génome et dans une variété de tissus, nous avons développé de nombreuses modifications et améliorations à notre origine fluorescentes in situ protocole d’hybridation (poisson). Pour faciliter le débit et la rentabilité, toutes les étapes, depuis la génération de la sonde de détection du signal, sont effectuées à l’aide de plaques de Microplaque 96 puits exon. Dioxygénine (DIG)-sondes marquées antisens RNA sont fabriqués à partir de clones d’ADNc ou ADN génomique en tant que modèles. Après fixation du tissu et la perméabilisation, sondes sont hybridées aux transcriptions d’intérêt et ensuite détectés à l’aide d’une succession d’anticorps anti-DIG conjugué à la biotine, streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort (HRP) et conjugué fluorescent tyramide, qui, en présence de la HRP, produit un intermédiaire très réactif qui se lie aux régions denses d’électron des protéines juste à côté. Cette procédure d’amplification et de localisation produit un signal robuste et très localisé qui facilite les deux localisation cellulaire et subcellulaire transcription. Les protocoles fournis ont été optimisées pour produire des signaux très spécifiques dans une variété de tissus et de stades de développement. Les références sont également fournis pour des variations additionnelles qui permettent la détection simultanée de plusieurs transcriptions, ou les transcriptions et les protéines, en même temps.

La figure 6 montre des exemples des résultats obtenus à l’aide de cette procédure. Les top 3 panneaux montrent des exemples de jeunes embryons de drosophile (Figure 6, panneaux A-C), les 3 prochaines panneaux montrent des exemples de la fin des embryons de drosophile avec des signaux dans différents tissus (amnioserosa, muscles et du système nerveux central, respectivement (Figure 6, panneaux D-F). Ensuite sont des exemples de 3e instar des tissus larvaires (Figure 6, panneaux G-J). Panneaux K et L montrent des images représentant des adultes gonades (ovaires et les testicules, respectivement). Des centaines d’images ont été téléchargées et annotés dans notre consultable « fluorescent in situ drosophile database » (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
La figure 1. Contour de Fluorescent in situ hybridation (poisson) protocole clé matériel et. (A) amplification par PCR de l’ADNc. (B) In vitro la transcription pour générer DIG antisens gène-spécifique - étiqueté des sondes d’ARN dans une plaque à 96 puits (photo de la plaque figure b). (C) et (D) : adultes (femelles : ratio mâles 2:1. 300-400 mouches/bottle) mouches sont autorisés à s’accoupler pendant 3-4 jours. Embryons provenant d’une collection au jour le jour sur la nourriture de la semoule de maïs standard à 25 ° C sont transférés dans une boîte en plastique bien ventilée (1 L de nourriture de la semoule de maïs dans un récipient de taille : 8 "X 8" X 3" LWH) ou de nouvelles bouteilles en gardant une bonne densité larvaire. Pour la collection de tissus, poudre de levure active devrait être saupoudré sur le dessus de la nourriture à 24, 48 h après la ponte (AEL). (E à H) : Expériences d’hybridation fluorescente in situ effectuées sur 3 jours consécutifs. Pour les tissus qui ne pas flotter ou embryons, utilisez une plaque à 96 puits PCR comme sur la photo b avec dispositif d’aspiration 8 canaux (photo c). Pour les tissus qui flottent, comme la plupart des tissus larvaires, utilisez une plaque de fond de filtre (photo d) et évacuer le liquide de fond avec un aspirateur collecteur à l’aide de basse pression (photographie en e). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
Figure 2. Calcul du rendement de sonde de RNA. Nouvellement synthétisé sondes antisens RNA observées sur un gel d’agarose de 1 % (5 µL/lane). Le rendement peut être catégorisé (basé sur l’intensité de la bande) comme « faible rendement » dans les couloirs 3 et 10, « rendement typique » dans les couloirs 1, 4, 5, 6 et 8 ou « high yield » dans les couloirs, 2, 7, 9, 11 et 12. Pour les échantillons avec des « rendements typiques », utiliser 10-15 µL de sonde dilué dans 100 µL de solution d’hybridation pour chaque expérience in situ . Diluer les échantillons avec « des rendements élevés » de sonde avec la solution d’hybridation supplémentaires selon l’intensité de la bande par rapport à une intensité de « sonde typique ». But est d’avoir des concentrations plus ou moins égale de la sonde dans chaque puits. La flèche pointe vers un des « sondes d’ARN », la bande supérieure sur chaque voie est la matrice d’ADN initiale. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
Figure 3. Principales étapes pour la collecte des embryons à grande échelle et fixation. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
Figure 4. Maison tube pour enlever le liquide des tissus larvaires ou flottantes. Certains tissus larvaires et adultes flottent dans la solution pendant la fixation. Cet outil simple se compose d’une maille en nylon qui s’est tenue par un 200 µL, couper la pointe, suivie d’une pointe de 1 mL comme un adaptateur pour raccordement à un aspirateur. Liquide peut être retiré en toute sécurité sans perdre n’importe quel tissu. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
Figure 5. Amplification du Signal de Tyramide. (1) creuser-étiqueté de sonde d’ARN antisens s’hybride avec sens endogène RNA. (2) Immuno-affinité entre anticorps primaire conjugué Biotine et DIG-UTP. (3) HRP conjugué streptavidine biotine de lie. (4) HRP catalyse la réaction de cyanine 3-tyramide et peroxyde d’hydrogène pour former des radicaux éphémère cyanine 3-tyramide. (5) radicaux de cyanine 3-tyramide lient à des résidus de tyrosine des protéines à proximité. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
La figure 6. Des images représentant in situ hybridation. Chaque panneau présente un exemple d’un ARN différent (montré en Cyan) et noyaux colorés au DAPI (indiqué en rouge). (A-C) Exemples de jeunes embryons de drosophile . (D, F) Exemples d’embryons de drosophile tardive. (G-J) Exemples de 3ème stade larvaire des tissus larvaires de drosophile (tubules malphigian, intestin, glandes salivaires et muscle respectivement). (K) ovaire adulte. (L) testicule adulte. Chaque panneau affiche le nom du gène qui la sonde est hybridant à. Barreaux de l’échelle = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Le protocole d’ARN décrit in situ hybridation permet la détection de l’ARN dans des embryons de drosophile entiers ou tissus disséqués. À l’aide de microplaques 96 puits et amplification de signal tyramide, transcriptions peuvent être détectées à un débit, sensibilité et haute résolution et à un coût relativement faible.

Hybridation fluorescente In Situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’Amplification de Signal Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter les transcrits d'ARN in situ au sein des cellules et des tissus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie cellulaire et du développement, telles que l'emplacement précis d'un ARN à l'intérieur d'une cellule, d'un tissu ou d'un embryon. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à détecter les distributions spatiales des ARN avec une résolution et une sensibilité élevées, et ce à un coût réduit par rapport à d'autres méthodes.Nous avons initialement mis au point ce protocole afin d'étudier les distributions subcellulaires d'un nombre aussi élevé que possible d'ARN de Drosophila, dans le but de déterminer l'ampleur et la diversité de ces distributions subcellulaires. Nous avons commencé le projet en travaillant avec des embryons, puis nous avons adapté et optimisé le protocole par la suite afin de pouvoir travailler de manière haut débit avec des tissus disséqués à partir de larves et de mouches.L'aspect le plus difficile de la procédure réside dans le nombre d'étapes et le risque conséquent d'erreur, ainsi que dans la nécessité de s'assurer de l'absence d'ARN lors de la production de la sonde. Pour faciliter le débit et l'efficacité économique, les procédures illustrées dans cette vidéo utilisent des plaques de microtitration à 96 puits pour toutes les étapes. Il est également facile d'adapter cette méthode à un plus petit nombre d'échantillons en découpant les plaques en bandes de huit ou douze puits.Commencez par diluer 10 microlitres d'une culture bactérienne de 24 heures dans 90 microlitres d'eau doublement distillée et stérilisée par autoclavage dans chaque puits d'une nouvelle plaque PCR de 96 puits. Dénaturez l'ADN à 95 degrés Celsius dans un thermocycleur pendant cinq minutes. Placez immédiatement la plaque sur de la glace pendant au moins cinq minutes.Préparer les réactions de PCR dans une nouvelle plaque PCR de 96 puits. Utiliser les amorces universelles appropriées et aliquoter 48 microlitres du mélange maître de PCR dans chaque puit. Ajouter deux microlitres de chaque matrice d'ADN plasmidique dénaturé par puit.Réalisez l'amplification dans un thermocycleur à 96 puits. Une fois l'amplification terminée, précipitez le produit de PCR à l'aide d'un mélange d'éthanol et d'acétate de sodium. Conservez les échantillons pendant 30 minutes à moins 80 degrés Celsius.Centrifuger la plaque de 96 puits à 2 250 ×g à quatre degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes. À l’aide d’une pipette à vide à huit canaux dont la structure empêche les embouts d’atteindre le fond des puits lors de l’aspiration des culots, retirer soigneusement le surnageant. Laver une fois avec 160 microlitres d’éthanol à 70 % froid.Centrifuger à 2 250 ×g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retourner délicatement la plaque de 96 puits sur une serviette en papier afin d’éliminer les dernières gouttes de liquide de chaque puits et sécher à l’air les culots d’ADN à température ambiante pendant une heure. Redisperser l’ADN précipité dans 25 microlitres d’eau exempte de RNase.Vérifiez la taille et le rendement des produits de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose. Préparez les réactions de transcription in vitro en ajoutant les composants appropriés dans chaque puits d'une nouvelle plaque PCR de 96 puits. Ajoutez 7,5 µL de matrice d'ADN dans chaque puits correspondant.Couvrez la plaque avec du ruban scellant. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 3 heures et demie à quatre heures. Ensuite, ajoutez dans chaque puits un mélange maître composé d'eau doublement distillée traitée au DEPC, d'éthanol à 100 % et d'acétate de sodium à trois molaire.Conserver à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Centrifuger la plaque et laver les puits comme indiqué précédemment. Resuspendre la sonde précipitée dans 25 microlitres d'eau doublement distillée traitée au DEPC.Les sondes d'ARN antisens nouvellement synthétisées ont été analysées sur un gel d'agarose à 1 % afin de vérifier leur intégrité et leur rendement. En fonction de l'intensité de la bande, le rendement peut être qualifié de faible, typique ou élevé. Après avoir utilisé cinq microlitres de chaque sonde pour l'électrophorèse sur gel d'agarose, mélanger les 20 microlitres restants avec 100 microlitres de solution d'hybridation et conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation.Pour commencer cette procédure, placer 20 à 30 larves dans une boîte de Pétri contenant du PBS froid dans une solution de fixation et refroidir sur de la glace pendant deux minutes afin de réduire la motilité des larves. Dissecter les larves sous un microscope stéréo. Utiliser une paire de pinces fines pour ouvrir délicatement la partie antérieure et expulser les tissus de la partie postérieure vers l'avant.Après un maximum de 15 minutes, transférez les tissus disséqués dans un tube de 1,5 millilitre pour la fixation et placez-les sur de la glace. Éliminez le PBS et ajoutez 800 microlitres de solution de fixation 1. Incubez sur un agitateur à température ambiante pendant 30 minutes, en parallèle avec les autres tissus prélevés précédemment et en cours de fixation.Rincez les tissus une fois avec 800 microlitres de PBTT et maintenez le tube sur de la glace pendant que d'autres tissus sont collectés et fixés. Regroupez tous les tissus disséqués dans un seul tube en plastique de 15 millilitres contenant un tamis dans le couvercle. Aspirez le liquide excédentaire à travers le tamis du couvercle.Lavez avec 10 millilitres de PBTT et rincez avec 10 millilitres de PBS. Pour bloquer l'activité de la peroxydase de raifort endogène, ajoutez 5 millilitres de peroxyde d'hydrogène à 0,3 % dans du PBS et incubez 15 minutes à température ambiante. Lavez deux fois avec 10 millilitres de PBTT.Perméabilisez les tissus en ajoutant 10 millilitres d'acétone à 80 % prérefroidie et en incubant à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes. Effectuez deux lavages avec 10 millilitres de PBTT pour réhydrater les tissus. Après avoir lavé les tissus comme décrit dans le protocole écrit, conservez-les dans la solution d'hybridation à moins 20 degrés Celsius.Si elle n'est pas utilisée le jour suivant, l'assemblage du filtre doit être remplacé par un bouchon ordinaire. Répartir environ 20 microlitres par puits de tissus dans une plaque PCR de 96 puits placée sur de la glace. À l’aide d’une pipette multipuits à huit canaux, éliminer la solution d’hybridation des tissus.Ajouter 100 microlitres de solution d'hybridation fraîchement dénaturée dans chaque puits et recouvrir d'un ruban scellant. Pré-hybridation des tissus à 56 degrés Celsius à l'aide d'un bloc chauffant sec contenant des billes métalliques pendant un minimum de 2 heures et demie à trois heures. Dénaturer 100 microlitres de la sonde préparée dans une plaque PCR de 96 puits à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes.Refroidir immédiatement sur de la glace pendant cinq minutes. Retirer la solution de pré-hybridation des tissus et ajouter les sondes spécifiques au gène, dénaturées, à chaque échantillon. Recouvrir avec du ruban adhésif en aluminium et procéder à l'hybridation à 56 degrés Celsius sous billes métalliques dans un bain sec chauffant pendant 16 à 18 heures, toute la nuit.Avant de commencer la procédure de détection de la sonde, préchauffer toutes les solutions nécessaires dans l'unité chauffante à 56 degrés Celsius. Transférer délicatement les tissus hybridés dans une plaque à 96 puits adaptée à un système sous vide pour plaque multi-puits. Les puits de ces plaques possèdent un fond en membrane qui permet l'élimination du contenu sous vide.Retirez les sondes de la plaque 96 puits et lavez les échantillons avec des mélanges de solution d'hybridation et de PBTT selon les étapes indiquées dans ce tableau, dans l'unité de chauffage à 56 degrés Celsius. Après le troisième lavage avec du PBTT, retirez la plaque 96 puits de l'unité de chauffage, éliminez la solution de PBTT et bloquez les tissus avec du PBTTB sur un agitateur de banc à température ambiante pendant 20 minutes. Ajoutez 100 microlitres de solution d'anticorps par puits et incubez pendant deux heures sur l'agitateur d'échantillons de banc.Après avoir rincé avec du PBTTB comme décrit dans le protocole écrit, ajouter 100 microlitres de solution de streptavidine peroxydase de raifort par puits et incuber à température ambiante pendant 1 heure et demie. Laver deux fois avec du PBTTB pendant cinq minutes par lavage. Ensuite, incuber les tissus avec la solution de DAPI comme décrit dans le protocole écrit.Commencer cette procédure en incubant les échantillons avec la solution de tyramide et les laisser incubater pendant deux heures sur un agitateur à température ambiante à l’abri de la lumière. Retirer la solution de tyramide des tissus une fois l’incubation terminée. Après un lavage avec du PBT et du PBS comme décrit dans le protocole écrit, ajouter 150 microlitres de milieu de montage antifade par puits.Conserver les échantillons à quatre degrés Celsius toute la nuit afin de permettre aux tissus de sédimenter au fond de la cavité ou du tube. Le jour suivant, monter les échantillons sur une lame de microscope et les sceller avec une lamelle. Enfin, acquérir les images des échantillons à l’aide d’un microscope à fluorescence.Des exemples de résultats obtenus à l'aide de cette procédure sont présentés pour des embryons précoces de Drosophila et des embryons tardifs de Drosophila, avec des signaux dans l'amnioséreuse, les muscles et le système nerveux central. Le nom du gène auquel la sonde s'est hybridée est indiqué dans chaque panneau. Suivent des exemples provenant de tissus de larves de troisième stade, des tubules de Malpighi, du tube digestif moyen, de la glande salivaire et du muscle.Enfin, des images représentatives d'ovaire adulte et de testicules adultes sont présentées. Une fois maîtrisée et si elle est réalisée efficacement, cette technique peut être effectuée en aussi peu que deux jours. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler sur un banc exempt de RNase, en utilisant des pointes, des tubes, des plaques et des solutions sans RNase, et de porter des gants.Si vous travaillez avec un grand nombre d'échantillons ou de sondes, ne vous précipitez pas pendant la procédure. Il est également conseillé d'élaborer des astuces pour ne pas oublier à quelle étape vous vous trouvez. Lorsque vous suivez cette procédure, vous pouvez l'associer à d'autres méthodes, comme la détection de plusieurs sondes, de sondes avec des protéines ou de marqueurs cellulaires.Grâce à celles-ci, vous pouvez répondre à des questions supplémentaires, telles que les profils d'expression relatifs, les identités cellulaires et des compartiments subcellulaires, ainsi que les effets dans différents contextes génétiques ou maladies. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer la plupart des types d'hybridation in situ dans tout type de tissu ou d'embryon. N'oubliez pas que l'utilisation de réactifs comme le formaldéhyde, le peroxyde d'hydrogène et la formamide peut présenter des risques extrêmement élevés, et que des précautions telles qu'une manipulation et une élimination appropriées doivent toujours être prises lors de la réalisation de la procédure.

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Hybridation fluorescente In Situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’Amplification de Signal Tyramide (Vidéo) | JoVE Journal

Hybridation fluorescente In Situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’Amplification de Signal Tyramide

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