Name: Microscopie intravitale de Monocyte Homing et axés sur la tumeur de l’angiogenèse dans un modèle murin de la maladie artérielle périphérique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Découvrez la microscopie intravitale pour visualiser le recrutement des monocytes et l'angiogenèse tumorale dans un modèle murin de maladie artérielle périphérique. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes vasculaires en temps réel.

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Ce travail a été soutenu par la ELSE-Kröner-Stiftung et le SFB DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fondation de recherche allemande) 854 (Sonderforschungsbereich, centre de recherche en collaboration). Merci à Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Université Otto-von-Guericke de Magdeburg, Magdebourg (Allemagne), pour le support technique.

notre étude a été réalisée avec l’autorisation de l’Etat de Saxe-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, conformément à l’article 8 de la loi allemande de protection des animaux. (§ 8, paragraphe 1 de la loi allemande de protection des animaux de 18.05.2016 - BGBI. I s. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV de 13.08.2013).
 Remarque : pour les expériences ici, 8 à 12 semaine vieux BALB/c les souris mâles ont été utilisés, et des monocytes humains provenant de donneurs de sang ont été utilisés pour la visualisation des monocytes par microscopie intravitale.
 1. préparation de cellules Remarque : pour l’isolement des monocytes, veuillez consulter notre précédente vidéo publié sur JoVE pour obtenir des instructions : &#34; isolement et Injection intraveineuse de murin moelle osseuse dérivés Monocytes &#34; par Wagner et al. 4 Remarque : quand travailler avec les cellules de toutes les mesures doit être stérile pour éviter toute contamination.
<ol><li>Cellule coloration avec 3,3 &#39;-Perchlorate de Dioctadecyloxacarbocyanine <ol><li>remettre en suspension les cellules dans le milieu de culture sans sérum avec une densité de 1 x 10 6 cellules/mL. 
		NOTE : Seulement un milieu sans sérum permet une coloration efficace, car le colorant lipophile serait par ailleurs déjà saisis par les composants lipophiles du sérum.</li>
		<li>Ajouter 5 µL de 1 mM 3,3 &#39;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate dans le diméthylformamide à 1 mL de la suspension cellulaire et resuspendre soigneusement.</li>
		<li>Incuber la solution de cellules à 37 ° C pendant 20 min.</li>
		<li>Centrifuger les cellules à 37 ° C et 500 g pendant 5 min.</li>
		<li>Déloger le surnageant et remettre en suspension les cellules avec milieu de complétée de sérum foetal de veau tiède 37 ° C.</li>
		<li>Répéter deux fois les mesures 1.1.4 et 1.1.5.</li>
		<li>Compter les cellules avec la formule : 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq1.jpg" /></li> <li>remettre en suspension les cellules avec la solution de NaCl 0,9 % stérile 150 µL.</li>
		<li>Les cellules d’injecter dans la veine caudale.</li>
	</ol></li></ol> 2. Anesthésie <ol><li><ol>de l' Anesthésie par Inhalation <li>vaporiser isoflurane avec l’aide d’un vaporisateur utilisant une concentration de 5 % dans un bac fermé sous une hotte de sécurité chimique.</li>
		<li>Manipuler la souris avec précaution et placez-le dans le bac.</li>
		<li>Gérer l’animal par la peau du cou postérieur après qu’il a cessé de se déplaçant.</li>
	</ol></li> <li>Anesthésie intrapéritonéale Remarque : l’anesthésie isoflurane utilisation, décrit dans l’étape 2.1, pour réaliser une injection intrapéritonéale. Avec la récupération rapide et de courte durée d’action effet narcotique de l’anesthésie à l’isoflurane, il est plus facile à manipuler la souris et injecter l’anesthésie intrapéritonéale.
	<ol><li>Utiliser une solution de 2,4 mL kétamine (10 %), 0,8 mL Xylazine (2 %) et 6,8 mL NaCl (0,9 %) pour l’injection intrapéritonéale.</li>
		<li>Peser l’animal avant d’appliquer l’anesthésique. 
		Remarque : La formule de l’anesthésique est : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq2.jpg" /></li> <li>utiliser une seringue à insuline 1 mL avec une aiguille de 30 G pour injecter la solution dans le ventre gauche.</li>
		<li>Placer la souris dans sa cage et attendre pour effet narcotique. 
		NOTE : L’effet narcotique apparaît normalement dans 5 min si l’injection a été un succès. La profondeur de l’anesthésie peut être déterminée en l’absence du réflexe de couvercle ou réaction au pincement de l’orteil, ainsi qu’un taux régulier et contrôlé de la respiration.</li>
	</ol></li></ol> 3. Implantation de Membrane basale comme matrice Remarque : cette méthode est utilisée par notre groupe pour étudier l’angiogenèse tumorale après injection de monocytes. Selon les expériences, facteurs de croissance peut être ajoutés à la matrice de la membrane basale-like. Nous avons effectué la ligature de l’artère fémorale avant d’injecter la tumeur dans le flanc de la souris. La matrice doit avoir une température de 4 ° C pendant l’injection. À cette température, la matrice est fluide ; le gel durcit en solide à la température corporelle (37 ° C). Pour une meilleure visibilité de la matrice sous-cutanée de bougie, raser la peau de la souris au point d’injection.
 Remarque : facultatif : ajouter 100 ng facteur de croissance basique des fibroblastes, facteur de croissance endothélial vasculaire ng 300 et 26 UI héparine, dans des conditions stériles à la matrice de la membrane basale comme.
<ol><li>Charger 1 mL de matrice dans une seringue à insuline 30 G et un magasin sur la glace jusqu'à utilisation.</li>
	<li>Mettre l’animal sur la table et maintenir la peau de la souris à côté du site d’injection sur le flanc.</li>
	<li>Injecter par voie sous-cutanée de 500 µL de la matrice de la membrane basale-comme. 
	Remarque : Pour des raisons pratiques, il est nécessaire d’injecter la matrice comme membrane basale compacte en un seul endroit pour éviter la dispersion sous-cutanée. Il sera plus facile de déloger la tumeur artificielle du tissu après avoir sacrifié la souris à la fin de l’expérience.</li>
</ol> 4. Injection de la veine de queue Remarque : pratiquer l’injection dans la veine queue avec une solution de NaCl sur animaux de laboratoire avant l’expérimentation. Si les monocytes ne peuvent pas être adéquatement injectés dans la veine caudale, il n’y aura aucun effet systémique sur le nantissement. Dans ce protocole, nous avons injecté 2,5 millions des monocytes. Essayez d’injecter pas plus de 5 µL/g de poids corporel.
<ol><li>Utiliser la solution de monocyte préparée sous étape 1.1.8 contenant 2,5 millions de monocytes.</li>
	<li>Utiliser une aiguille de 30 G et une seringue de 1 mL insuline pour l’injection.</li>
	<li>Soigneusement gérer la souris, immobiliser l’animal dans la drisse et assurez-vous que la souris n’est pas mal et a suffisamment d’espace pour respirer.</li>
	<li>a la drisse sur le coussin chauffant afin que la queue peut communiquer avec la plaque.</li>
	<li>Identifier les veines de la queue, qui sont situés sur le côté latéral de la queue.</li>
	<li>Tourner la queue de 90 °, jusqu'à ce que la veine caudale apparaît sur la face supérieure de la queue.</li>
	<li>Désinfecter la partie injection avant d’injecter les monocytes.</li>
	<li>Essayer d’injecter la solution de monocytes dans un angle plat avec le biseau de l’aiguille face vers le haut 
	NOTE : Si une cloque apparaît, arrêter l’injection puisqu’il s’agit d’un signe d’une injection défaillant. Essayez la procédure encore plus proximalement.</li>
	<li>Arrêter le saignement au site d’injection en appliquant une légère pression sur la queue pendant environ 60 s.</li>
	<li>Observer l’animal pendant 30 min à surveiller les effets secondaires systémiques et placer la souris dans sa cage après que l’animal a entièrement récupéré.</li>
</ol> 5. La microscopie intravitale <ol><li>préparation <ol><li>Placer la souris anesthésiée sur le pad de la chaleur (37 ° C) pour garder une température constante et fixer les pattes en place avec du ruban adhésif.</li>
		<li>Désinfecter la peau à l’endroit de la jambe ou le flanc qui est utilisé pour la microscopie.</li>
		<li>Raser la région d’intérêt pour une meilleure manipulation et pour éviter toute interférence avec les cheveux.</li>
		<li>Exciser la peau avec un scalpel stérile et des pinces fines dans une zone carrée de 0,5 x 0,5 cm. 
		Remarque : Il est important de garder la région d’intérêt humide ; dans le cas contraire, la qualité des images et des tissus sera compromise. Solution NaCl peut être utilisée pour humidifier le domaine.</li>
		<li>Placer la jambe entre deux timbres réglables et un couvercle en verre sur le dessus de ces timbres.</li>
		<li>S’assurer que le tissu est humide et en contact avec le verre.</li>
		<li>Inject 50 µL rhodamine dextran rétrooculaire dans le système veineux pour améliorer la visibilité des vaisseaux.</li>
		<li>Commencer la microscopie et ajustez la position de la jambe si nécessaire.</li>
	</ol></li> <li>Paramètres de microscopie intravitale <ol><li>tourner sur le microscope, ordinateur, interfaces électroniques et les lasers.</li>
		<li>Allumez l’unité de chauffage de la chambre d’incubation et/ou chauffage étape (tampon) et régler la température à 37 ° C.</li>
		<li>Démarrer le logiciel d’acquisition. Si le microscope est équipé d’un scanner à résonant, sélectionnez ce mode de balayage rapide.</li>
		<li>Attendre jusqu'à ce que la température atteigne un niveau constant (35-37 ° C) 
		Remarque : Une température stable est importante pour : (a) la souris, qui, sous anesthésie, ne peut pas contrôler sa température corporelle et dérive de focale (b) d’éviter ou au moins réduire. Cela peut prendre 1 h à plusieurs heures, selon les conditions ambiantes (p. ex., système d’air conditionné et le nombre de sources de chaleur dans la pièce, y compris les personnes). Si l'on utilise des objectifs à immersion, la zone de contact entre la lentille et couvercle en verre (ou tissu) est une source typique de l’instabilité. L’objectif de chauffage avec un radiateur objectif peut aider ; par ailleurs, un microscope avec un système de mise au point automatique est fortement recommandé.</li>
		<li>Sélectionner une lentille de grossissement avec une grande ouverture numérique qui satisfont aux exigences de la résolution de l’expérience (voir la note à la fin de cette section).</li>
		<li>Optimisation des réglages du microscope en ce qui concerne le gain, arrangements de la manche, vitesse de balayage, pixels, volume de profondeur, taille du pas et en moyenne avant de placer l’animal expérimental sur la scène.</li>
		<li>Scan pour réduire le temps d’acquisition de manière bidirectionnelle.</li>
		<li>Placer la souris anesthésiée sur la platine du microscope préchauffées après le microscope a atteint des conditions stables et les paramètres ont été testés à l’aide d’un mannequin.</li>
		<li>Donner la région d’intérêt au sein de la matrice de la membrane basale-comme le focus à l’aide de lumière éclairage et inspecter brièvement les capillaires par rayons ultraviolets avec des paramètres de filtre adéquat pour les fluorophores appliquées.</li>
		<li>Passer au mode ; balayage lancer la numérisation en mode basse résolution 256 x 256 et améliorer le gain et puissance de laser jusqu'à ce qu’un signal est observé sur le moniteur.</li>
		<li>Focus sur la structure d’intérêt. Effectuez un zoom avant jusqu'à ce que tous les détails sont visibles.</li>
		<li>Définir &#34; lancer &#34; et &#34; fin &#34; positions dans le sens axial.</li>
		<li>Arrêter le balayage.</li>
		<li>Définir pas à pas (par exemple, 0,5 µm) et nombre de plans focaux (p. ex., 10-20).</li>
		<li>Commutateur au pixel final de résolution (512 x 512 ou 1 024 x 1 024) selon la vitesse de déplacement des structures subcellulaires ou cellules et sélectionnez l’analyse vitesse (fréquence de balayage) qui correspond mieux aux mouvements. Bidirectionnelle à balayage est recommandé pour fixer l’acquisition de cheminées. 
		Remarque : Sélectionnez le plus haut taux de balayage de balayage qui donne une qualité d’image suffisante. Point typique scanners offrent des vitesses comprises entre 400 Hz et 1,4 kHz. Résonance scanners offrent une supplémentaire 8 ou 12 kHz. En réduisant le nombre de lignes dans la direction y, la vitesse de balayage peut être encore augmentée (valeurs typiques sont de 512 x 512, 512 x 256 ou 512 x 200 pixels de résolution). Selon le rapport signal-bruit, on peut tenter d’améliorer la qualité de l’image en ajoutant la ligne en moyenne entre 2 et 4. En général, un cadre de 512 x 200 sans aucun résultat de calcul de la moyenne dans un laps de temps/acquisition de 18 ms en mode bidirectionnel avec un scanner résonance 8 KHz ; avec 512 x 200 et 4 x en moyenne, il ralentit jusqu'à 56 ms par frame.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , 
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<li>Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+induces+vascular+endothelial+growth+factor+production+and+angiogenic+activity+from+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.+1950%29%22%5BJournal%5D)">M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).</li>
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<li>Woodman, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+knockout+mice+show+an+impaired+angiogenic+response+to+exogenous+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli.</a> The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).</li>
<li>Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+bone+marrow+derived+monocytes%3A+a+novel+approach+for+augmentation+of+arteriogenesis+in+a+murine+model+of+femoral+artery+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+translational+research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation.</a> American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).</li>
<li>Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+and+purification+of+mouse+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes.</a> J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).</li>
<li>Berthold, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+monocytes+by+Ficoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Blut%22%5BJournal%5D)">Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation.</a> Blut. 43 (6), 367-371 (1981).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

La méthode décrite ici met en lumière le développement des artères collatérales, le comportement des monocytes dans ces vaisseaux et le processus d’arteriogenesis. Les mesures d’application du présent protocole sont faciles à apprendre et peut être utilisé dans d’autres domaines de la science. Malgré ces avantages, il y a quelques inconvénients. Par exemple, équipement microscopique est tenu d’exécuter les techniques décrites. Obtention de matériel pour une expérience n’est pas viable, il est donc important de collaborer...

Les maladies cardiovasculaires, y compris les maladies coronariennes ou la maladie artérielle périphérique, sont les causes les plus fréquentes de décès dans le monde1. La thérapie cellulaire est une approche prometteuse pour traiter les maladies cardiovasculaires, en particulier pour les personnes qui ne sont pas capable de subir des interventions chirurgicales. Il existe plusieurs approches à utiliser des cellules ou leurs substances sécrétées comme un outil thérapeutique2,3, dans le but d’améliorer la perfusion et de maintenir la fonction du tissu ischémique et y. Une tentative pour atteindre cet objectif est d’améliorer les arteriogenesis, qui favorise le développement des artères collatérales. Les monocytes sont un type de cellules importantes associé de nantissement. Notre groupe a mis l’accent sur la recherche sur les effets des monocytes dans les zones d’inflammation4,5, en particulier en utilisant le modèle d’ischémie du membre postérieur pour induire une ischémie et inflammation subséquente6. Monocytes abritent des zones d’inflammation et causent des réactions systémiques complexes qui conduisent à l’élaboration de collatéralisation7.
Avec l’utilisation de la microscopie intravitale, nous pouvons étudier le comportement de ces cellules en vivo et observer le homing des monocytes injectées aux zones d’inflammation. La plupart des études anciennes décrivent seulement les analyses post-mortem , qui détiennent les inconvénients, y compris une introduction d’artefacts histologiques et un grand nombre d’animaux requis pour les préparations. Grâce à notre approche, nous pouvons étudier les processus immunologiques et collatérale formation via live d’imagerie à plusieurs points dans le temps.
Outre le développement des artères collatérales en zones ischémiques, monocytes influencent également la croissance tumorale. Pour étudier ces processus, nous injecter une matrice de type membrane basale extraite du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm, une tumeur riche en protéines de la matrice extracellulaire8et d’analyser à l’aide de la microscopie intravitale. Cette matrice est utilisée pour des molécules de test de l’écran pour formation de réseau cellulaire endothéliale ou anticancéreux par inhibition angiogénique ; dans ce cas, nous évaluerons le potentiel angiogénique de tumeur des monocytes pour cell therapy9,10,11.
Ce protocole vise à démontrer de manière simple et efficace pour étudier les processus immunologiques causées par une ischémie dans un modèle in vivo . Nous pouvons générer un environnement de test plus réaliste par rapport au bilan histologique des post-mortem des tissus musculaires.

<table><tbody><tr><td>10 % de sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine 1 %</td><td>Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml de seringue insuline Omnifix -F</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 50 ml&nbsp ;</td><td>Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Allemagne</td><td></td><td>Seringue injectomate 50 ml avec canule</td></tr> 6 <tr><td>puits à très faible attachement-plaques</td><td>Corning Incorporated, NY, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-12 semaines, mâle, C57BL/6, souris BalbC&nbsp ;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif</td><td>TESA SE, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&nbsp ;</td><td></td><td>Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF) ; Version : 2.7.3.9723</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Allemagne</td><td></td><td>29G, 30G</td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu de culture cellulaire</td><td>Fabriqué par notre groupe avec des composants</td><td></td> uniques <td>Medium199, 10 % Sérum de veau fœtal, 1 % Antibiotique (pénicilline/streptomycine)</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Allemagne</td><td></td><td>Allegra X-15R centrifugeuse</td></tr><tr><td>Crème dépilatoire</td><td>Veet, Mannheim, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>Invitrogen Eugene, Oregon, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agent de désinfection</td><td>Sch&uuml ; lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel jetable n°10</td><td>Rasoir de sûreté en plumes Co.Ltd, Osaka, Japon&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask</td><td>GVB, Herzogenrath, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70 %</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml ; cken, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Rubis, Stabio, Suisse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flurophor/Rhodamindextran</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>Katalognummer : D-1819</td><td></td></tr><tr><td>Gants</td><td>R&ouml ; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant&nbsp ;</td><td>Labotect GmbH, G&ouml ; ttingen, Allemagne&nbsp ;</td><td></td><td>Plaque chaude 062</td></tr><tr><td>Facteur de stimulation des colonies de macrophages humains</td><td>Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne</td><td>SRP3110&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Filtres leucocytaires sans cruauté</td><td>Incubateur de conservation</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>du sang Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&szlig ; heim, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kétamine (10 %)</td><td>Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes de séparation des leucocytes (tubes avec filtre)&nbsp ;</td><td>Bio one GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique&nbsp ;</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Allemagne</td><td></td><td>Axiovert 40 C</td></tr><tr><td>Milieu de séparation des lymphocytes LSM1077</td><td>GE Healthcare, Pasching, Autriche</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium M199&nbsp ;</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Autriche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banc de travail microbiologique</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Allemagne</td><td></td><td>Hera safe Lame de</td></tr><tr><td>microscope</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>Art. Nr. 1879</td><td></td></tr><tr><td>Support de microscope avec incubateur et unité de chauffage</td><td>&nbsp ; Leica DMI 6000, Pecon, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lavage monocytaire</td><td>Fabriqué par notre groupe avec des composants</td><td></td> uniques <td>PBS, 0,5 % BSA, 2mM EDTA</td></tr><tr><td>Souris de retenue</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopes multiphotoniques&nbsp ;</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&nbsp ;</td><td></td><td>Microscope confocal Leica SP5, Cameleon, NaCl cohérent</td></tr><tr><td>(0,9 %)</td><td>Berlin Chemie AG, Berlin, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage Neubauer&nbsp ;</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml ; nigshofen, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&nbsp ;</td><td></td><td>Leica HC PL APO 10x/0.4 CS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Allemagne</td><td></td><td>ph 7,4</td></tr><tr><td>stérile Pénicilline/Streptomycine</td><td>Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fabriqué par notre groupe avec des composants</td><td></td> uniques <td>90 % Percoll, 10 % 1,5M NaCl, &rho ;= 1 064 g cm-3</td></tr><tr><td>Solution Percoll</td><td>GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Suède</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td>10&micro ; L/100&micro ; L/200&micro ; L / 1000 et micro ; L</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td></td><td>&nbsp ; Cellstar2ml, 5ml, 10ml</td></tr><tr><td>Têtes de pipetage</td><td>Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetus</td><td>Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube en polystyrol</td><td>Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Échelle</td><td>Gamme Mettler PM4800 Delta, Mettler-Toledo GmbH, Gie&szlig ; en, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unité d’aspiration</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Allemagne</td><td></td><td>Vacusafe</td></tr><tr><td>comfort Ciseaux chirurgicaux</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution 0,4 %</td><td>Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes avec bouchon</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td></td><td>15ml, 50ml Cellstar</td></tr><tr><td>Xylazine (2 %)</td><td>Ceva Tiergesundheit GmbH, D&uuml ; sseldorf, Allemagne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microscopie intravitale de monocyte homing et axés sur la tumeur de l’angiogenèse dans un modèle murin de la maladie artérielle périphérique

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

L’objectif thérapeutique pour la maladie artérielle périphérique et cardiopathie ischémique est d’augmenter le flux sanguin vers les zones ischémiques causées par une sténose hémodynamique. Chirurgie vasculaire est une option viable dans certains cas précis, mais pour les patients sans indication d’une intervention chirurgicale comme la progression de repos la douleur, une ischémie des membres critiques ou des perturbations majeures à la vie ou de travail, il y a peu de possibilités pour atténuer leur maladie. La thérapie cellulaire par perfusion de monocyte améliorée grâce à la stimulation de la formation collatérale est l’un des quelques options non invasives.
Notre groupe examine arteriogenesis après greffe de monocyte sur des souris en utilisant le modèle d’ischémie du membre postérieur. Auparavant, nous avons démontré amélioration de la perfusion du membre postérieur à l’aide de transplantation de monocyte syngénique stimulée par le tétanos. Outre les effets sur la formation de collatéraux, croissance tumorale pourrait être affectée par cette thérapie ainsi. Afin d’examiner ces effets, nous utilisons un modèle de souris de membrane basale comme matrice en injectant de la matrice extracellulaire de la sarcome Engelbreth-Holm-essaim dans le flanc de la souris, après l’occlusion de l’artère fémorale.
Après les études de tumeur artificiel, nous utilisons la microscopie intravitale pour étudier in vivo -angiogenèse tumorale et monocytes homing dans les artères collatérales. Des études antérieures ont décrit l’examen histologique des modèles animaux, ce qui suppose l’analyse post mortem d’artefacts. Notre approche visualise homing monocyte aux zones de nantissement en temps réel de séquences, est facile à réaliser et étudie le processus d’arteriogenesis et tumeur angiogenèse in vivo.

La microscopie intravitale pour l’examen de la tumeur et la croissance des vaisseaux collatéraux déclenchée par les monocytes peut aider à révéler de nouveaux aspects dans les mécanismes moléculaires de l’angiogenèse tumorale et arteriogenesis. Les cellules doivent être préparés et injecté avec soin en suivant les étapes du protocole. Différences peuvent conduire à des variations entre les expériences simples. Les monocytes doivent être injectés dans le système veineux (<strong class="xfi...

Les monocytes sont des médiateurs importants d’arteriogenesis dans le contexte de la maladie artérielle périphérique. En utilisant une matrice de type membrane basale et la microscopie intravitale, ce protocole étudie monocyte autoguidage et axés sur la tumeur de l’angiogenèse après injection de monocytes dans le modèle murin de la ligature de l’artère fémorale.

Microscopie intravitale de Monocyte Homing et axés sur la tumeur de l’angiogenèse dans un modèle murin de la maladie artérielle périphérique

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Bonjour, je m'appelle Christian Deffge. Je suis médecin à l'hôpital universitaire de Magdebourg et je travaille au sein du groupe de recherche cardiovasculaire du Dr Herold et du Professeur Braun-Dullaeus. Nous étudions l'augmentation de la croissance collatérale.Par conséquent, nous utilisons l'imagerie. Dans cette vidéo, nous souhaitons expliquer nos méthodes. Resuspendre les cellules dans un milieu de culture sans sérum à une densité de un fois dix puissance six cellules par millilitre.Ajoutez cinq microlitres de DIO à une millimolaire dans du diméthylformeamide à un millilitre de la suspension cellulaire et resuspendez délicatement. Incubez la solution cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Centrifugez les cellules à 500 g pendant cinq minutes.Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans un milieu complémenté en FCS réchauffé à 37 degrés Celsius. Répéter cette étape deux fois. Compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage de Neubauer et d’un microscope optique.Resuspendre les cellules avec une solution de chlorure de sodium. Injecter les cellules dans la veine de la queue. La matrice Matrigel est une préparation de membrane basale reconstituée extraite du sarcome épidermoïde.Il permet de tester des molécules en vue de la formation d'un réseau de cellules endothéliales ou de thérapies anticancéreuses par inhibition angiogénique. Réévaluer le potentiel angiogénique tumoral des monocytes que nous cherchons à utiliser pour la thérapie cellulaire. Ajouter 100 nanogrammes de BFGF, 300 nanogrammes de VEGFA et 26 unités internationales d'héparine, en conditions stériles, au Matrigel.Après avoir agité la solution au vortex, remplir une seringue à insuline d’un millilitre et conserver sur glace jusqu’à utilisation. Pour une meilleure visibilité du caillot sous-cutané de Matrigel, raser la peau de la souris au site d’injection. On peut utiliser un scalpel bien aiguisé ou une crème dépilatoire.Placer l'animal sur la table et tenir la peau de la souris près du site d'injection sur le flanc. Injecter 500 microlitres de Matrigel par voie sous-cutanée. Pour des raisons pratiques, il est nécessaire d'injecter le Matrigel de manière compacte en un seul endroit afin d'éviter une dispersion sous-cutanée.Il sera plus facile de détacher la matrice de Matrigel du tissu après avoir sacrifié la souris à la fin de l'expérience. S'entraîner à l'injection de monocytes avec une solution de chlorure de sodium avant l'expérimentation. Si les monocytes ne peuvent pas être administrés par voie systémique, aucun effet systémique ne sera observé.Dans le cadre de ce protocole, nous avons injecté 2,5 millions de monocytes. Essayez d'injecter au maximum cinq microlitres par gramme. Assurez-vous que la souris est maintenue au chaud à l'aide d'un tapis chauffant pendant toute la durée de la procédure.Pour l'application systémique des cellules, vous aurez besoin d'un dispositif de contention, d'une seringue à insuline d'un millilitre, d'une aiguille de 30 g et des monocytes resuspendus dans une solution de chlorure de sodium. Manipulez soigneusement la souris et immobilisez l'animal dans le dispositif de contention. Veillez à ce que la souris ne soit pas blessée et dispose d'un espace suffisant pour respirer.Placer le dispositif de contention sur le coussin chauffant de manière à ce que la queue puisse entrer en contact avec la plaque. S'assurer de désinfecter le site d'injection afin d'éviter toute infection. Identifier les veines de la queue, situées sur le côté latéral de celle-ci.Tournez la queue de 90 degrés afin que la veine caudale se retrouve sur le côté supérieur de la queue. Essayez d'injecter la solution de monocytes selon un angle plat. Observez l'animal pendant 30 minutes afin de rechercher des effets secondaires systémiques.Placer la souris dans sa cage après que l'animal ait complètement récupéré. Placer la souris anesthésiée sur la platine du microscope préchauffée après que le microscope ait atteint des conditions stables et que les paramètres aient été testés à l’aide d’un modèle factice. Fixer les pattes avec du ruban adhésif.Désinfectez la peau au niveau du site de la jambe ou du flanc utilisé pour la microscopie. Rasez la région d'intérêt pour faciliter la manipulation et éviter toute interférence due aux poils. Maintenez la région d'intérêt humide.Sinon, la qualité des images et des tissus sera compromise. Placer la jambe entre deux tiges réglables. Positionner une lame de verre au-dessus des tiges.Démarrer la microscopie et ajuster la position de la patte si nécessaire. Les paramètres du microscope dépendent du logiciel utilisé. Veuillez consulter le protocole pour plus d'informations.Nos données démontrent que la microscopie intravitale représente un outil puissant pour la visualisation de monocytes transplantés dans le flux sanguin chez les petits modèles animaux. Les monocytes doivent être injectés dans le système veineux afin de maintenir des effets systémiques et d'éviter la formation d'embolies, qui peuvent survenir si l'injection est réalisée dans le système artériel. Si du Matrigel est utilisé, une injection lente permettra d'éviter sa dispersion et facilitera l'explantation de la plaque pour un examen histologique ultérieur.Dans la plaque de Matrigel, nous sommes en mesure de mesurer la vascularisation en comptant les capillaires dans différents dispositifs expérimentaux. Les observations réalisées par microscopie intravitale peuvent être confirmées par examen histologique. Nous parvenons à détecter des monocytes, observés par microscopie intravitale, dans toutes les coupes tissulaires.Si un temps important est nécessaire pour l'acquisition des images, la quantité de dextrane-rhodamine dans le vaisseau diminue. Pour une meilleure visibilité des vaisseaux, l'application du dextrane-rhodamine doit être répétée. L'utilisation de sondes positives pour les cellules sur Matrigel peut aider à obtenir des réglages optimaux.L'objectif des thérapies destinées à traiter la maladie artérielle périphérique ou la maladie coronarienne ischémique est d'augmenter le flux sanguin vers d'autres zones perfusées en raison d'une sténose hémodynamique. La thérapie cellulaire par amélioration de la perfusion via les monocytes, grâce à la stimulation de la formation de collatérales, constitue une option non invasive pour les patients ne présentant pas d'indications chirurgicales. En plus de favoriser le développement d'artères collatérales dans les zones ischémiques, les monocytes peuvent également influencer la croissance des tumeurs.Pour étudier ces processus, nous utilisons l'injection de Matrigel associée à la microscopie intravitale. Notre objectif avec ce protocole est de démontrer une méthode simple et efficace pour analyser les processus immunologiques provoqués par une ischémie dans un modèle in vivo. Grâce à cette nouvelle méthode, nous sommes en mesure de créer un environnement expérimental plus réaliste par rapport à l'analyse histologique de tissu musculaire post-mortem.

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Microscopie intravitale à suivre spatiale et temporelle des événements hémodynamiques et inflammatoires dans la microcirculation piales.

Microscopie intravitale de la microcirculation cérébrale souris en utilisant une fenêtre fermée crânienne

Dans cette vidéo, nous démontrons la visualisation en temps réel des interactions cellules sanguines-endothéliales dans les veines mésentériales d’un modèle murin injecté par voie intrapéritonéale avec du lipopolysaccharide.

Microscopie intravitale pour analyser les interactions cellules sanguines-endothéliales dans un modèle murin d’inflammation

Nous rapportons ici une technique expérimentale de la microscopie de fluorescence intravitale de visualiser hétérotypiques plaquettes neutrophiles interactions sur l'endothélium activé lors de l'inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes. Cette technologie microscopique seront très utiles pour étudier le mécanisme moléculaire de la maladie vasculaire et de tester des agents pharmacologiques dans des conditions physiopathologiques.

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

En utilisant des souris rapporteures transgéniques et des marqueurs fluorescents injectables, la microscopie confocale à disque rotatif intravital à long terme permet de visualiser directement le comportement des cellules myéloïdes dans l’adénome intestinal dans le modèle de cancer colorectal ApcMin/+.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique Apc Min / + Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Cette application simplifiée de la microscopie intravitale des veines du mésentère chez la souris peut être utilisée dans différents modèles d’inflammation pour observer les interactions leucocytes-endothéliales et plaquettes-leucocytes.

Interactions Microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Ce protocole décrit l’imagerie intravitale des souris transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents spécifiques des cellules. Intravitale imagerie fournit une méthode non invasive pour les observations à haute résolution dans les animaux vivants à l’aide de windows implantables permettant la visualisation microscopique des processus est possible. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les processus longitudinales.

La microscopie intravitale du système vasculaire associées à la tumeur en utilisant Advanced dorsale pli fenêtre Chambers sur des souris transgéniques fluorescents

Ce manuscrit décrit l’utilisation de souris transgéniques journaliste et itinéraires différents administration des colorants fluorescents en angiotensine II l’hypertension induite par microscopie intravitale vidéo des vaisseaux sanguins pour évaluer l’activation des cellules immunitaires et leur capacité à rouler et à adhérer à l’endothélium.

Visualisation des leucocytes de roulement et l’adhérence à l’angiotensine II infusé souris : Techniques et pièges

Nous décrivons deux méthodes pour évaluer la perméabilité vasculaire transitoire liée au microenvironnement de tumeur de la fonction de porte de métastasie (TMEM) et de l'intravasation de cellules cancéreuses utilisant l'injection intraveineuse du poids moléculaire élevé (155 kDa) dextran chez les souris. Les méthodes incluent l'imagerie intravitale chez les animaux vivants et l'analyse des tissus fixes à l'aide de l'immunofluorescence.

Évaluation du microenvironnement tumoral de la perméabilité vasculaire médiée par la voie de la metastasie associée à la dissémination des cellules cancéreuses à l'aide de l'imagerie intravitale et de l'analyse des tissus fixes

Le recrutement des leucocytes et des plaquettes constitue un composant essentiel nécessaire à la croissance efficace des artères collatérales au cours de l’artériogenèse. La microscopie multiphotonique est un outil efficace pour suivre la dynamique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée in vivo et moins photo-toxicité pour étudier le recrutement et l’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse.

Imagerie intravitale multiphotonique pour la surveillance du recrutement leucocytaire au cours de l’artériogenèse dans un modèle murin de membre postérieur

Le présent protocole décrit un modèle unique et cliniquement pertinent de maladie artérielle périphérique qui combine l’électrocoagulation de l’artère fémorale et des veines avec l’administration d’un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase pour induire la gangrène des membres postérieurs chez les souris FVB. La perfusion intracardiaque DiI est ensuite utilisée pour l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution du système vasculaire du coussinet plantaire.

Imagerie tridimensionnelle haute résolution de la vascularisation du repose-pieds dans un modèle murin de gangrène postérieure

Découvrez la microscopie intravitale pour visualiser le recrutement des monocytes et l'angiogenèse tumorale dans un modèle murin de maladie artérielle périphérique. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes vasculaires en temps réel.

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Microscopie intravitale de Monocyte Homing et axés sur la tumeur de l’angiogenèse dans un modèle murin de la maladie artérielle périphérique

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